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1848年，26岁的巴斯德成为斯特拉斯堡大学的化学教授，如愿以偿地实现了毕业时的理想，在高等学校开展研究工作。此时的巴斯德对一种小分子有机物——酒石酸，产生了浓厚兴趣。这种化合物
既可人工合成，又可从生物中分离。当时，研究化合物的光学性质是常规操作。巴斯德从生物中提取了一些酒石酸溶液，当他让光线穿过这些溶液时，却发现光线出现了偏转，这与他在巴黎高等师范学院使用人工合成的酒石酸做的光学实验结果完全不同。巴斯德对此迷惑不解，决定解开这个谜团。他将人工合成的酒石酸进行结晶，在对晶体观察过程中惊奇地发现：存在两种结构有些许差异的晶体，两种相异的结构类似镜像（我们可以将其类比为一只右手、一只左手）；如果将两种晶体分开后单独溶解，则每种溶液都会产生光线偏转，且偏转方向正好相反；如果将两种晶体混合后溶解，则溶液不再产生光线偏转的现象（正好抵消）。巴斯德据此认为，光学活性与晶体形状密切相关，酒石酸存在旋光异构现象——后来科学家进一步将这类现象称为手性异构。手性异构现象在自然界非常普遍，如医院经常使用的D-葡萄糖、构成我们身体的20种L-氨基酸（甘氨酸例外，因为它没有异构体）。
手性酒石酸盐晶体
巴斯德是第一位发现手性异构的科学家。他幸运地遇到酒石酸这种特异分子，仅仅从晶体外形就可以区分手性分子的差异，而绝大多数手性分子需要借助更高级的方法来鉴定。手性异构的发现被化学界看作“最原创和最深刻”的创新，也被当作巴斯德“最伟大的科学发现”，因为它为化学、生物化学和制药领域开辟了一条光明大道，巴斯德也因为这一发现被伦敦皇家学会授予1856年的拉姆福德奖章。从这项发现可以看出，巴斯德是一位伟大的化学家，只是由于他很快转向微生物领域并做出了更大贡献，因此他在化学方面的贡献常常被忽略。