第二节
阿尔茨海默病的体外模型

AD模型的构建是其病理特征的人为再现，也是抗AD药物筛选和研发的重要平台。相比于体内模型，体外模型在获取和建立上更方便快捷。其高效的操作与数据获取也非常适用于最初的高通量药物筛选。本节以传统“诱导型”AD体外模型为中心，对相关模型的基本原理、主要特征和应用实例等方面进行阐述，以期为相关学者的研究提供更好的参考和指导。此外，随着新技术和新方法的发展，一些新颖的AD体外模型的报道日益增多，本部分对其进行了总结，以便相关学者更好地追踪前沿技术，开阔视野和发散思维。

一、传统“诱导型”AD体外模型

（一）Aβ诱导剂与建模实例

Aβ是由淀粉样前体蛋白（APP）经蛋白酶加工而来的一种小分子多肽，根据氨基酸序列差异可分为Aβ _1～42 和Aβ _1～40 ，Aβ _25～35 则是其25～35位氨基酸残基的活性片段。三者结构分别如图3-2-1所示（Protein Data Bank, http://www.wwpdb.org/）。其中，Aβ _1～42 是疏水性最强、聚集速度最快、毒性最强的一种形式。Aβ级联假说认为，Aβ因疏水而发生异常沉积最终产生SP，引起系列下游级联反应，包括氧化应激、线粒体功能损伤、钙稳态失衡和兴奋性毒性等，进而导致神经元损伤与凋亡，加速AD发生发展。

Aβ _1～42 和Aβ _1～40 ，Aβ _25～35 三者在不同的文献中均有应用，此处以Aβ _1～42 为例介绍Aβ诱导的AD体外模型实例。Liu等和张琴等均采用20μmol/L的Aβ _1～42 作用HT22细胞24h。活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平显著升高，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著降低，多数细胞胞体变圆，突触变短或消失，线粒体膜电位和ATP酶活力下降。Zhong等和Chen等均采用20μmol/L的Aβ _1～42 诱导PC12细胞。细胞内ROS和MDA水平显著升高，SOD、过氧化氢酶（CAT）、GSH-Px活性明显降低，凋亡相关蛋白Caspase-3与Bax/Bcl-2水平显著升高。刘东星采用20μmol/L的Aβ _1～42 作用SH-SY5Y细胞24h，细胞活力显著降低，自噬相关蛋白Atg7、Beclin1与LC3-Ⅱ表达明显减少。此模型适用于筛选降解Aβ和（或）保护Aβ损伤的药物。但值得注意的是，Aβ集聚的原因既可能是先天遗传因素，也可能是后天环境因素导致的代谢异常，单纯通过外源性Aβ诱导可能无法完全模拟实际病因。

（二）D-半乳糖诱导剂与建模实例

D-半乳糖（D-galactose, D-gal）是一种存在于体内的还原糖，在正常浓度下经由D-半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶完全代谢。但在高浓度下，它会被半乳糖氧化酶转化为醛（糖）和过氧化氢，导致大量超氧阴离子和氧自由基的产生，从而诱发氧化应激损害细胞结构和功能，最终产生衰老样变化。高浓度下的D-gal还可以通过非酶糖基化作用于蛋白质或多肽形成晚期糖基化终末产物（AGEs）。AGEs会导致蛋白质发生交联，这种改变会扰乱正常的细胞进程，进而导致细胞功能障碍而加速衰老。

Hsieh等采用40mmol/L的D-gal作用PC12细胞4h后，细胞内ROS水平升高，24h后Aβ与AGEs含量增加，IκB-α 蛋白表达水平升高，48h后抗氧化酶MnSOD活性增加，72h后细胞生长与增殖完全停滞。苗鑫等采用16g/L的D-gal作用PC12细胞40h后，乳酸脱氢酶（LDH）与MDA含量显著升高，cAMP、PKA与BDNF含量、SOD活性均显著下降，p-CREB的入核减少。D-gal作为一种衰老诱导剂，在AD体内模型构建中应用广泛。体外建模在PC12细胞上见有报道，实验人员可进一步筛选造模浓度和作用时间。

此模型适用于筛选抗衰老药物，但此模型也存在一些不足之处，如D-gal诱导的神经细胞衰老只能部分模拟实际的衰老特征与代谢变化，与实际AD发病进程中的神经衰老过程仍存在差距。

（三）冈田酸诱导剂与建模实例

冈田酸（Okadaic acid, OA）是一种海洋生物来源的聚醚类毒素，不溶于水，可溶于有机溶剂。OA是一种有效的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1（PP1）和2A（PP2A）选择性抑制剂。PP1和PP2A在突触可塑性、学习和记忆等各种神经调节机制中发挥着重要的作用，二者的失活会引起Tau的过度磷酸化，导致NFTs的形成，进而损害轴突运输和正常的神经元功能，因此调节Tau的磷酸化平衡是治疗AD的重要途径之一。

