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蛋白质组学研究技术简单分为两类，第一类是蛋白质组的分离技术，如双向凝胶电泳（2DE）、双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）、等点聚焦电泳（IEF）、多维高效液相色谱（MD-HPLC）、蛋白质鉴定-生物质谱技术，等等。第二类是蛋白质组的鉴定技术，主要有传统的Edman降解法分析蛋白质中的氨基酸组成、氨基酸组成成分分析。质谱技术使得蛋白质组的鉴定更加灵敏、准确、高通量、自动化，成为当前蛋白质组学技术的支柱。
双向凝胶电泳（2DE）由史密西斯（Smithies）和波利克（Poulik）在 1956 年发明，在法雷尔（Farrell）改进后，建立起双向凝胶电泳体系。目前实验室常用聚丙烯酰胺制备凝胶，成为双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（two dimensional polyacrylamidegel electrophoresis），其对蛋白的分离原理是：第一向进行等电聚焦，蛋白质沿着pH梯度进行分离，蛋白质迁移至各自的等电点处；第二向，根据各蛋白质的分子量，通过聚丙烯酰胺垂直的方向电泳进行分离。双向电泳技术包括蛋白质样品制备、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS-PAGE电泳等步骤。
样品制备是双向凝胶电泳的第一步，其成功与否是决定双向电泳成败的关键。由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法适用于各种样品，但有几条共同的原则需要遵循：①尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合，使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在；②避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用；③避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用；④考虑蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳是常用的对全蛋白质组的分析方法，但其存在分离能力有限、具歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、丰度低及疏水性蛋白质的研究，往往很难得到满意的结果。
双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）是双向凝胶电泳的一种改进形式，它使人们可以在同一凝胶上同时比较两个或三个蛋白质样品。每个样品中的蛋白质都用不同颜色的荧光染料共价标记，这些染料对电泳过程中蛋白质的相对迁移没有影响。样品共有的蛋白质显示为具有固定荧光信号比率的“斑点”，而样品之间不同的蛋白质具有不同的荧光比率。借助适当的成像系统，双向荧光差异凝胶电泳能够可靠地检测出0.2 fmol的蛋白质，并且在20 000倍的蛋白质浓度范围内，使蛋白质差异低至±15％。因此，差异电泳与数字图像分析相结合大大改善了蛋白质组变异的统计评估。
从生物样本中提取的蛋白质组学样本复杂性很高，仅仅通过普通分离技术无法达到满意的分离效果，多维高效液相色谱（multidimensional HPLC，MD HPLC）应运而生。多维高效液相色谱是通过不同分离原理的液相色谱的串联使用，提高分离系统的峰容量和分辨率，从而实现复杂样品的充分分离。该系统具有快速、高效、自动化程度高，以及容易与质谱等其他技术联用等优势，因此成为蛋白质组学相关分析技术中研究应用的热点。
质谱（mass spectrum，MS）初始仅仅用于小分子挥发物质的分析，随着新的离子化技术的出现，各种新的质谱技术开始应用于生物大分子的研究，例如：①电喷雾电离质谱；②基质辅助激光解吸电离质谱；③快原子轰击质谱；④离子喷雾电离质谱；⑤大气压电离质谱。其基本原理是：先将样品分子离子化，然后根据不同离子的质荷比（mass-to-charge ratio，m/z）差异进行分离并确定蛋白质的相对分子质量。根据蛋白质酶解后得到的肽质量指纹图谱、肽序列标签和肽阶梯序列，可以检索蛋白质数据库或核酸序列数据库。质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有以下优点：灵敏度很高，能为亚微克级试样提供信息；能有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定；具有准确性、易操作性、快速性及普适性。
用于鉴定蛋白质的质谱法主要有3种，即肽质量指纹图谱法、串联质谱法和梯形肽片段测序法。肽质量指纹图谱（PMF）是用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将得到的蛋白酶解肽段质量数在相应数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。近年来，随着蛋白质数据库信息的快速增长和完善，PMF技术已成为蛋白质组研究中较常用的鉴定方法，它在蛋白质组学中最接近高通量。显而易见，分子质量的精准度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能会使PMF的质量数与理论值不符，这就需要与序列信息适当结合。
串联质谱法也称碰撞诱导解离法（CID），是串联质谱法的一个过程，是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括自身碎裂及外界作用诱导碎裂。此外，具有源后衰变功能的质谱也能对肽链测序，但存在部分缺陷。与PMF相比，串联质谱的肽序列图稍稍有些复杂，在鉴定蛋白质时，需要将读出的部分氨基酸序列与其前后的离子质量和肽段母离子质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。
另外一种肽序列质谱测定法是梯形肽片段测序法，该法与Edman降解法有相似之处，是用化学探针或酶解使蛋白质或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，产生包含质量差异仅为 1 个氨基酸残基质量的一系列肽段，因此名为梯形，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差可得知相应氨基酸残基。但由于酶解速度不一，易受干扰，故效果不甚理想。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。
