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发现存在调节成熟甲状腺和始基中滤泡细胞特异性基因表达的转录因子，为探索甲状腺发育提供了有效的分子遗传学基础。E8.5时原咽内胚层特异性表达NKX2-1/TTF1、FOXE1、PAX8和HHEX [16] 。尽管其他胚胎组织中也有这些因子的表达，但它们的共表达只在前体和已分化的甲状腺滤泡细胞中可见。动物模型的实验表明甲状腺发育中需要NKX2-1/TTF1、FOXE1、PAX8和HHEX的表达 [17-18] 。值得注意的是，除了NKX2-1/TTF1、FOXE1、PAX8和HHEX基因外，其他基因都是丰富存在于甲状腺中，在甲状腺器官形成和功能分化中也是必需的（表3-1）。本章重点关注NKX2-1/TTF1、FOXE1、PAX8和HHEX基因在甲状腺滤泡细胞分化中的特征性作用。
表3-1 小鼠甲状腺发育相关基因的表达和不同阶段产生甲状腺激素能力
NKX2-1/TTF1是一种具61氨基酸-长链DNA-结合同源域的功能位点的转录因子，进行识别、结合特异性DNA序列。从果蝇到人类，都保存着同源域序列。NKX2-1/TTF1最初在大鼠甲状腺细胞系列中，作为能结合特异序列Tg启动子的核蛋白。相关的cDNA随后被复制，对比序列分析表明，NKX2-1/TTF1具有相当程度的Drosophila NK-2级同源域蛋白的同源等级。
NKX2-1/TTF1是NKX2族转录因子的一种，由名为NKX2-1的小鼠单基因和NKX2-1人类基因编码，分别位于12号染色体上和14号染色体长臂13号位 [19] 。该基因由至少3个外显子组成，表达多种转录产物。最丰富的就是短异构体，编码人类42kDa蛋白，长371氨基酸的一个2.3kb mRNA；在肺中，也检测到这种长蛋白。功能性研究表明，同源域只对DNA连接有效，然而反式激活活性存在于两功能位点：N和C分别位于蛋白质的NH 2 和COOH末端。事实上，认为NKX2-1/TTF1的一部分耦合子特异性地结合在N或C功能位点。NKX2-1/TTF1在多个丝氨酸残基被磷酸化。这种翻译后修饰可以调节NKX2-1/TTF1的活性。事实上，让实验小鼠模型隐藏磷酸化NKX2-1/TTF1等位基因，发现甲状腺和肺都存在分化受损现象。
全面地研究了啮齿类动物中NKX2-1/TTF1的表达方式。NKX2-1/TTF1在甲状腺、肺、脑中表达。从小鼠胚胎发育的甲状腺原基（E8.5）中能检出NKX2-1/TTF1 [8] 。有趣的是，NKX2-1/TTF1也出现在第四咽窝后鳃体的上皮细胞中 [14] 。NKX2-1/TTF1在成熟甲状腺滤泡C细胞和滤泡旁C细胞中持续表达。胚胎发育过程中，可在发育中气管和肺中检出NKX2-1/TTF1，然而在成熟个体中，则出现在支气管上皮Clara细胞和Ⅱ型肺泡细胞中。至于脑中，NKX2-1/TTF1在发育的间脑中表达，比如下丘脑区域和从神经垂体发育而来的漏斗 [8] 。NKX2-1/TTF1在成熟下丘脑中的表达是微弱的，但是在青春期前被上调 [20] 。人类胚胎NKX2-1/TTF1的表达途径与小鼠无异，除外人类中检测不出第四咽窝的NKX2-1/TTF1 [1] 。发育甲状腺中，NKX2-1/TTF1是PAX8、HHEX和FOXE1网络的一部分。另外，NKX2-1/TTF1启动子包含FOXE1、FOXE2和Gata6的结合位点及肺发育所需因子。
