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1854年，32岁的巴斯德离开斯特拉斯堡，加盟里尔大学，并担任科学院院长，开启了新的研究征程。当地一位葡萄酒制造商的儿子是巴斯德的学生，这位学生告诉了巴斯德一个困扰父亲乃至整个酿酒界的大问题——糖通过发酵产生酒精，但操作失误往往会造成酒精产量过低，有时还有变酸情况发生，人们苦恼于找不到解决这两个问题的良策。巴斯德对此很感兴趣，决定探索发酵背后的奥秘以找到破解工业难题的方法。
巴斯德首先查阅了发酵的相关资料。当时普遍的观点是发酵是糖类物质的简单分解过程，而德国著名细胞生物学家西奥多·施旺则认为发酵是活酵母代谢的结果。巴斯德决定用事实来判断两种理论的正确与否，随后将大量时间花费在观察发酵过程方面。他经过几年的深入研究，最终于1858年得出结论：活酵母负责将糖转换为酒精，从而用事实支持了施旺的观点。巴斯德还发现自然界存在多种类型的酵母，不同的酵母功能各异，如可将牛奶中的糖转变为乳酸的酵母，如果葡萄酒被这种酵母污染，葡萄酒发酵则会产生变酸的后果。1861年，巴斯德又发现，在酿酒过程中若酵母暴露于空气中，则发酵过程会受阻，酒精产量相应降低——后人将氧抑制糖发酵的现象称为巴斯德效应。
巴斯德的这些发现，推动了人们对发酵过程的理解，更推进了法国酿酒工业的发展，葡萄酒产量和品质都得到极大提升。今天，众多国际驰名的法国葡萄酒品牌的背后都有巴斯德的贡献。
1857年，35岁的巴斯德回到巴黎高等师范学院，并被任命为科学研究部主任。巴斯德虽然担任“要职”，但面临重大挑战，那就是既没有实验室可用，又缺乏政府资金支持研究。致力于科研的巴斯德亲自出资，一方面把学校闲置空间改建为实验室，另一方面也方便自己的工作。
巴斯德进一步研究发现，按照微生物对人体产生的效应可将其分为两大类：有益微生物和有害微生物，如酿酒的酵母就属有益的，而啤酒、葡萄酒和牛奶等变质的原因则在于被有害微生物污染。基于这一发现，巴斯德于1862年开发出一种防止液体产品变质的工艺，那就是将它们短暂加热到60℃至100℃之间，就可基本杀死可造成产品变质的有害微生物。这一方法被命名为“巴氏高温消毒法”，尽管后来有一定的改进和完善，但基本原理仍然是巴斯德提出的。
巴氏高温消毒法的发明和应用，无论对工业发展还是人类健康，都具有不可估量的价值。