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随着人们在基因水平上对疾病认识的加深，瞄准“精准治疗”的临床检测需求日益增加，基因变异的检测技术和数据处理分析方案也随之飞速发展。从20世纪 80年代的桑格测序（sanger sequencing）、Southern杂交，到 90年代的基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的探针筛查，再到 21 世纪的基因芯片、二代测序、三代测序，基因检测技术已发展出应对不同检测目的和检测通量的适宜方案，不仅能够高效地完成有限数量基因变异位点的分型，甚至可以迅速、经济地完成全基因组的测序，这些结果有助于我们提高检测效率、加速对未知位点的探索。本节中我们将通过基因检测技术的发展过程，介绍目前常用的临床和科研基因检测工具。
至今为止测序技术已发展三代，从第一代测序的单条扩增片段的精确检测，到第二代测序的大规模平行测序，再到近年来新兴的单分子长读长的第三代测序，测序技术已取得了相当大的进步。它的发展使人们对生命遗传物质DNA的认识层次不断提高，从针对单一、局部的基因或基因片段的研究升级为对整个基因组的研究。特别是，针对精准医学，测序技术可以广泛应用于单基因突变检测、多位点变异检测、复杂疾病未知病因的基因组学筛查、表观修饰检测乃至部分染色体变异的检测中。下面将从各代测序技术的原理来展示测序技术的发展历程（图2-1） ［7］ 。
第一代测序技术以桑格测序为代表，该技术于1977年由桑格和库尔森（Alan Coulson）发明，并成功完成了噬菌体ΦX174全长 5375个碱基对的序列测定，这是人类完成的第一个物种的全基因组测序 ［8］ ，开启了对基因序列研究的篇章。随后，美国应用生物系统公司（Applied Biosystems，ABI，现被赛默飞世尔公司收购）结合荧光标记和毛细管电泳技术，开发了一系列不断优化的自动测序仪 ［9］ ，将桑格测序推入商业化。结合鸟枪法DNA打断和序列拼接技术，桑格测序成功应用于2001年完成的首个人类基因组图谱的绘制，因此可以说桑格测序已成为近30年来应用最广泛的测序技术。
图2-1 测序技术发展历程
桑格测序的核心原理为双脱氧链终止法，即通过合成与单链DNA互补的核苷酸链来读取待测DNA分子的序列，合成的互补链在不同位置随机终止反应 ［10］ 。具体来看，在单链DNA合成过程中，除加入常规扩增所需的单向扩增引物、DNA聚合酶、Mg 2+ 和dNTP（脱氧核糖核苷酸）外，还额外加入携带不同荧光标记的ddNTP（双脱氧核糖核苷酸）。由于ddNTP中五碳糖的 3’碳原子不含羟基（3’-OH），在DNA的合成过程中不能与下一个碱基的磷酸基团形成 3’-5’磷酸二酯键，因而导致DNA合成反应的中断。该中断可能在任意一个碱基位置形成，因此扩增出一系列长度差在 1 bp的DNA单链片段，这些单链片段通过毛细管电泳一一排布，并通过荧光检测仪读取终止位置的ddNTP所携带的荧光标记指示相应位置的基因序列，完成自动化测序。
桑格测序技术的优点为，测序读长长，能达到800~1000 bp，且测序准确度高达 99.999%，是目前基因测序的金标准。其缺点为通量低、成本高，第一份人类基因组图谱的绘制共耗时10年时间，花费27亿美元。高昂的成本使得精准医学时代一代测序更多地用于少量特定靶点位置的检测，以及对二代、三代测序发现结果的验证。
此外，第一代测序的另一个代表性技术为马克西姆（A. M. Maxam）等在1977年发明的化学降解法测序 ［11］ 。该技术分别在不同的碱基上引入放射性同位素基团，然后通过降解核苷酸链形成一系列只相差1 bp的DNA短链，根据末端同位素标记进行序列测定。该方法由于不适合自动化检测、测序试剂对人体有较大伤害等原因，仅在20世纪70—80年代广泛流行，在90年代后逐渐退出历史舞台。