通过基因靶向实验，研究该转录因子的体内作用。缺少NKX2-1/TTF1，新生小鼠出生后立即死亡，并且存在肺和脑的异常形态生成，缺少甲状腺和整个垂体 [21] 。无NKX2-1/TTF1基因的新生儿中，肺组织表现出缺少正常肺实质囊性扩张结构 [21] 。而且，气管软骨环数量减少不与食管分离。至于脑组织，前脑腹侧区域改变明显，神经垂体和垂体前叶缺失。由于缺少来源于垂体的信号，肾上腺形态发生也受损 [21] 。在无NKX2-1/TTF1胚胎中，甲状腺原基位于正常位置，但腺体的形态生成受损。甲状腺始基在E10时是发育不全的；随后可能由于细胞凋亡而退化。后鳃体经历相同过程，成形，然后在E12时退化 [14] 。因此，NKX2-1/TTF1对早期甲状腺滤泡细胞和甲状腺滤泡旁细胞的作用可有可无。然而，所有形成甲状腺的细胞类型需要NKX2-1/TTF1；缺少这一转录因子，检测不到甲状腺原基。另一类小鼠，只在器官形成中期破坏NKX2-1/TTF1转录因子，表现出不同的表型，呈现甲状腺滤泡萎缩或滤泡细胞数量减少 [22] 。成人需要NKX2-1/TTF1转录因子来完成甲状腺滤泡结构。
细胞增殖与分化是胚胎形成和癌症的标志性现象，研究NKX2-1/TTF1在癌症细胞中的作用可以提供该转录因子其他生物功能。生殖系统的某种突变，产生NKX2-1/TTF1变异蛋白（A339V），在患不伴甲状腺乳头状癌（PTC）的甲状腺肿患者中发现，而其直系亲属存在伴PTC的甲状腺肿病史的患者 [23] 。过度表达变异的NKX2-1/TTF1蛋白，甲状腺细胞增殖加剧，活化周期调节基因，甲状腺特异性基因表达受损 [23] 。
PAX8是转录因子的一员，具有128个氨基酸长的位点可以识别、结合特异性DNA序列的特点。该DNA结合位点叫作配对位点，因为首次发现其在Drosophila分裂基因配对。小鼠的PAX8被认为是发育中甲状腺内表达的蛋白质。深入研究显示PAX8配对位点识别并结合位于Tg和TPO启动子的某单一位点。
编码PAX8的基因位于小鼠的2号染色体上和人类2号染色体长臂12～14号位点的同源基因PAX8上 [24] 。包含由12外显子编码的不同的备选剪接转录物，形成至少6种小鼠和5种人类的不同的转录物。生成的所有异构体形成配对位点，位于邻近氨基酸末端和羟基端区域。PAX8a，最丰富的异构体，是一种457个氨基酸长的小鼠蛋白、450个氨基酸长的人类蛋白。
PAX8在肾脏、神经系统、甲状腺中表达 [24] 。在发育中的肾脏，早期，PAX8在生肾索和中肾小管中表达；其后出现在后肾皮质中，而成熟肾脏中在髓质中检测到PAX8。胚胎中，PAX8仅在延髓中一过性地表达，通过Neura管，耳泡全长，并在中脑 -后脑边界，但在E12.5不再检测得到。至于甲状腺，PAX8在甲状腺滤泡细胞中及腺体形成的早期阶段的前体中表达。报道称3周大小并性腺发育成熟的雌性小鼠中，PAX8在子宫上皮、输卵管及阴道腔上皮中表达。雄性小鼠附睾上皮中发现PAX8 mRNA强烈表达 [25] 。人类PAX8在E32时，在发育中甲状腺、肾脏、耳泡、中枢神经系统检测到，也存在于子宫内膜的腔上皮和腺上皮中 [1] 。
培养中的甲状腺细胞 [26] 进行研究，表明TSH通过cAMP介导的机制调节PAX8合成。然而，在废除TSH/TSHR信号的变异小鼠中不存在PAX8表达降低。
