下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
目前，研究AD的方法主要包括动物模型和细胞模型。动物模型能真实模拟动物体内AD的病理特征，而细胞模型能在微观层面研究AD的发病机制，并可根据研究目的的不同选择构建适宜的细胞模型。然而，目前总结AD细胞模型方法的文献报道较少。因此，本节将从造模试剂、细胞模型建立方法及评价指标等方面对建立AD细胞模型的方法进行综述，进一步梳理各细胞模型的特点，并根据造模物质的神经毒性、氧化应激、Tau蛋白异常磷酸化等作用机制方面对其进行分类总结，旨在为后续研究AD的发病机制及相关药物开发提供参考。
（一）神经毒性损伤
（1）Aβ：Aβ来自于其前体淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）第672～711残基裂解片段，APP经β-和γ-分泌酶连续剪切后形成长度在39～42个氨基酸的短肽。APP表达量增多时，导致Aβ过量产生，从而造成Aβ积聚形成SPs。据报道，Aβ可直接或间接对线粒体结构及功能造成损伤，进而诱发氧化应激、激活凋亡信号通路等级联反应，导致大量的神经元细胞损伤。此外，Aβ积聚也会导致Tau蛋白过度磷酸化、突触连接障碍、炎症反应等。目前研究常采用20μmol/L浓度的Aβ 1～42 、Aβ 25～35 诱导细胞建立AD细胞模型。
（2）谷氨酸：谷氨酸（glutamate, Glu）是大脑中主要的兴奋性神经递质，同时也被认为是新皮质和海马锥体神经元的主要神经递质，涉及认知功能等方面。研究表明，谷氨酸能神经元位于AD中受影响的区域，其作用是通过控制突触中谷氨酸的浓度，将神经冲动转化为化学刺激，并在突触前神经元中通过2个囊泡谷氨酸转运蛋白（vesicular glutamate transporter, VGLUT）1和VGLU2维持储存在囊泡中的谷氨酸水平。当神经元去极化时，过量的谷氨酸被释放到突触间隙，导致突触前和突触后神经元上的谷氨酸受体过度刺激，造成钙大量涌入、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生，引起氧化应激反应及最终的神经细胞死亡。目前谷氨酸常采用10μmol/L的浓度诱导细胞建立AD模型。
（3）甲醛：甲醛（formaldehyde, FA）是毒性最强的有机化合物之一，广泛分布于生物体和环境中。研究发现，AD患者尸检的海马中FA水平显著升高，因此AD的发病机制与甲醛密切相关。文献报道FA异常升高与认知障碍有关，如学习能力下降和记忆丧失；其也可促进AD的主要病理特征形成，包括Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化和神经元丢失，同时伴有细胞功能障碍甚至细胞凋亡。研究采用0.35 mmol/L的FA诱导N2a细胞，导致细胞凋亡率增高，Tau蛋白过度磷酸化。
（4）甘油醛：甘油醛（glyceraldehyde, GA）呈剂量依赖性地促进神经细胞中GA衍生晚期糖基化终末产物（GA-AGEs）的产生。GA-AGEs主要存在于海马和海马旁回的神经元中，具有强烈的神经毒性，研究表明，经0.7 mmol/L GA诱导的SH-SY5Y细胞出现凋亡；细胞内产生GA引起甘油醛-3-磷酸脱氢酶失活，进一步增加SH-SY5Y细胞内GA浓度，导致GA-AGEs产生和神经细胞毒性增强。
（5）硅胶纳米粒子：硅胶纳米粒子（silica nanoparticles, SiNPs）是工业中最广泛使用的纳米粒子之一，并且已经用于中枢神经系统中的细胞和非病毒基因的递送。研究表明，SiNPs具有神经毒性，可诱导SK-N-SH和N2a细胞凋亡，并提高细胞内ROS水平。另外，经SiNPs处理的细胞内Aβ 1-42 沉积增加和Tau蛋白Ser262和Ser396磷酸化。
（二）氧化应激损伤
