第三节
肾纤维化的监测与评估

肾脏纤维化是肾脏病慢性化的重要病理改变，纤维化程度越重，预后越不好，因此评估肾脏纤维化程度，对临床判断预后具有十分重要的意义。病理医师通常将纤维化进行分期，分期信息或称慢性指数，主要包括活检组织内球性硬化肾小球的比例和肾小管萎缩及肾间质纤维化程度。在日常病理工作中，计算穿刺组织内硬化小球的比例不难办到，但准确测定肾间质纤维化程度确非易事。观察马松染色切片现已作为视觉判定肾纤维化的金标准，但研究显示该方法重复性差。几种计算机辅助图像分析技术已被用于评估肾间质纤维化，包括马松染色切片图像分析、天狼星红染色切片图像分析以及偏光显微镜下观察Ⅰ、Ⅲ型胶原、胶原免疫组化染色（特别是Ⅲ型胶原）等。肾纤维化评估方法主要是测定胶原沉积量，可分为形态测量、生化测量和标记物的分子测量。

一、形态测量

形态测量可分为借助显微镜的目测法和计算机图像分析法。待检组织切片先经特殊染色后方可观测分析。常用的染色方法有马松三色法、天狼星红染色法、V-G染色法和胶原的免疫组化染色法，其中马松染色应用最普遍。对于有经验的病理医师，即使用常规的苏木素伊红染色，镜下也能初步判断纤维化程度。

1.目测法

显微镜下根据肾纤维化区域占全部组织的面积比来判定肾纤维化程度。一般分为4级，无纤维化为0级；纤维化面积≤25%为1级（轻度）；纤维化面积≥25%，但≤50%为2级（中度）；纤维化面积＞50%为3级（重度）。此法虽简便易行，应用普遍，但需有一定的病理知识，且为主观方法，所以重复性较差，易出现观察者自身及不同观察者之间的差异。

2.计算机图像分析法

该方法是把切片的数码照片放到电脑上，操作者手工确定纤维化区和非纤维化区，然后用小程序即可计算出纤维化面积百分比，但仍然需要专业知识去判断一个特定区域是否有间质纤维化。确定纤维化的一种方法是用免疫组化法标记间质Ⅲ型或Ⅳ型胶原，其他方法前已述及。如果背景浅淡可以忽略，数码照片有足够的对比度，电脑就能以单一阈值识别阳性区域，并计算出体积分数。近年，天狼星红染色也逐渐被人们用于肾纤维化测量，计算机可通过识别切片的红色程度来测量胶原，或用偏光显微镜观察天狼星红切片，因为胶原出现强折光，故亦可以检测之。在单一实验室，这些方法有较好的重复性，所以得到广泛应用。合适的计算机宏指令程序一旦运行，不到2分钟即可测完一个标本。值得注意的是，不同批次染色切片重复性可能有显著改变。不同实验室天狼星红染色强度差异相当大，折光强度似乎完全取决于切片厚度。正因为如此，一个实验室的重复性好不能代表不同实验室间重复性好。

二、生化测量

羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）是机体胶原蛋白的主要成分之一，在正常胶原蛋白中含量约13.4%，在弹性蛋白中含量极少，而在其他蛋白则不存在。因此，不同组织中HYP含量可作为衡量其胶原组织代谢的重要指标。检测原理为：试样在盐酸溶液中水解，释放出经脯氨酸，经氯胺T氧化，生成含有吡咯环的氧化物。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长560nm处测定吸收值。目前国内外有多人报道了羟脯氨酸的测定方法，但组织需要量和样品测定体积均较大，不适合进行肾穿刺组织检测。此外，在测定过程中还须注意以下影响因素：①活组织含水量：炎症时组织易发生水肿，直接称重测定容易产生误差，需先将组织脱水。②水解的温度和时间：用高压法（120℃）酸解所需时间短，较容易保证酸解完全并且HYP不会被过于破坏。③测量体系中pH的影响：柠檬酸缓冲液的缓冲能力很强，可以在一定程度上中和样品pH差异，但是当样品pH极性过强超出柠檬酸的缓冲能力时，会影响结果测定。所以在酸解完成以后应先测定溶液pH，然后用NaOH将其滴定到中性。④显色温度：显色时温度越高则需要的显色时间越短。⑤酸解产物过滤对反应的影响：采用离心的方法去除酸解过程中产生的残渣，剩余残渣量很小，并在检测中进一步稀释，不会对检测造成影响。

三、分子测量

随着现代生物学的发展，快捷、半自动的基因或蛋白测定方法已经建立，使肾纤维化分子测量成为可能。分子测量的关键是有特异性的标志分子，其实胶原就是关键分子，也是必测分子，前述的胶原免疫组化染色结合图像分析其实也是一种分子测量。但仅测胶原还不够，因为我们不仅要了解某个时间点的胶原沉积量，还要看肾纤维化发展趋势。即使只选择胶原作为一种检测肾纤维化指标，也会遇到麻烦，因为胶原有多种类型，每种类型又不同。α链的基因产物，检测其中一种不一定能反映其全貌。另外，胶原沉积的控制十分复杂，不仅受合成的影响还受降解的制约，降解酶活性又受活化因子和抑制因子的影响。

肾纤维化的推动因素主要是组织持续损伤、活化的肌成纤维细胞数量增多和持续的炎症反应。其中组织损伤是肾纤维化的始动因素，活化的肌成纤维细胞是细胞外基质的主要来源，而炎症反应既可以引起组织进一步损伤，又通过多种炎症介质使其他细胞活化为肌成纤维细胞。在慢性进展性肾病中，缺氧是组织持续损伤的主要原因，检测缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor- 1α，HIF-1α）可了解组织细胞缺氧程度；平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，a-SMA）是肌成纤维细胞的主要标志，检测其可了解此类细胞的量；转化生长因子-β（transforming growth factor，TGF-β）为纤维化最主要促进因子；肾纤维化组织内浸润的炎细胞以淋巴细胞、巨噬细胞为多，其中CD4 ⁺ T细胞和CD11b ⁺ 巨噬细胞促进病变发展。近期研究发现Toll样受体-4（toll-like receptor-4，TLR4）除了介导天然免疫外，还促进肾成纤维细胞聚集，加速肾小管间质纤维化。因此检测HIF-1α、a-SMA、TGF-β、TLR4、CD4 ⁺ T和CD11b ⁺ 可能有助于了解肾纤维化发展趋势。就目前而言，检测这些分子可用免疫组化法，也可用原位杂交法，还可用western blot法，比较之下，尽管也存在假阳性、假阴性，仍以免疫组化法更便捷、实用。不仅可以了解表达强度，而且可以观察表达部位。 PiHT4oO3+SXHoT5BNijOxjmapDGJAwlJC4hk9IQ4C0czT7Q49xudrRgORJ2H9ZnW