2020年12月，谷歌公司旗下的深思（DeepMind）研发的AlphaFold2人工智能系统在国际蛋白质结构预测竞赛（CASP）上取得了惊人的准确度，多数预测模型与实验测得的蛋白质结构模型高度一致。如今，以“深度学习”技术为代表的人工智能无疑已经高度融入生命科学与技术领域，并且极大地推动了生命科学领域的发展。
蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是一种体外检测相互作用的方法。其基本原理是以蛋白质分子作为配基（探针蛋白），将其有序地固定在固相载体（滴定板、滤膜或玻璃片等）的表面，形成微阵列，然后用带有荧光标记的蛋白质（或其他分子）与之作用，经漂洗将未结合的成分洗去，再经荧光扫描等监测方式，测定芯片上各点的荧光强度，最后，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，达到测定各种蛋白质功能的目的。
酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当诱饵蛋白与猎物蛋白（靶蛋白）特异结合后，诱饵蛋白结合于报告基因的启动子，启动报告基因在酵母细胞内表达，如果检测到报告基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后可用于蛋白质之间相互作用的大规模研究。在实际工作中，人们还根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。最初双杂交系统限于可溶性蛋白质的研究，后来又设计出SOS蛋白介导的双杂交系统等，可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质进行鉴定。
表面等离子共振（SPR）技术是研究蛋白质之间相互作用的新方法。该技术是将诱饵蛋白作为配基，固定在几十纳米厚的金属膜表面，然后加入含目标蛋白（猎物蛋白）的溶液，诱饵蛋白与猎物蛋白相互作用形成的复合物固定在金属膜表面，会使金属膜与溶液之间界面的折射率上升，导致共振角度改变，由此可检测出蛋白质间的相互作用。该技术具备不需标记引物或染料、测定快速且安全等优点。
蛋白质的亚细胞定位受到严格控制，并与健康和疾病状态下的蛋白质功能息息相关。为了识别蛋白质的定位及其在亚细胞水平上的动力学特征，空间蛋白质组技术应运而生，这对于全面了解细胞生物学至关重要。随着显微技术和质谱技术的长足进步、机器学习算法在数据分析中的应用与完善，空间蛋白质组学研究技术日臻成熟。人类蛋白质组学研究揭露了更复杂的蛋白质生化特征，包括单细胞变异、动态蛋白质易位、多变互作网络，以及多区室定位蛋白质等。利用比较空间组学，一些疾病的机制也得以揭示。空间转录组学正与细胞生物学、医学研究融合在一起，为无偏倚地、系统地洞察分析细胞生物学过程铺平了道路 ［3］ 。
通常，有三种互补的方法用于空间蛋白质组学：分离细胞器的质谱分析，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，蛋白质定位的全蛋白成像。
质谱可用来识别蛋白质并定量其在高度复杂混合物中的丰度。空间蛋白质组学的传统生化方法是通过亚细胞分离来富集某种特定的细胞器，然后用质谱来鉴定峰组分中的蛋白质（彩图2a）。对于具有特征性大小、密度和形状的均质室腔，可以实现实质性的富集（如突触囊泡）。尽管细胞器分离方法仍在普遍使用，但现在人们普遍认识到，由于其内在的异质性和重叠的物理性质，大多数亚细胞间隔并没有明确的界线。因此，检测靶细胞器富集部分中的蛋白质不足以证明其特定的细胞器关联。定量质谱的出现在这方面取得了很大进展，适当的实验设计可以帮助其以一种无偏见的方式区分是细胞器成分还是非特定的背景（彩图 2b）。这些细胞器谱分析方法已经应用于单个细胞器，更重要的是，应用于整个细胞，得到全面的高分辨率细胞器图（彩图2c-e）。
此处利用抗体介导的亲和纯化质谱（affinity purification-mass spectrometry，AP-MS）实验，这种技术可用于明确蛋白质与蛋白质的相互作用（流程见彩图3a）。从概念上讲，蛋白质的相互作用组是一种局部空间蛋白质组，因为蛋白质必须在同一位置进行相互作用。在对同一系统中足够多的诱饵蛋白进行分析后，所绘制的相互作用最终形成一个相互连接的网络，提供蛋白质亚细胞定位的信息（彩图3b）。到目前为止，在哺乳动物细胞中最大规模的相互作用组学研究总共使用了几千个“诱饵” ［4， 5］ 。然而，完整覆盖蛋白质组及系统性空间解释的相互作用仍然匮乏。这种方法已经成功地用于绘制单个细胞器的蛋白质组地图。基本策略是识别已知驻留在靶细胞器中的几个蛋白质的相互作用伙伴。由于细胞器蛋白质体的整体复杂性通常比整个细胞蛋白质体的复杂性低 12 个数量级 ［2，6］ ，因此即使只有几个“诱饵”，也可以获得一个综合的关联网络。阐明藻类蛋白核的组成就是一个很好的例子。蛋白核是叶绿体中一个对二氧化碳浓度和同化至关重要的无膜隔间。经高通量绿色荧光蛋白（GFP）标记及成像识别蛋白核局部蛋白后，仅 38 个诱饵用于AP-MS ［7］ 。这项研究不仅揭示了蛋白核分子结构的许多细节，也展现了结合AP-MS与正交成像技术的协同作用（彩图 3c-f）。
成像空间蛋白质组学是一种在蛋白质组学分析之前不需要裂解细胞或者物理分离室间或细胞器，就能在其本身的细胞环境中看到蛋白质的技术（彩图4）。原位蛋白使得多模式细胞器分布的蛋白质变得可追踪。事实上，大规模成像研究已经揭示了许多蛋白质定位于多个细胞区室 ［8］ 。此外，越来越清楚的是，基因相同的细胞群体的蛋白表达水平和蛋白定位在不同环境下，例如在细胞分化期间、在对环境刺激的反应中及药物治疗后，表现出变异性。这种现象被称为“两段策略”，表明细胞群体中单个细胞对压力的反应存在内在的变异性，这是一种风险扩散策略，提供了长期的群体适应优势。以成像为基础的技术可以通过捕获单细胞分辨率下的蛋白质空间分布来研究这种变异。
成像需要蛋白质的可视化，这通常通过使用亲和试剂如抗体，或通过融合荧光蛋白的表达来实现。产生抗体和转基因蛋白质既昂贵又耗时，因此限制了蛋白质组学的广泛应用。不过，亲和试剂和融合荧光蛋白提供了用以“拉拽”的蛋白质特异性把手，这就为后续蛋白质相互作用研究和复合物分析创造了条件。