（1）过氧化氢（hydrogen peroxide, H 2 O 2 ）：H 2 O 2 是一种强氧化剂，可诱导体外细胞产生ROS，抑制细胞增殖，并氧化脂质、蛋白质和DNA等细胞内大分子，产生过量的脂质氧化物及自由基等，导致组织损伤和细胞死亡。此外，研究显示H 2 O 2 可通过c-Jun N-末端激酶诱导β-分泌酶的启动子活性，导致APP表达增加和Aβ积聚，从而诱导神经细胞凋亡。
（2）晚期糖基化终末产物：晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products, AGEs）主要是由蛋白质等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过非酶促糖基化反应产生不可逆的终末产物。AGEs积累后能诱导神经元产生大量ROS，从而引发氧化损伤；同时，高水平的AGEs和ROS将导致AGEs受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）过表达。AGEs与其受体RAGE结合是其致病的主要途径，两者相结合后，通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶产生ROS，增强机体氧化应激，最终导致神经元凋亡。此外，AGEs累积也与炎症反应、细胞凋亡等机制相关。
（3）Tau蛋白过度磷酸化：大量研究证明，Tau蛋白过度磷酸化在AD疾病中起着重要作用。冈田酸（okadaic acid, OA）是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。体外研究表明，经OA处理的神经细胞，Tau蛋白Ser-262位点磷酸化水平明显升高；同时，OA具有神经毒性，引起神经元细胞突触损伤。因此，OA可用于制备Tau蛋白过度磷酸化的AD细胞模型。
（一）人神经母细胞瘤细胞
人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和SH-SY5Y常用于研究AD发病机制。SK-N-SH细胞系来源于一名4岁女性的转移性神经母细胞瘤的骨髓活检组织，该细胞系在体外培养状态下的生长特性类似神经元，具有神经元酶表达的多能性，如多巴胺-β-羟化酶、胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶。同时，研究表明SK-N-SH细胞经10μmol/L全反式维甲酸诱导分化后细胞突触明显伸长、突触素表达明显升高等典型的神经元特征。而SH-SY5Y细胞系应用最为广泛，是SK-N-SH细胞系的一个亚系，并经历3次克隆选择产生（SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5Y）。该细胞系表现出多巴胺能神经元的特性，可表征多巴胺能标志物，如多巴胺-β-羟化酶、酪氨酸羟化酶（tymsine hydroxylase, TH）和多巴胺转运蛋白，具有合成和降解多巴胺的能力；同时，该细胞经诱导剂维甲酸诱导分化后，引起多巴胺能神经元特征加强，具有高表达的囊泡单胺转运体1（vesicular monoamine transporter1, SLC18A1）、多巴胺受体D2（dopamine receptor D2, DRD2）。
目前，常用于诱导人神经母细胞瘤细胞建立AD模型的造模试剂包括，Aβ、H 2 O 2 、AGEs、GA、OA、Si NPs等，其诱导时间大多为24h或48h。检测指标主要有细胞活力、凋亡率及相关凋亡蛋白表达、氧化应激相关指标、Tau蛋白磷酸化水平等。因此，该类细胞模型主要体现AD疾病的细胞凋亡、氧化应激、Tau蛋白磷酸化等病理特征。
（二）NG108-15细胞株