第二代测序技术又称下一代测序技术（next generation sequencing，NGS），是在一代测序基础上发展出的一种大规模并行测序技术（massively parallel sequencing）。与一代测序不同的是，NGS摒弃了一代测序“一个模板，一条泳道”的策略，创新性地采用乳液PCR、桥式扩增或DNA纳米球等形式为每一条DNA模板建立独立的微环境，实现同时对百万条乃至数十亿条待测DNA模板的并行测序，因而使测序效率得到了指数级的提升，降低了单碱基测序成本 ［12］ 。一代测序时代完成一个人类基因组的测序需要 3 年时间，而目前使用NGS技术仅需 3 天的耗时、1000 美元左右的价格即可以完成单个个体的全基因组测序。
商业化的二代测序主要包括罗氏公司（Roche）的454测序技术、因美纳公司（Illumina）的Solexa测序技术、赛默飞世尔公司（Thermo Fisher）的SOLiD测序技术、我国华大基因公司（Beijing Genomics Institute）的DNBSEQ测序技术，以及Ion Torrent测序技术。尽管不同测序技术存在着较大差异，但各技术的主要工作流程均包含样品准备（文库制备）、核酸测序和数据分析三个步骤。
（1）文库制备
利用喷雾法将待测DNA打断成300~800 bp的小片段，将断端补齐后在两端连接不同的接头。其中一条接头包含 5’-生物素标记，可以将双链DNA片段固定在包被链霉亲和素的磁珠上，进而通过DNA变性将未被标记的DNA链分离洗脱，得到单链模板DNA（single strand template DNA，sstDNA）文库。
（2）乳液PCR
sstDNA的另一条接头用于与磁珠特异性结合和DNA扩增。将sstDNA文库、磁珠和PCR扩增体系混合成的水溶液注入高速旋转的矿物油表面，形成无数个油包水小液体，通过调整比例，使得每个油包水液滴只包含一颗磁珠和一条sstDNA，这样就可以并行进行独立的PCR反应扩增，这一步骤被称为乳液PCR。通过乳液PCR，单一磁珠上可以固定约100万个DNA克隆 ［14］ ，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序检测所需的信号要求。
（3）测序
将携带文库的磁珠放入Pico Tinter Plate（PTP）板的微孔中进行后续测序，PTP板中每个孔只能容纳一颗磁珠，每颗磁珠测得一条DNA读长。454采用边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS）的方法，以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，按照T、A、C、G的顺序依次循环，每次加入一种dNTP进行合成反应。如果该轮加入的dNTP能与待测序列互补配对，则会释放出焦磷酸基团。释放的焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下将萤光素氧化成氧化萤光素，发出光信号。因此，当有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；当两个或多个碱基与测序模板配对时，光信号随之改变。因此，通过高灵敏度CCD实时捕捉光信号的变化，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。该测序方法也被称为焦磷酸测序。454技术的平均读长可达400 bp，比其他二代测序技术长，然而它最主要的缺点是无法准确测量同聚物的长度。
因美纳公司是目前占据最高市场份额的测序公司，公司至今为止推出了多代自动测序平台，包括Solexa、HiSeq、MiSeq、NovaSeq、MiniSeq、iSeq等。该公司技术的核心为边合成边测序技术，通过单分子阵列实现在小型芯片上DNA簇的形成，通过循环可逆阻断技术（cyclic reversible terminator，CRT）实现每次只合成一个碱基，再通过激发所添加碱基的荧光信号和读取信号，获得碱基信息 ［15］ 。具体步骤如下。
