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国门洞开之后，幕府选择了避免盲目攘夷的外交方针，但缔约开港导致国内形势急剧变化，幕府与朝廷、雄藩的力量对比逐渐逆转。尊王攘夷风潮应运而生，列岛陷入动乱的漩涡。从培理舰队来航到萨长结盟，尊王攘夷运动经历了以下发展阶段：
1853年6月，前来闯关的培理舰队刚刚离开日本，首座老中阿部正弘通报了美国总统的国书，破例征询朝廷和雄藩的应对之策。群言堂取代一言堂，朝廷、雄藩与幕府并列为影响局势的三种势力。诸藩的中下级武士活跃，出现“处士横议”的新景象。“处士”，即有德才而未入仕者，系指中下级武士；“横议”是指其不遵守身份等级的政治规则，激烈评论时政。此时的处士们尚难以突破藩界的束缚，缺乏横向联系，多半追随各自的藩主，奔波于雄藩与朝廷之间，注重游说公卿，坐而论道，体现了尊攘运动兴起时期的特点。
萨摩藩的西乡隆盛、大久保利通、小松带刀和长州藩的吉田松阴、桂小五郎等，皆为处士横议的活跃人物。受培理舰队来航的刺激，1853年吉田松阴接连越级向藩主毛利敬亲进呈《将及私言》《急务策》《急务条议》等建议书。1854年，吉田再进《海战策》，力主充实武备，锁国攘夷。吉田对幕府避战求和策略强烈不满，认为“天下乃天朝之天下，即天下之天下也，非幕府之私有”，希望幕府率领天下诸侯雪耻、慰奉宸襟。
在此期间，老中阿部正弘、堀田正睦等幕府当权派相对开明，注意协调与朝廷、雄藩之间的关系，对处士横议尚能给予一定程度的容忍，延缓了爆炸性局势的到来。幕府任命对外持强硬立场的水户藩前藩主德川齐昭出任主管国防的海防挂参与，给尊攘派带来施展抱负的希望。从总体上看，横议的处士们虽然活跃且言辞激烈，但不过是体制内的反对派。幕府与尊攘派尚能在维持现存的幕藩体制的框架内，彼此保持克制，局势相对稳定。
1858年4月，彦根藩主井伊直弼就任德川幕府的最后一任大老，任内推行强化幕府权力的强硬政策。井伊不顾雄藩大名的反对，5月，内定德川庆福为世子，6月，予以宣布。井伊还无视天皇的意志，自行批准《日美修好通商条约》，罢免老中堀田正睦、松平忠固等，提拔太田资始、间部诠胜、松平乘全等亲信接任老中。7月，德川庆福继任第14代将军，改名德川家茂。井伊以快刀斩乱麻的独断方式，迅速处理了条约“敕许”和将军继嗣等久议不决的难题，激起尊攘派公卿、中下级武士等体制内反对派的激烈反对，水户藩前藩主德川齐昭、越前藩主松平庆永、尾张藩主德川庆恕、一桥家家督德川庆喜等当面指责井伊对朝廷失礼。
刚愎自用的井伊早已对反对派感到不耐烦，决心动用铁腕手段予以回应。1858年10月至1859年11月，一系列镇压措施陆续出台。对尊融法亲王（久迩宫朝彦亲王，通称中川宫），前关白鹰司政通和16名朝臣，以及“一桥派”大名德川齐昭、德川庆喜、松平庆永、岛津齐彬、山内容堂等分别给予退隐、终身软禁、蛰居思过等处罚。川路圣谟、水野忠德、岩濑忠震、永井尚志等主管外交的十几名能吏受到谨慎、降职等处罚，老中久世広周、寺社奉行板仓胜静等被罢免。井伊还下令将京都、长州、越前、水户等处被捕的处士押解至江户审判，勒令水户藩家老安岛带刀切腹谢罪，处死吉田松阴、桥本左内、赖三树三郎、鹈饲幸吉等；梅田云浜在狱中被拷打致死，梁川星岩被掘墓斩尸；西乡隆盛、僧海月等被押回藩里严加处置。在此期间，受到处罚和被牵连的公卿、大名、幕吏、处士等多达百余人，吉田、桥本等8人被斩首，史称“安政大狱”。