NG108-15细胞株是由小鼠神经母细胞瘤（neuroblastoma）和大鼠神经胶质瘤（glioma）细胞杂交形成的神经肿瘤细胞。Tojima等发现该细胞株经分化剂丁酰环磷酸腺苷（dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP）刺激分化后，表现出神经元样形态，具有神经突结构；同时，通过比较研究发现未分化和分化的NG108-15细胞株均能不同程度表达神经元蛋白和神经胶质蛋白，但未分化的细胞仅能表达神经胶质蛋白，如波形蛋白，而极少表达神经元蛋白，如神经丝蛋白（neurofilament, NF）200、磷酸化NF200，因此认为未分化的NG108-15细胞株不是神经元样细胞；此外，分化后的NG108-15细胞株也能表达Ch AT蛋白，揭示该细胞能合成神经递质乙酰胆碱。
NG108-15细胞株常应用于AD等与认知、记忆相关的体外研究。研究常采用Aβ 25～35 、OA等诱导NG108-15细胞株，其模型主要机制涉及细胞凋亡、Tau蛋白异常磷酸化等，与AD患者脑组织中的病理特征一致，可作为研究AD的细胞模型。具体造模方法见表3-3-1。
（三）小鼠神经母细胞瘤细胞
克隆的小鼠神经母细胞瘤细胞（mouse neuroblastoma cells, N2a/Neuro-2a）是从A株白化鼠的自发性肿瘤而建立，该肿瘤系被命名为C1300。该细胞多数呈神经元样，具有轴突样结构，部分细胞间可见突起交织成网络样结构。研究显示N2a细胞表达核受体相关因子1并产生低水平的TH和多巴胺；但经0.5mmol/ Ldb-c AMP处理后，N2a细胞中TH和多巴胺水平均显著增强，从而促进多巴胺能神经元的形成。
目前，N2a细胞作为体外研究AD发病机制的常见细胞模型。研究常采用Glu、FA、Si NPs等物质诱导N2a细胞建立AD模型，其模型的诱导物质处理时间大多为24h。N2a细胞经造模试剂诱导后常出现Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化、氧化损伤、细胞凋亡等AD样的病理学特征。
（四）大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系（rat phcochromocytoma cell, PC12）来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，是一种研究神经细胞生理、病理及药理的理想细胞。该细胞具有一定的神经内分泌属性，其细胞能合成多巴胺及去甲肾上腺素等儿茶酚胺类神经递质，并储存于细胞囊泡中通过胞吐作用释放。同时，PC12细胞膜上具有神经生长因子（nerve growth factor, NGF）受体，经NGF诱导刺激后可转化为具有神经元特性的神经元样细胞，如PC12细胞突起明显延长、交织，呈现典型神经元形态；细胞抗神经元分化标志微管相关蛋白（microtubule associated protein, MAP）2染色呈强阳性。PC12细胞常用于神经系统疾病的体外研究。学者常采用Aβ 25-35 、Glu、H 2 O 2 等诱导PC12细胞建立AD细胞模型，其药物处理时间为24h或48h。PC12细胞经造模试剂诱导后主要涉及氧化损伤、细胞凋亡等方面。具体造模方法见表3-3-1。
（五）小鼠海马神经元细胞系
小鼠海马神经元细胞系（hippocampal neuronal cell line, HT22）是HT4细胞的亚系，HT4细胞是用温度敏感的SV40病毒为抗原筛选出来的永生化的神经细胞，来源于小鼠海马神经元组织。该细胞系具有胆碱能神经元特性，研究发现未分化的HT22细胞也表达了一些胆碱能标志物，如Ch AT、胆碱转运蛋白、囊泡乙酰胆碱转运蛋白和毒蕈碱乙酰胆碱受体，但分化的HT22细胞在形态学和神经化学水平上更类似于胆碱能神经元；同时，分化的HT22细胞具有明显的神经突生长，形态上与神经元细胞相似。故研究宜选用分化的HT22细胞建立AD细胞模型。Aβ 25～35 、Glu、OA常用于诱导HT22细胞系建立细胞凋亡模型，其机制可能与氧化应激、细胞凋亡有关。具体造模方法见表3-3-1。
表3-3-1 AD细胞模型的构建与评价指标