（1）文库制备
通过超声法将基因组DNA打断成300~500 bp的小片段，随机在片段的两端分别加上接头P5、P7，构建出双链DNA文库。
（2）DNA簇的形成——桥式PCR
DNA的扩增与测序在测序流动槽（flowcell）上完成，每个测序流动槽包含 8个通道（lane），每个通道表面包含上亿个与P5或P7接头互补配对的单链引物。将构建好的文库上样到芯片时，经过变性的单链DNA与通道上的引物配对结合，经过一轮PCR反应，就会得到一端“固定”在芯片表面的互补DNA链。在后续扩增过程中，该DNA链的另一端随机与附近的另一种引物互补配对被“固定”住，形成DNA桥。经过30~35轮扩增，每个单分子得到了超过1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上（图2-2） ［16］ 。
图2-2 桥式PCR过程
（3）测序
采用边合成边测序的方法。向合成体系中加入DNA聚合酶、引物和带有 4种不同荧光标记的dNTP。这些dNTP的3’-OH末端被化学基团保护，因而每个循环只能掺入单个碱基。在dNTP被添加到合成链上后，去除缓冲液及游离的dNTP，加入荧光激发试剂，并采用光学设备读取每条模板序列的荧光信号，即可得知该轮反应所聚合的碱基种类。随后，去除 3’-OH末端的化学基团，恢复 3’端黏性，开始下一轮的DNA合成和测序。待模板全部被合成为双链后，统计每轮采集的荧光信号就可以得知整个模板DNA片段的序列。
Solexa测序技术每次只添加一个dNTP，这一特点能够很好地解决同聚物长度的准确测量问题，但主要测序错误来源是碱基的替换。目前它的测序错误率为 1%~1.5%，测序周期以人类基因组重测序为例，30×测序深度大约为 1周。目前测序可以采取单向读长或配对末端双向读长，检测读长最长可达2×150 bp。
SOLiD测序技术是赛默飞世尔公司于 2007 年开始投入市场的测序技术。与前两种方法不同的是，它不依靠DNA扩增的方法进行测序，而是采用了基于DNA连接酶的边连接边测序（sequencing by ligation，SBL）方法。它的主要原理和步骤如下。
（1）DNA文库构建及乳液PCR
DNA文库构建和乳液PCR方法与 454技术基本相同，不过它采用了更小的磁珠（直径为454磁珠直径的1/20）进行扩增，并使用更高密度的测序芯片，因此在同一系统中能轻松实现更高的通量。
（2）连接酶测序
SOLiD采用边连接边测序的策略，连接反应底物为 8 碱基单链荧光探针。其中探针3’端第1、第2位为确定序列，共有8种序列排列组合，探针的5’端标记有不同荧光。当探针前两位与待测位置开头 2 bp完全匹配时，探针会在Taq DNA连接酶的作用下连接到引物上，释放相应荧光信号，从而反映这两位碱基的序列。在记录下荧光信号后，通过化学方法在探针的第5和第6位碱基之间进行切割以移除荧光信号，暴露新的待测位置，开展下一轮的测序（图2-3） ［12］ 。
图2-3 SOLiD测序技术连接
值得注意的是，因为探针在每次连接反应后的切割位置为第 5 位，因此SOLiD法中每次测序的位置都相差 5 位，即第一轮第一次反应可以测得引物下游第1、第2位的序列，第二次是第6、第7位，第三次是第11、第12位……在测到末尾后将新合成的链变性、洗脱，重新用位移 1位的引物进行第二轮测序，测定第 0、第 1、第 5、第 6 位……以此类推进行 5 轮测序，完成所有位置的碱基测序。该技术每次同时测定两位碱基序列，每个位置的碱基均被检测了两次，因此原始测序准确性高达99.94%，而15×覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。
这是2015年我国华大基因公司推出的一种新的测序技术，该技术在DNA文库构建和测序芯片上进行了很大的改进，在保证了测序质量的同时，提高了并行检测的通量，并将测序成本降低至以前的2/3，因而逐渐在市场上占有一席之地。
