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巴斯德在发酵原理、否定自发生成论方面的成就以及巴氏消毒法的发明使他进一步得出结论：疾病也能由致病微生物造成，因此可通过阻断它们进入人体的方式来预防及治疗人类疾病。在具体操作上，巴斯德提议使用过滤、加热或化学药品处理等方法去除致病菌，以此来预防疾病。约瑟夫·李斯特受巴斯德的观点启发，在1867年实施外科手术过程中首次采用了消毒方法——用石炭酸对手术器械和患者伤口进行消毒处理，从而极大地减少了手术后的感染率和死亡率，成为外科手术史上具有里程碑意义的三大发现之一。
养蚕业是法国支柱产业之一，然而在19世纪60年代却遭到蚕病的严重袭击，每年损失上亿法郎，税收的减少使人们进一步被笼罩于贫困和饥饿的阴云之中。1865年，巴斯德受命调查蚕病的发生原因。
巴斯德为此投入了巨大的精力，每天都工作到筋疲力尽。在经历几次失误后，巴斯德最终于1867年底确认蚕病的发生原因：蚕卵受到了微生物的攻击而无法有效孵化。他在此基础上制订出预防策略，如将病蚕集中处理、清理养蚕的环境、重新选用健康的蚕进行养殖等。经过巴斯德等人的努力，蚕病得到有效控制，从而挽救了养蚕业、丝绸业等多个行业。但长期艰苦的科学研究，让巴斯德付出了惨痛的代价，1868年，46岁的他患上严重的脑中风，造成左侧身体瘫痪，但他仍坚持致力于科学研究。
19世纪70年代，法国农村又开始流行可怕的鸡霍乱，大批的鸡因此死亡。1877年，巴斯德决定研究鸡霍乱。他首先对致病细菌进行连续培养，经过一年时间后发现细菌的致病性有所下降。准备度假的巴斯德让助手用这些细菌为鸡及时接种以检测毒性，然而助手却忘了这件事，待一个月后才将过期的细菌接种给鸡，结果这些鸡仅表现出轻度感染症状，却并未死亡。正当助手准备将这些鸡遗弃时，却被巴斯德阻止。巴斯德为这些鸡重新注射了新鲜细菌，正常情况下会很快死亡的鸡却一直健康如初。巴斯德意识到，霍乱弧菌暴露在空气中后毒性减弱了，将这些减弱了毒性的细菌接种给鸡，能使鸡获得对该细菌的免疫力。尽管这一策略在随后鸡霍乱预防中效果有限，却为疫苗研发指明了道路。