分析PAX8-/-小鼠为研究该转录因子体内途径作用提供独特的可能性。无PAX8幼犬在无任何明显脑或肾缺陷情况下出生。相反，甲状腺表现出缺少甲状腺滤泡细胞的退化结构，几乎完全由产降钙素C细胞组成。受严重甲减影响的动物，表现出生长延迟并在生后2～3周死亡。这些小鼠由于甲状腺素的管理才得以存活。然而，用T 4 处理无PAX8动物，生殖系统发育受到严重影响，子宫表现为仅剩子宫肌层缺少内膜结构阴道，阴道口完全不存在。在无PAX8胚胎中，甲状腺原基正常形成，突出于内胚层，并移行入间质内。缺少PAX8，其他转录因子如FOXE1和HHEX，在甲状腺细胞前体中被抑制 [2] 。在E12.5时，检测不到甲状腺滤泡细胞。在无PAX8小鼠中，成熟甲状腺滤泡细胞缺如，难以展现该因子控制成熟甲状腺功能的作用。一种新的小鼠品系，PAX8在腺体发育后期被破坏，出现严重的甲减、腺体发育不良及甲状腺特异性基因表达降低。因此，动物模型表明，PAX8具有促进甲状腺滤泡细胞存活及分化的双重作用。这些发现与来自研究关于在培养细胞系中获得的数据相一致。
早期研究表明，抑制PAX8会减少由TSH或IGF-1诱导的甲状腺细胞增殖。假设PAX8参与甲状腺细胞存活，在发现PAX8通过上调tp53inp1诱导培养中的甲状腺细胞沉默凋亡，一种参与通过p53介导的凋亡过程。值得注意的是，在发育中的甲状腺，存在一种抑凋亡基因——BCL2，因缺失PAX8表达下调。其他经PAX8控制细胞存活的机制，可通过对癌细胞研究推测出。PAX8诱导端粒酶NA和端粒酶反向转录酶在胶质瘤和结直肠细胞中的表达。而且，表明PAX8控制肾癌细胞生长调节剂E2F1，是一种参与控制细胞周期的蛋白质 [27] 。
至于PAX8的甲状腺滤泡细胞分化的作用，在许多报告中明确地建立。功能性试验表明需要PAX8激活TPO启动子和在较小的程度上激活Tg启动子与NIS增强子 [28] 。而且，PAX8能激活内源基因编码的Tg、TPO和NIS在其染色体位点上表达 [29] 。最近，发现PAX8能够在体外与公认的启动子FOXE1、THOX2和Cad herin-16基因结合 [30] 。最后，通过详细的基因组分析PAX8沉默甲状腺细胞，其他一些基因通过这一因子的识别进行调节，认定PAX8可以被认为是控制甲状腺发育和分化的主要基因。
FOXE1（之前称为甲状腺转录因子TTF2）最初被认为能够在胰岛素、IGF-1或TSH刺激下，结合到Tg和TPO的启动子序列的甲状腺特异性核蛋白。随后，小鼠FOXE1 cDNA克隆，形成该蛋白的突出特点 [31] 。FOXE1属于与Drosophila Forkhead基因同源的，具100个氨基酸长DNA结合位点的翼状螺旋/叉头家族 [32] 。小鼠中编码该转录因子基因位点的正式名称叫FOXE1（位于4号染色体上），而在人类中称为FOXE1（位于9号染色体长臂22号位点）。FOXE1无内含子基因编码磷酸化的42kDa蛋白质 [33] 。该蛋白质具可变长度的丙氨酸的特点，范围从12至17丙氨酸不等。人类中，最常见的FOXE1等位基因包含14个丙氨酸残留。有趣的是，16个丙氨酸的存在似乎与TD的风险呈负相关 [34] 。与此相反，已有报道，丙氨酸长度的拉伸（大于14个丙氨酸残基）和甲状腺癌的风险之间紧密相连 [35] 。
正如NKX2-1/TTF1、PAX8和FOXE1能在甲状腺始基中检测到，其表达产物持续存在于TCF发育全过程以及成熟时。然而，在胚胎过程中，FOXE1具有较宽的表达域。事实上，发育早期，FOXE1在内胚层上皮、咽部始基、咽弓和前肠中，以及一过性的Rathke's囊都有表达。随后，FOXE1在起源于咽部和咽弓的组织中表达，如甲状腺、舌、会厌、腭、后鼻孔和食管。另外，均起源于外胚层的胡须和毛囊中也检测到FOXE1 [33] 。人类中，FOXE1在甲状腺、前肠胚胎胸腺、毛鞘外滤泡，以及青春期前睾丸生精小管中 [36] 都有表达。