在DNA文库构建上，华大创新性地采用了滚环复制技术（rolling circle amplification，RCA）进行模板扩增，将基因组DNA打断后环化，通过滚环复制，保证每轮扩增均以原始DNA为模板，整个反应仅将模板数扩增 2~3 个数量级，避免了指数级扩增的PCR过程带来的错误富集。同时，复制的产物首尾相连缠绕形成一个DNA纳米球（DNA nanoball，DNB），纳米球进而固定在阵列化的硅芯片上，成为测序芯片的基底。DNBSEQ技术为目前唯一一种能在溶液中实现模板富集的方法，结合了阵列化测序芯片和DNB测序技术，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到最大化利用，降低了技术成本。
在测序方面，DNBSEQ采用的也是边连接边测序的方法，不过其探针一次仅检测 1个碱基序列，更好地避免了个别碱基测序错误带来的整体序列偏移。此外，华大资助开发了荧光图像识别和序列转换算法，实现了图像处理和碱基识别的实时化，数据处理速度处于同行业领先水平。
Ion Torrent是一种边合成边测序的技术，它是第一个不通过光学感应的二代测序平台 ［17］ 。与上述方法不同的是，Ion Torrent不进行荧光信号的检测，而是创新性地检测DNA延伸过程中不同碱基结合到模板时释放的H + 信号，将其转化为数字信号来判读DNA序列。该技术的发明人罗思伯格（Jonathan Rothberg）也是 454 技术的发明人，其建库方式与 454 基本相同。相比于其他测序技术，Ion Torrent不需要昂贵的物理成像等设备，因而成本更低、测序仪体积更小，检测速度也相当快，整个上机、测序可在 2~3.5 小时完成。其缺点是芯片的通量不高，因此非常适合小基因组和外显子验证的测序。
序列读取只是二代测序的第一步，原始数据经过拼接、变异位点的筛选、注释、临床解释等过程，才能真正应用于精准医学的诊断和治疗。那么，我们是如何完成从测序到应用的过程的呢？
测序数据下机后首先进行数据预处理，预处理包括以下 4个步骤。①数据清洗。即去除接头（adapter）和标签（barcode）序列，去除低质量的Reads、去除包含过多N的Reads，得到高质量的待测基因组数据。②进一步进行片段比对（mapping）。由于二代测序均为短读长测序，只有将其比对到基因组 30 亿的碱基对中的正确位置，才能进行后续的变异位点筛查。现在主流的比对软件的核心算法主要包含两大类：基于哈希表（hash-table）数据结构的比对算法（种子序列定位及延伸算法）和基于Burrows-Wheeler transform（BWT）索引数据结构的比对算法 ［18］ 。BWT算法因消耗内存小、计算速度快而被更广泛地应用，基于BWT的常见软件包括bowtie和BWA等。③对比对后的数据进行排序、标记重复片段、添加索引等。④变异筛查。此步骤通过软件自动化进行，筛查包括单位点突变和得失位（indel，指两个匹配的DNA序列间发生插入或缺失的位置）的发现判读。哈佛大学医学院开发的GATK best practice是目前认可度最高的全基因组重测序分析流程，尤其适用于人类研究。其具体流程如图2-4。
图2-4 GATK变异判读流程
第三代测序技术指单分子读取技术。三代SMRT测序技术是single molecule real time的缩写。它的基本原理是监测带有不同荧光标记的聚合酶反应过程，从而判断DNA碱基序列。每一个反应池中只有一条DNA模板，因此称为单分子测序。聚合酶反应过程是连续不间断的，非常类似细胞中真实的聚合酶反应过程，因此称为实时测序。这就是单分子实时测序名字的来由。该技术通过优化的DNA聚合酶可以完成对单分子的扩增，平均读长为 10~15 kb，最长可达 2 Mb，为长读长测序平台。同时，三代测序有着更快的数据读取速度（10 bp/s），并可以实时显示测序结果。与二代测序不同的是，其文库准备不需要DNA打断及扩增步骤，在某些情况下，原始DNA或RNA分子可被直接用于测序。因此该方法特别适合RNA测序（RNA-seq）和无参考基因组物种的从头测序。三代测序实现了无需拼接的转录本分析，能更准确地报道新的基因转录本、分析基因融合事件等。
