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自发生成论是一种描述生命产生的朴素哲学思想。该理论认为生命可从非生命中直接产生，如跳蚤可由灰尘产生，蛆可由腐烂的肉产生。尽管当时许多科学家对此提出质疑，但仍有部分人相信。巴斯德在研究发酵过程中观察到葡萄皮仅是酵母的存在场所，因此完整的葡萄可以进行发酵，而葡萄皮经过消毒或者去除葡萄皮的果肉则无法发酵，据此巴斯德认为酵母是无法自然生成的——这一看法与鲁昂自然历史博物馆馆长菲利斯·布切特的结论产生强烈冲突。布切特首先用加热的方法杀死水中的生命物质，然后将水静置在空气中一段时间后发现水中有生命存在，他用这个存在众多漏洞的实验来证实自发生成论的成立。1860年1月30日，法国科学院宣布，凡能为自发生成论提供可靠实验证据的人都将获得2500法郎的奖金。
巴斯德决定参加这场比赛，并为此设计了一个非常奇特的装置——鹅颈瓶。顾名思义，它就是一个瓶口长形似鹅颈的瓶子。巴斯德将煮沸后的肉汤（充分灭菌）分盛到干净的普通烧瓶和鹅颈瓶内，将它们放置在空气中，三个月后观察发现，普通烧瓶出现生命迹象，而鹅颈瓶内则没有。这一结果有力证明了生命并非自发生成，而是空气中微生物在适宜环境（如普通烧瓶中的肉汤）中繁殖的结果，因为鹅颈瓶的长颈可使空气中的微生物黏附其上，而无法落进肉汤里。此外，巴斯德还提供了其他证据来否定自发生成论。
鹅颈瓶
1862年，法国科学院认定巴斯德的实验更有说服力，因此将奖金授予了他。经此一“役”，巴斯德在微生物学领域的知名度大大提高。