对变异小鼠进行研究，发现FOXE1与由PAX8调节的甲状腺小芽和由Shh调节的咽细胞紧密相关 [2] 。值得注意的是，在角质形成细胞中FOXE1是Gli2直接目标，Shh信号的关键介导物 [37] 。在分化的甲状腺细胞谱系中，FOXE1基因的转录由TSH和cAMP及胰岛素和IGF-1严格控制 [31] 。这些数据显示FOXE1在控制激素信号途径与甲状腺特异性基因表达中起到重要作用。发育中甲状腺，这些控制作用看似并非有效，因为缺少TSH、GH及IGF-1，FOXE1表达不受影响 [38] 。
无FOXE1小鼠的分析阐明了该转录因子在甲状腺发育过程中的作用。FOXE1的靶向失活表明纯合FOXE1-/-小鼠中按预期的孟德尔比率出生，但出生48h内死亡。这些小鼠表现为严重腭裂，可能与围产期死亡有关，缺少甲状腺或异位甲状腺，缺乏甲状腺激素和血液TSH水平升高 [6] 。甲状腺形态生成早期阶段，甲状腺原基形成后，FOXE1-/-胚胎不受影响。然而，在E10时无FOXE1的甲状腺前体细胞仍在咽部平面，然而野生型甲状腺始基胚胎开始向最终位置下降。发育的晚期阶段，缺少FOXE1，甲状腺滤泡细胞或消失或形成仍连接于咽部平面的小甲状腺残留物。在这种情况下，细胞能否完成它们的分化程序，由它们合成的Tg的能力决定。这些数据显示，胚胎过程中FOXE1具有特异性控制甲状腺滤泡细胞前体移动的功能，最可能通过控制移动过程中需要的靶向基因进行调控，但是FOXE1与甲状腺原基特化和分化无关。此外，FOXE1可能与甲状腺滤泡细胞的存活有关，因为在许多无FOXE1胚胎中，甲状腺始基消失 [2, 6] 。
细胞培养系统的功能性研究表明，FOXE1可以通过一个位于蛋白质的羧基端的抑制位点表达特异性转录因子抑制剂的启动子 [39] 。也表明FOXE1与转录因子NF1/ CTF相互作用，增强由TSH或胰岛素刺激的TPO表达。近日，在基因组范围内筛查FOXE1沉默甲状腺细胞的作用，发现Duox2和NIS是FOXE1转录目标。尤其是，FOXE1激活NIS表达和压抑Duox2启动。然而，仍然很难界定该基因在腺体中的生理功能，因为无FOXE1新生儿在出生时死亡。至于在其他组织中的作用，体外实验表明，FOXE1是能够结合Msx和TGFβ3基因的启动子并激活它们的表达。突变小鼠的研究证实了这些论据。事实上，无FOXE1胚胎中，Msx和TGFβ3基因在腭突中下调。而且，在Hairpoor小鼠中（遗传性少毛症小鼠模型），皮肤和角质形成细胞缺少FOXE1基因导致Msx表达下调。
HHEX（之前被认为是为造血表达同源异形盒的Hex或为富脯氨酸的Prh）是首先在多能造血干细胞确定了包含同源结构域的转录因子。明确地表明HHEX由包括甲状腺在内的其他组织表达 [16] 。HHEX由叫作HHEX的小鼠基因和HHEX的人类基因编码，分别位于19号染色体和10号染色体长臂23、32号位点。该基因包含4个外显子编码——长270个氨基酸的蛋白质。HHEX是一种含同源异型框孤立基因，因为其同源域顺序，负责与DNA结合，显示出其相对于其他同源域的区别。同源域外部，HHEX包含一个N-端富脯氨酸区域以及一个C-端酸性区域。这两个区域可能参与抑制靶向基因转录的作用。
小鼠胚胎中，HHEX在始基中表达较早，而后在确定的内胚层表达。在E7.0时，在发育中的血岛中检测到HHEX，在E8.5～E9.0时，在腹侧前肠内胚层中检测到；在E9.0时，在发育中脉管系统内皮和心脏中检出。HHEX是甲状腺细胞的早期标志物，因为早在E8.5时甲状腺原基中已有表达，同时NKX2-1/TTF1、FOXE1和PAX8尚未能检出。成人中，除了甲状腺，HHEX在肝脏和肺中持续表达。