三代测序的典型代表为PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术 ［12］ 。PacBio SMRT技术为单分子荧光测序。每张测序芯片上有 100 万个直径仅 70 nm的零模波导孔（zero-mode waveguide，ZMW），每个ZMW内固定一个DNA聚合酶分子，聚合酶利用携带不同荧光标记的dNTP进行DNA复制，边合成边测序。SMRT的关键是高活性的扩增酶和ZMV孔的强大信号读取能力，能将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。另外，通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，还可以反映碱基修饰情况。例如当碱基存在甲基化修饰时，聚合酶通过和合成的速度会减慢，表现为相邻两个信号之间的距离增大（彩图1）。
与SMRT不同的是，Nanopore单分子测序是基于电信号（而不是光信号）进行的。Nanopore技术将人工合成的一种多聚合物的膜浸在离子溶液中，膜上布满了经改造的跨膜通道蛋白（纳米孔），在膜两侧施加不同的电压产生电压差，DNA链在马达蛋白的牵引下，解螺旋通过纳米孔蛋白，当DNA碱基通过纳米孔时，不同碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出碱基类别，从而实现测序。纳米孔单分子测序也可以直接读出甲基化的胞嘧啶，而无需亚硫酸氢盐处理样品（图2-5）。
纳米孔测序技术能够直接实时分析任意长度的DNA或RNA片段。其读长长度与制备的样本中DNA或RNA的长度直接相关，不受测序仪器的限制。用户可以根据实验选择恰当制备方法，影响读长序列长度。与其他技术不同的是，纳米孔测序的数据结果可以在检测的同时进行实时传输，立即用于解读和分析。
不过，三代测序的错误率较高。例如SMRT的单分子读取平均错误率为11%，Nanopore的读取错误率在 1%~10%。庆幸的是，三代测序的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过对单条DNA多次测序来进行有效的纠正，在测序平台中直接完成错误矫正。目前官方公布的SMRT准确度为 99.999%，Nanopore为 99.8% ［19］ ，基本满足日常科研和临床检测需求。
图2-5 纳米孔测序工作原理
纳米孔能处理呈现给它的DNA或RNA片段的整个长度。用户可以通过所使用的文库制备实验方案来控制片段长度。能够生成任意所需长度片段——从短片段到超长片段（如大于2 Mb的DNA片段和大于20 kb的RNA片段）。a.文库制备。在片段的两端添加测序接头和马达蛋白。b.酶马达通过纳米孔控制DNA链或RNA链的位置移动。一旦DNA或RNA通过，马达蛋白分离且纳米孔准备好接受下一个片段。c.纳米孔读取头。DNA或RNA片段通过纳米孔的小孔，位移过程中电流的波动可用于确定DNA或RNA序列。d.位移。模板链和互补链都携带马达蛋白，因此两条链都可以移动至纳米孔。e.为确保信号清晰，通过电阻膜让所有电流必须通过纳米孔。f.每个碱基通过纳米孔时会产生不同的电压。
在DNA测序技术发展的40余年中，技术不断更迭，测序读长从长到短，再从短到长。目前，二代测序是应用最广的测序技术，三代测序技术方兴未艾。测序技术的每一次变革和突破，都对基因组学研究、疾病医疗研究、药物研发、育种等领域产生巨大的推动作用。从测序的检测目的上看，具体可以分为以下三种形式 ［20］ 。