Shen等将HT22细胞暴露于80nmol/L的OA下12h，可见细胞生长受到抑制，细胞数量明显减少，细胞间隙明显扩大，Tau蛋白4个位点（S199、T205、T231和S396）的磷酸化水平与p25、p-CDK5蛋白水平均显著升高，同时钙蛋白酶表达与Ca ²⁺ 水平也均升高。Huang等采用175nmol/L的OA处理PC12细胞48h后，β-分泌酶、p-Tau和Aβ ₄₂ 水平显著升高，p-Akt与p-mTOR蛋白水平显著降低，Beclin-1与p-GSK3β蛋白水平显著升高。Ma等采用40nmol/L的OA处理SH-SY5Y细胞8h后，钙蛋白酶被激活，导致Akt的活化，进而引起GSK-3β的磷酸化，最终导致Tau的过度磷酸化。

此模型适用于筛选抑制Tau过度磷酸化的药物，也适用于筛选PP1和PP2A的选择性激动剂。经此模型筛选的抗AD药物靶向性较强，可以为后续研究指明方向。但值得注意的是，Tau蛋白磷酸化位点较多，且稳定性和功能差异较大，药物的后续研究需要特别关注这一点。

（四）谷氨酸诱导剂与建模实例

谷氨酸（glutamate, Glu）是一类常见的酸性氨基酸，难溶于水，极易溶于甲酸。实验中常用L-谷氨酸（L-Glu）进行造模。需要注意的是Glu难溶于水，因此建议使用其单钠盐。Glu是动物脑中一类重要的氨基酸类兴奋性神经递质，在大脑中的浓度受到严格控制。正常浓度下，作为线粒体形成ATP的主要供能物质之一，Glu的氧化可以清除强氧化性物质，保护细胞免受氧化损伤。然而，高水平的Glu会激活相关谷氨酸受体（如NMDA受体），导致Ca ²⁺ 内流，同时也会导致线粒体功能障碍和氧化应激相关蛋白的异常表达。谷氨酸能假说认为，Glu调节失衡是AD发生的重要诱因。

Zhang等和Wang等均采用25mmol/L的L-Glu作用HT22细胞24h。可见细胞凋亡增加，线粒体膜电位耗散，ROS积聚，Bcl-2表达显著降低，Bax、Bad、Caspase-3和Caspase-8表达显著升高。Hu等采用20mmol/L的L-Glu作用PC12细胞24h，细胞活力下降，细胞凋亡率增加，细胞增殖G1期发生阻滞，细胞内ROS积累并发生Ca ²⁺ 超载和线粒体膜电位去极化，Bcl-2表达明显降低，Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达显著升高。Zhu等采用20mmol/L的L-Glu作用SH-SY5Y细胞24h, ROS生成增加，Bax、Caspase-3和Caspase-9上调，Bcl-2下调，同时细胞色素C（胞浆）的释放增加。

此模型适用于筛选抗神经兴奋性异常的药物。从作用机制角度来说，此模型与胆碱酯酶抑制模型类似，因此筛选出的药物在抗AD的靶向性和安全性方面需要进一步研究。

（五）脂多糖诱导剂与建模实例

脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是革兰阴性菌细胞壁中特有的一种成分。作为一种炎症诱导剂，LPS可激活各类免疫细胞。小胶质细胞是大脑中最主要的常驻免疫细胞之一，参与免疫监视和调节中枢神经系统稳态等多个过程。小胶质细胞受到LPS刺激后，释放促炎介质（如NO）和促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等）而迅速启动神经炎症反应。神经炎症早已被证实与AD的发生发展密切相关。因此，调节小胶质细胞过度激活介导的神经炎症被认为是治疗AD的潜在策略之一。

Askari等采用1μg/mL的LPS作用原代小胶质细胞24h后，NO、iNOS和ROS的表达水平显著升高，促炎因子TNF-α、IL-1β、PGE2和抗炎因子IL-10的表达均显著升高，而谷胱甘肽（GSH）含量显著降低。Zhao等采用1μg/mL的LPS作用BV-2小胶质细胞12h后，致炎细胞因子（TNF-α、PGE2、IL-6、IL-1β）和氧化应激（ROS、MDA）水平明显升高。

此模型适用于筛选抗神经炎症的药物，其中，小胶质细胞是参与神经炎症的主要细胞之一。因此，筛选出的药物可进一步研究其对小胶质细胞的调节作用，同时涉及AD的相关指标需要进一步检测与验证。

（六）铝诱导剂与建模实例

常用铝剂包括氯化铝（AlCl ₃ ）和麦芽酚铝。麦芽酚铝是一种具有良好膜透性、水溶性和亲脂性的电中性铝络合物，相比于AlCl ₃ ，麦芽酚铝不易水解成Al（OH） ₃ ，能更稳定持续地释放铝离子，产生更显著的神经毒性，因此更适合进行铝毒性负载的AD模型构建。研究发现，铝毒性与氧化应激、线粒体功能障碍、金属离子代谢紊乱、神经炎症、微管改变、胆碱能障碍、轴突运输受损和Aβ聚集等过程都有关联。因此铝离子是AD等神经退行性疾病的发生发展重要诱因之一。