AD细胞模型是目前研究神经生物学及神经药理学的重要方法，具有来源丰富、干扰因素小、实验条件易控制且评价机制灵活等特点。AD细胞模型可供选择的造模试剂和细胞株种类较多，其造模试剂依据诱导机制的不同分为神经毒性损伤、氧化应激损伤及Tau蛋白过度磷酸化，包括Aβ、Glu、FA、H 2 O 2 等；细胞主要包括人神经母细胞瘤细胞、NG108-15细胞、N2a细胞、PC12细胞等。各细胞来源不同，其常规培养基主要采用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI （Roswell Park Memorial Institute）1640及DMEM/ F12。查阅大量文献研究发现，该类细胞模型主要研究以下机制：a．细胞凋亡，检测其凋亡蛋白、凋亡率。b．细胞氧化应激损伤，检测细胞ROS、GSH、GSH-Px、MDA以及其他氧化指标。c．炎性反应，检测细胞炎症因子，如TNF-α。
科研人员可根据研究基础和目的，选择适宜的细胞株和造模试剂建立AD细胞模型。研究常采用Aβ、Glu、H 2 O 2 诱导SH-SY5Y和PC12细胞建立AD细胞模型，揭示AD的细胞凋亡、炎性反应、氧化应激损伤等机制。另外，也采用OA诱导细胞模拟AD的Tau蛋白磷酸化机制。目前，未分化和分化的细胞均已用于AD的体外实验。研究发现NG108-15细胞经分化剂分化后表达神经元蛋白和神经胶质蛋白等神经元特性，此外大部分细胞经分化剂分化后神经元特性表达进一步增强，如SK-N-SH细胞突触伸长；N2a细胞多巴胺能神经元特性增强，具体见表3-3-2。因此，当确定是否应将未分化细胞或分化细胞用于特定实验时，应考虑上述性质。分化后细胞的形态结构、生化特点及功能特征更接近神经元。同时，分化后的细胞生长更容易培养，如PC12细胞在分化前贴壁性较差，聚集成团状，呈半漂浮状态，且细胞形态易发生改变；而分化后细胞完全贴壁而不聚集成团状。因此，笔者推荐采用分化后的该类细胞用于研究检测到细胞内APP和Aβ的表达均增加。将来可基于分子生物学、分子细胞生物学、基因工程等新技术综合构建能快速转染，又最大限度完善表达神经元的生理特点，并能长期稳定生长及培养的细胞模型。除基因转染技术外，诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）技术也发展迅速。研究发现iPSCs也用于AD细胞模型的建立，Shi等从AD患者体细胞重新编程产生iPSCs，经分化后获得的神经元表征出了Aβ以及Tau蛋白过度磷酸化等AD早期病理特征；同时，研究发现干细胞也可用于治疗AD或延迟其疾病的发生。
表3-3-2 AD构膜细胞分化前后的特征
目前应用体外构建AD细胞模型的方法较为广泛，但仍有部分问题亟待解决，如细胞培养过程中各种代谢中间体、离子、血清成分和底物如何影响细胞的生长和分化有待进一步研究；AD细胞模型目前仅采用单一因素诱导细胞，不符合AD病因及病机的复杂性；尚缺乏与临床微观病理特点完全契合的细胞模型建立方法和统一的模型标准评价体系。因此，笔者认为学者在进一步深入研究中应优化现有AD细胞模型建模方法，系统地引入多维度、多致病因素复合的AD细胞模型构建方法，以期为模型标准化评价及基于神经细胞靶向治疗AD的有效途径以及策略提供思路与借鉴。
近些年来，由于传统2D细胞培养和动物模型的局限性，3D细胞培养技术区别于二者的优势逐渐得到各国研究学者的关注。在肿瘤和药物高通量筛选方面3D细胞培养模型已经取得了初步的成果。但是在AD的研究当中，此项技术的应用才刚刚开始。本部分希望通过介绍3D细胞培养近些年在AD方面的应用，给AD研究学者一些启发。
（一）传统2D细胞培养技术的优势与劣势
自从1885年德国学者Willhelm Roux从鸡胚中成功分离出细胞以来，组织细胞培养技术开始萌芽；Harrison和Carrel等分别于1907年和1912年开始研究离体细胞培养方法，现代细胞培养技术诞生。经过100多年的发展，细胞培养技术已经广泛应用于生物医学、组织工程、再生医学和工业实践当中。