（1）靶向测序（targeted next-generation sequencing，TNG）
靶向基因组中特定区域进行测序，可以包括单个或多个感兴趣的基因或染色体区段。通常针对已知的与特定表型相关的基因进行检测，在临床中较为常用。其缺点为，一旦靶标基因列表更新，前期的数据就无法补充新的靶基因相关数据。
（2）全外显子测序（whole exon sequencing，WES）
特异性地富集基因组中的整个外显子区进行测序，可以说是一种范围更广的靶向测序。外显子区（基因编码区）约占整个基因组的2%，且目前已知的致病突变中约有85%是在外显子内发现的，因此关注这些区域可以发现绝大多数功能变异位点。
（3）全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）
针对整个基因组进行测序，包括全部基因区（外显子+内含子）和基因间区。前文我们提到，基因调控序列（非编码序列）在复杂性状和疾病中起着关键作用，因此测定这些信息对揭示复杂疾病或未知病因的疾病尤为重要。需要注意的是，利用三代测序技术进行全基因组的测序具有不需复杂序列拼接的优势。
WGS不易受到靶向测序或WES中靶基因捕获这一步骤中的技术偏差带来的影响，同时也可以通过非PCR扩增的建库方式提高对高GC区域的检测能力。据估计，WES对高GC区的不完全测序可导致单个外显子中漏掉多达400个致病突变 ［19］ 。相比之下，WGS提供了更均匀的覆盖度分布，并且能够更好地检测基因点突变、得失位和不同长度的拷贝数变异。不过，WGS成本较高，目前不适用于大范围的临床推广，而WES被认为是一种更具成本效益的替代方案。希望随着测序技术的进步和成本的降低，WGS能成为临床检测首选。当然，尽管一代桑格测序对于大规模基因组测序来说，成本高昂且效率低下，但它仍然是临床检测的金标准，在临床报告或科研中通过二代测序技术发现的新突变体仍需要通过该方法进行验证。
此外，测序技术也被广泛应用到病原微生物的检测中。以宏基因组测序为例，宏基因组学技术避开传统的微生物分离培养方法，直接从环境样品中提取总DNA或RNA，处理后建库测序，因此测得的基因数据中包括了可培养的和尚不可培养的微生物的遗传信息，对发现未知病原体起到重要作用。新冠病毒最早也是通过这种方式被鉴定出来的。
综上所述，面对未知疾病时，可以首选二代或者三代测序进行全基因组检测，以缩小临床测试范围，框定候选靶点区域。进一步通过外显子测序或靶向测序进行深度测序，并通过桑格法确定突变位点。最后，可以针对性地开发出基因芯片或扩增检测试剂盒，用于临床诊断。
基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray），主要通过杂交法进行基因测序分型。具体来看，在固相支持物上原位合成寡核苷酸探针，或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样本杂交，通过检测杂交信号可得出序列信息。基因芯片可以针对不同类型的突变或修饰开展检测，例如可以进行基因点突变、甲基化修饰、染色体结构变异、拷贝数变异等多种检测；也可以针对不同尺度的突变开展检测，例如可以进行全基因组检测或针对特定基因集的靶位点检测。
国际人类基因组单体型图计划就是通过全基因组SNP分型芯片检测完成的。该计划1期数据中75%来自因美纳公司SNP Genotyping系列微珠芯片分型结果，这也是目前市场占有率最高的芯片。Infinium Global Screening Array-24（GSA）芯片是面向全球人群的基因分型芯片，一张芯片可以同时检测24个样本约 70 万个标记位点，整个检测仅需 3 天，检测及后续填充准确率高达 99.98%。相较测序技术，芯片实现了更经济的人群遗传学研究、遗传研究成果转化、变异筛选和精准医疗，因此GSA系列芯片已经成为应用最广的基因组SNP芯片，也是目前能够实现对全基因组进行筛查的、成本最低的基因分型技术。针对我国人群也有Human OmniZhongHua-8 芯片和Asian Screening Array（ASA）芯片，单张芯片可对8个样本、每个样本超过90万个位点同时进行检测，特异性地覆盖中国人特有的常见变异和稀有变异。