分析变异小鼠表明，在许多发育过程中完全需要这一转录因子。HHEX-/-胚胎在妊娠中期死亡（E13.5～E15.5）并表现出肝脏、前脑、心脏和甲状腺形成受损 [40] 。在无HHEX胚胎中，甲状腺前体细胞出现并表达NKX2-1/TTF1、PAX8和FOXE1直到E9。在E10时甲状腺始基由一些既不表达NK X2-1/TTF1也不表达FOXE1或PAX8的细胞组成 [40] 。因此，HHEX保证甲状腺滤泡细胞前体生存并维持FOXE1, NKX2-1/TTF1和PAX8的表达。至于NKX2-1/TTF1、PAX8和FOXE1，一只条件性敲除小鼠会成为阐明HHEX在成熟甲状腺中的作用的有效工具。分化型甲状腺细胞的研究表明，在网络限定的HHEX和其他甲状腺特异性转录因子是复杂的。HHEX看似由NKX2-1/TTF1调节，而且HHEX的过度表达部分地抑制了Tg启动子的活性。这些数据与从其他系统得出的报告相同，与HHEX是甲状腺细胞转录抑制物的假设一致。
分析Titf1、HHEX、PAX8和FOXE1表型基因敲除的小鼠，发现这些转录因子之间往复调节的相互作用网络十分突出 [2] 。在甲状腺发育的早期阶段，Titf1、HHEX和PAX8最初的表达看似相互独立互不干扰，因为缺少任一基因都不会影响其他的表达。与此相反，PAX9紧密控制FOXE1的表达。在E10时，甲状腺基板中，每个基因互相控制维持其他基因的表达。FOXE1似乎位于该调节网下游，因为仅在Titf1、HHEX和PAX8同时出现时才表达，然而在无FOXE1小鼠中，Titf1、HHEX和PAX8能在甲状腺小芽中准确地表达。有趣的是，人类甲状腺表达NKX2-1/TTF1和PAX8优先于FOXE1的表达 [1] 。级联反应在进化过程中被保留。斑马鱼中，在甲状腺早期发育阶段，HHEX、NKX2-1和PAX2-1（可以媲美鼠科动物PAX8的作用）不依赖于彼此的表达，而在后一阶段中，每个基因的表达需要其他基因的存在 [41- 42] 。
该调节网络至少是部分地总结了在转录水平调控相互作用的结果。PAX8是NKX2-1/TTF1靶向基因，NKX2-1/TTF1也是PAX8的靶向基因。HHEX启动子由NKX2-1/TTF1和PAX8共同激活 [43] 。最终，自动调节环路有助于维护NKX2-1/TTF1、PAX8和HHEX的表达，因为每个因子刺激其自己的启动子的转录。另外在该转录网中，NKX2-1和PAX8的物理及功能的相互作用已被证实。NKX2-1/ TTF1和PAX8形成一蛋白复合物并且配合激活Tg启动子。这两类因子相互配合作用已在体内实验中被证实。事实上，对于NKX2-1/ TTF1和PAX8等位基因的双杂合缺陷小鼠表现出以甲状腺发育不良为特点的严重甲减，然而PAX8或NKX2-1/ TTF1单杂合缺陷不表现出甲状腺形态生成缺陷。
这两种蛋白质之间的功能相互作用的极度相关性，通过发现聚集小鼠胚胎干细胞过度表达PAX8和NKX2-1/TTF1（仅单一因子是不够的）能够形成甲状腺特异性基因（如TSH受体、Tg和NIS）的甲状腺滤泡类器官得到强烈支持。值得注意的是，甲状腺滤泡类器官，一旦移位，移植到肾被囊下，能够解决放射性碘切除甲状腺引起的甲状腺激素缺乏。因此NKX2-1/TTF1和PAX8在多能细胞中的同时出现使功能性甲状腺滤泡细胞基因本体论重演。尽管这些数据具有十分重要的意义，没有为致甲状腺原基中形成特定当下表现（即NKX2-1/TTF1和PAX8出现事件）提供任何有效信息，依旧是甲状腺发育研究中最重要且悬而未决的问题之一。