细胞培养（cell culture）指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行首次培养的过程称为原代培养（primary culture）；原代培养的细胞生长到一定程度，受环境影响，需要转移到另一个新的容器，称为传代培养（subculture）。
2D细胞培养模型一直是细胞水平的体外研究的主要手段。2D细胞培养是将离体的细胞黏附在塑料培养板或玻璃板上，在添加营养物质和细胞因子的培养基中单层培养。因2D细胞培养技术简洁及高效的特点，得到了生物学家和临床工作者的认同。
然而，2D培养技术按时传代的要求限制了细胞的大规模培养；且因为平板附着的原因，细胞的形态、细胞内部骨架和核形状发生改变，进而反过来影响基因和蛋白质变化。其次，2D培养技术的单层细胞结构，使得培养物有时不能准确再现动物的生理或病理过程。
（二）3D细胞培养技术
1．3D细胞培养： 目前，在体研究主要依赖于构建动物模型，细胞水平则主要基于二维培养条件下的实验研究。然而，经历了100多年的变化之后，研究人员发现在体外进行二维培养的细胞会逐渐改变甚至丧失其原有的性状和形态，结构与功能等方面也与在体环境不同；动物模型则因为耗时长、操作复杂以及价格昂贵等因素限制了大规模开展实验。由于二维细胞培养模型和动物模型应用的局限性，以及其他类似组织工程的相关学科的发展，三维细胞培养技术（three-dimensional cell culture, TDCC）应运而生。
三维细胞培养不同于二维单层培养的核心是细胞与培养环境间相互作用，它指将三维结构不同材料的载体与不同种类细胞在体外进行共培养，使细胞在支架上进行空间立体型生长、分化和迁移，并形成具有一定组织特异性的三维复合结构。三维细胞培养较之二维细胞培养技术可通过改善胞间交流、作用力及构建各种营养因子浓度梯度更大程度地模拟体内环境，使细胞形成类似体内的组织结构，发挥其功能。此外，三维细胞培养还具有直观性可控性特点，可以将简单的体外二维细胞培养技术与组织器官及生物体联系起来，在体内体外实验之间架起一座桥梁。3D细胞培养在肿瘤和药物筛选方面已取得广泛应用，在神经退行性疾病方面，3D细胞培养模型的优势也逐渐吸引了各国研究学者的关注。
2．3D细胞培养技术支架材料： 按照来源不同，可以将支架材料分为天然材料、合成材料及新型复合材料三大类。
天然材料指自然界生长或者形成的材料，大部分为细胞外基质（extracellular matrix, ECM），主要包含蛋白、多糖和蛋白聚糖等物质，在细胞骨架、细胞形态、迁移、分化、增殖等各项生理功能生命活动中扮演重要作用。常见的天然材料有胶原（collagen）、透明质酸（hyaluronic, HA）、纤维蛋白（fibrin）等。
合成材料包括人工高分子材料和人工合成无机材料两类。前者是以石油天然气等为原材料合成的高分子聚合物材料，常见的有聚乳酸（poly lactic acid, PLA）、聚羟基乙酸（poly glycolic acid, PGA）以及它们之间的各种共聚物。人工合成无机材料则是指医用碳素材料、生物玻璃、陶瓷、合金等无机材料。合成材料降解产物为水和二氧化碳，毒性作用小且机械性能可控，是良好的3D支架材料。
天然支架材料和合成支架材料都广泛应用于3D细胞培养中，但是单一材料或多或少都存在缺陷以及局限性，研究者们又开发了新型复合材料。新型复合材料是将几种不同的材料通过物理或化学方法按照不同比例合成的新材料，可以彼此互补，扬长避短，使得细胞可以在最接近生物环境中增殖分化。常见的天然材料复合的有胶原/ 纤维蛋白、丝素蛋白/ 壳聚糖、透明质酸/ 丝素蛋白等，天然材料与合成材料复合的有聚己内酯/ 壳聚糖、聚乳酸/丝素蛋白等。
（三）3D细胞培养在AD中的应用