比较基因组学杂交技术（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）芯片是一种用于检测拷贝数变异的芯片。该技术分别用红色和绿色两种荧光标记实验样本和对照样本，通过对比与芯片探针杂交后红绿两种荧光的比值，分析实验样本相比对照样本来说DNA拷贝数是增加还是减少。随着探针密度的升高，aCGH的检测精确度远高于染色体核型分析和FISH，是目前产前诊断中微重复微缺失检测的常规技术。
当我们只需要检测特定“突变”是否存在时，基于质谱平台的MassARRAY技术和基于荧光检测实时定量PCR（real-time PCR）就闪亮登场。
MassARRAY飞行质谱检测系统是美国基纳公司（Agena）发明的基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，能够实现SNP分型、甲基化定量和基因表达定量等检测。以基因分型为例，MassARRAY利用单一延伸引物进行基因分型：扩增包含待测位点的短片段，然后与单一延伸引物杂交，该引物的 3’末端位于SNP上游1 bp，通过双脱氧终止法使单一引物延伸一个碱基就终止，进而通过质谱精准区分引入的碱基的重量，实现基因分型。基纳公司已推出一系列CYP诊断试剂盒，配合MassARRAY系统，只需要 6个步骤就可以诊断药物代谢酶基因 CYP2D6 、 CYP2C19 或 CYP2D6 的常见SNP。MassARRY芯片可以实现单孔多位点的基因分型，适合大量样本的高通量检测 ［21］ 。
实时定量PCR是一类将PCR技术与荧光标签检测技术结合的基因分型检测方法，常用的包括TaqMan技术、高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting analysis，HRMA）等。TaqMan技术采用一对分别与待测SNP的不同等位型互补配对的荧光探针进行分型。探针的5’端连接淬灭基团，3’端末位分别与两种待测SNP配对，并连接不同的荧光基团。在扩增中，探针 3’端末位碱基与SNP完全匹配时，Taq DNA聚合酶发挥 5’→3’外切酶活性，将完全匹配的探针 5’端的淬灭基团切掉，导致荧光基团释放，发出荧光。因此根据荧光类型即可判断出待测位点SNP的基因型。目前市场上已有多种基于TaqMan技术的检测试剂盒面世，如美国的应用生物系统公司针对 220 种以上药物代谢酶的 2000 多个基因多态性开发出的具有高度特异性和综合性的TaqMan试剂盒、对阿尔茨海默病相关的载脂蛋白ApoE基因多态性的检测试剂盒等，赛默飞世尔等公司也可以提供基于客户需求定制的TaqMan qPCR SNP分型试剂盒，以配合灵活的检测需求。
高分辨率熔解曲线分析是基于扩增产物的熔解温度差异而进行分型的方法。该方法对跨SNP区域进行PCR扩增，并将在反应体系加入DNA饱和荧光染料LcGreen或EvaGreen。该染料可以与双链DNA结合发出荧光，但不与单链DNA结合，因此在双链DNA产物解链时会发生荧光变化。对含有待测SNP位置的扩增产物进行升温变性，并在每 0.1~0.5 ℃采集一次荧光信号，记录产物熔解曲线图，基于携带不同SNP的扩增产物的熔解温度存在差异，即可进行分型。此法的缺点为通量较低，单孔仅能对单位点进行基因分型，但因灵活性较高、仪器和试剂价格低廉成为临床检测的新宠儿。凯杰公司（Qiagen）基于HRM法开发的therascreen ® K-ras 7 位点突变检测试剂盒（KRAS RGQ PCR Kit）已分别于2013 年、2014 年被美国FDA通过用于指导阿法替尼（吉泰瑞）和帕妥木单抗（Vectibix）的应用，推进了非小细胞肺癌和转移性结直肠癌的精准用药。