Bharathi等采用150μmol/L和400μmol/L的麦芽酚铝分别诱导PC12细胞和SH-SY5Y细胞24h，二者细胞内线粒体膜电位显著降低，ROS水平和细胞凋亡率显著升高，同时SH-SY5Y细胞内p-ERK、Aβ _1～42 、Bax、Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β等指标均显著升高。Wang等采用500μmol/L的麦芽酚铝分别诱导PC12细胞和SH-SY5Y细胞48h，二者细胞凋亡率和细胞内LDH释放率、ROS水平、MDA含量均显著升高，Bax、Caspase-3和细胞色素C（胞浆）表达水平也均显著升高，SOD和GSH-Px活性均显著降低，扫描电镜可见凋亡小体明显增多。

此模型适用于筛选抗铝神经毒性的药物。遗憾的是，铝剂诱导的AD模型不能模拟Tau蛋白磷酸化过程。此外，在铝剂诱导的AD体内模型中，造模过程较长（一般为数月）。因此，在体外模型中实际上也需要关注铝剂诱导时间对实验结果的影响。

（七）过氧化氢诱导剂与建模实例

过氧化氢（hydrogen peroxide）是一种强氧化剂。自由基假说认为，物理或化学诱因导致的ROS（包括H ₂ O ₂ 、O ₂ ^- 、OH等）过度积累，会打破氧化还原稳态，进一步诱发脂质过氧化反应，将自由基反应放大，从而导致细胞结构和功能损伤，最终造成神经元凋亡。自由基引起的氧化应激与AD的发病进程密切相关，目前已经成为研究的焦点之一。

Kushairi等采用250μmol/L的H ₂ O ₂ 诱导HT22细胞6h，细胞存活率显著下降，ROS含量显著升高，线粒体膜电位显著降低，GSH和ATP水平显著降低，Bax、Caspase-3、Nrf2表达水平明显升高，NQO1和HO-1表达水平明显降低。Liu等采用200μmol/L的H ₂ O ₂ 诱导PC12细胞24h，细胞存活率下降，凋亡率上升，Bcl-2表达降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9水平显著增加。Huang等采用200μmol/L的H ₂ O ₂ 诱导SHSY5Y细胞24h，细胞存活率显著下降，LDH泄漏率显著升高，ROS含量显著升高，Bax、Caspase-3表达水平明显升高。

此模型适用于筛选抗神经氧化损伤的药物。但氧化应激损伤广泛介导各种神经系统疾病，因此筛选出的药物在抗AD的靶向性和有效性方面需要进一步深入研究。

（八）其他建模实例

近年来，有研究人员采用多种诱导剂联用来构建AD体外模型。如Wei等和魏恒云等均采用25μmol/L的Aβ25～35和10mmol/L的D-gal联合作用于PC12细胞48h。细胞凋亡率明显升高，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达显著升高，细胞色素C（胞浆）释放明显增加，SOD活性和GSH含量显著下降，镜下可见细胞聚集、核固缩和碎裂等现象。Buendia等采用1μmol/L的Aβ _25～35 和3nmol/L的OA联合作用于SH-SY5Y细胞20h，细胞存活率显著降低，细胞核固缩与轴突回缩，微管结构被破坏，导致Tau过度磷酸化与Aβ聚集。这些复合模型可更好地模拟AD特征，也为相关研究提供了更多的选择。

造模剂的选择一般是基于AD现有的某种AD发病假说的，而细胞系的选择是多样的（图3-2-2）。常见检测指标包括细胞存活率、细胞凋亡率、LDH泄漏率、Ca ²⁺ 水平、线粒体膜电位、炎症因子（IL-1β、TNF-α、PGE2、IL-6等）、凋亡相关蛋白（如Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax）和氧化应激指标（如ROS、SOD、CAT、MDA、GSH、GSH-Px）等，非Aβ诱导时还可检测Aβ水平，OA诱导的体外模型可另外检测Tau不同位点磷酸化水平。

值得注意的是，不同造模剂的具体配制方法、造模浓度和作用时间在实际应用中差别很大，不同文献报道不尽相同，即使是相同细胞系也存在一定差异，这可能与不同研究者实验室所用细胞的反应敏感程度有关。因此研究人员需要在实际实验中建立剂量/时间-作用曲线进一步确定。

二、新型AD体外模型

近年来，新型AD体外模型层出不穷。总结发现，这些新模型在技术手段和细胞类型上各具优势。通过运用基因改造、荧光成像、新式细胞培养、神经网络信息技术等新方法可以更好地模拟AD病理和分子层面的变化，有利于相关指标的观察与检测，但同时也存在操作要求高、费用昂贵等缺点。现将近年来部分新型AD体外模型报道情况总结如下（表3-2-1和表3-2-2），便于科研人员追踪前沿动态。

新型AD体外模型发展迅速，在各方面多有创新。尽管其优势明显，但模型构建的成本相对较高，短时间内不能大范围推广和普及。未来一段时间内，传统“诱导型”体外造模仍会是主流的实验方法。但单一诱导剂有时候并不能全面地模拟AD的相关病理特征，因此复合模型的构建可能是解决这一问题的有力手段之一。 14Mz4oBYWnzMUAfmphzYMcGLqW6LhWPcrAbW+3Z6a8/bp2Szhrxc+mW22V1DEdtc