AD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。该病起病隐匿，呈渐进性发展，主要临床表现为记忆减退、认知能力下降，以及其他神经精神症状及行为障碍，最终导致生活不能自理。据文献报道，65岁以上人群AD发病率为5.14%左右。我国自20世纪80年代进入“人口老龄化社会”，到2025年老年人口将达到2.8亿。2016年文献估计，我国AD患者人数已达800万，到20世纪中叶，AD患者将接近2000万。AD已经严重威胁人类健康，给患者、家庭以及社会都带来了沉重的负担。但是该病发病机制尚未明确，又缺乏长期有效的治疗措施，使得AD的研究一直是全球学者研究的热点与难点。
AD发病机制两大假说分别为“β-淀粉样肽（amyloid β-protein, Aβ）异常沉积”、“Tau蛋白过度磷酸化”两大假说。前者认为，位于人体第21条染色体上的β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein, APP）基因，正常情况下，Aβ生成与降解平衡。当APP基因突变或某些原因导致APP代谢异常时，它被体内的β和γ分泌酶切割，Aβ生成增多，或者降解减少，造成Aβ大量沉积，形成老年斑（senile plaques, SPs）。寡聚肽的Aβ具有神经毒性，可以引发复杂的级联反应，最终导致神经元的死亡。而“Tau蛋白假说”则认为，正常情况下体内Tau蛋白磷酸化和去磷酸化处于动态平衡，当Tau蛋白磷酸化速度大于去磷酸化速度时，体内Tau蛋白含量增加，进而导致疾病的发生。有文献报道，AD发病过程中，存在Aβ在其毒性基础上演变成为Tau蛋白的过度磷酸化以及神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）的级联反应。
1．促进细胞分化： 大脑的神秘之处就在于其复杂的神经网络，单一研究某种特定细胞而不考虑各种分化细胞间的相互影响是很片面的。运用3D细胞培养技术，形成复杂的神经网络，可能会给阿尔茨海默病的研究带来新的机会。Puschmann等报告了一种新型电纺丝聚氨酯纳米纤维3D细胞培养模型，可以用于神经网络的体外支持，供神经元在各个方向生长，进而形成比其他培养体系更复杂的神经网络；Park等建立了一种基于3D培养的微流控芯片的体外脑模型，不但形成了更加接近在体状态的神经网络，并且与静态条件相比，Aβ处理后的神经球蛋白生存能力显著下降，神经网络破坏也明显。
2．再现2D培养模型中无法出现的病理过程： AD最显著的两大病理特征即为Aβ沉积形成的老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结，两者之间是否存在关系，这其中又涉及了哪些信号通路，一直都是研究人员关注的热点问题。Zhang等发现只有在3D培养条件下，才可以观察到神经细胞在Aβ寡聚体诱导下，磷酸化的p21激活激酶（pPAK）等其他相关蛋白再分配的病理变化，该过程在传统的2D细胞培养中是观察不到的；Choi等利用ReNcell VM细胞系（ReN细胞）表达APP、PSEN1突变，产生FAD ReN细胞系，再通过3D细胞培养方法，得到一个可以加速神经元细胞分化并形成神经网络的细胞模型，成功再现了Aβ积聚并驱动Tau蛋白胞外聚集的病理过程；Labour等开发了一个3D隔室细胞培养模型，当Aβ聚集体被仿生胶原基质隔开的时候，聚集体对细胞并无毒性，但是当基质孔隙被打开，聚集体与分化的大鼠嗜铬细胞瘤细胞系（PC12）细胞接触，显示细胞毒性，诱导神经退行性过程，作者也进一步指出，该模型可用于研究神经突触聚集体诱导神经元死亡或神经突营养不良的信号通路，探究AD发病的分子机制。
3D细胞培养模型作为一个强有力的体外模型，自诞生之日起就不断取得了很多令人欣慰的成就，尤其在肿瘤及高通量药物筛选方面。但不可否认的是，目前的3D细胞培养技术仍有待提高。越来越多科研人员正在将3D细胞培养模型运用到AD的研究中，并取得初步成果。如何更好地发挥这项技术的优势并应用到其他神经退行性疾病当中去，仍然需要生命科学、材料科学、组织工程学等各学科的专家协作努力。