面对井伊直弼的血腥镇压，一桥派的大名、公卿等上层人士沉默下来，尊攘派的中下级武士们却铤而走险，殊死抵抗。特别是在“安政大狱”镇压中备受打击的水户藩志士，率先以暴力回击镇压。1860年1月，大老井伊直弼勒令水户藩上缴诏书，此举不啻火上浇油。围绕着缴诏还是奉诏，水户藩武士分成对立的派别，展开激烈的党争。在幕府压力下，德川齐昭交出了诏书。水户藩的激进派决心刺杀大老井伊，以示决绝。
3月3日，水户藩的金子孙二郎、关铁之介等17名脱藩浪士与萨摩藩浪士有村次兼清实施刺杀行动。是日，风雪交加，井伊直弼在卫队的簇拥下，前往将军府邸祝贺节日。当井伊乘坐轿子将至樱田门外时，按照事前的密谋，森五六郎手持诉状拦住轿子喊冤，黑泽忠三郎乘机冲上来用手枪射击乘轿。以枪声为号，埋伏在樱田门外周边的志士们一拥而上，与猝不及防的井伊卫队殊死拼杀。萨摩藩浪士有村将井伊从轿内拖出，当场砍死。在这次史称“樱田门外之变”的刺杀行动中，参与的志士除增子金八、海后磋矶之介逃脱外，其余16人牺牲殆尽。位高权重的幕府大老在光天化日下横尸街头，为德川幕府建立以来所仅见，幕府的权威扫地。
中下级武士用以暴易暴的极端手段，震惊了日本。参与刺杀行动的志士们的《斩奸趣意书》痛斥井伊违敕缔约、厉行镇压，破坏了天皇“安定国内，公武合体以确立永久之基，不受外夷之侮辱”的诏敕，已经成为“天下巨贼”；故实行“天诛”，实现“以天皇的圣意为依据，使幕府政治回归正道，申明尊王攘夷之大义”。
3月，磐城平藩（位于今福岛县）藩主、若年寄安藤信正出任首席老中，关宿藩（今千叶县境内）藩主、寺社奉行久世广周出任老中，形成“安藤—久世政权”。安藤和久世等温和派坚持对外开放方针，对内纠正井伊直弼的强硬立场，转而推行靠拢天皇朝廷、密切朝幕关系的“公武合体”政策，“公武合体派”应运而生。
4月，安藤—久世政权请求朝廷同意第14代将军德川家茂迎娶皇妹和宫，试图通过将军与皇室的政治联姻，压制躁动的尊攘派。孝明天皇对幕府的交换条件并不满意，遂以和宫已同炽仁亲王订婚为由，予以婉拒。6月，幕府处罚井伊派，解除对一桥派大名和公卿的处罚，释放政治和解的善意。同时，向朝廷表态将采取废约攘夷行动，满足了天皇的要求。10月，孝明天皇同意和宫解除婚约，下嫁德川家茂。安藤—久世政权实现了“和宫下嫁”“公武合体”的目标，继而兑现“废约攘夷”的承诺。
1861年3月，幕府通告法国、荷兰、英国、美国和俄国，表示江户、大坂开市和兵库、新潟开港推迟7年。担任过英国驻上海领事，现任驻日公使阿礼国（Rutherford Alcock）对此表示理解，建议幕府派遣使节团前往欧洲向各缔约国作出说明。10月，在公卿中山忠能、岩仓具视等陪同下，和宫下嫁的行列向江户进发，40余个藩参与护送和沿途警卫。11月，和宫一行抵达江户。将军与皇妹的大婚在即，公武合体派一时占了上风。
雄藩闻风而动。1861年5月，长州藩直目付长井雅乐提出以“公武合体”为基调的“航海远略策”。长井认为“当今急务为上奉朝廷幕府，下凝武士庶民的精神，寻求兴亡之策”；为此，需要“朝廷和幕府冰释以往所有隔膜，迅速开展航海，振武威于海外。朝廷严敕命幕府尽征夷职责，幕府专心遵奉敕命，命令诸藩”，即“朝廷提出国是远略，幕府遵奉执行，正君臣位次，海内易于和谐为一体；海内和谐，多造军舰，振奋士气，皇国压倒五大洲则易于反掌。”
长井雅乐的建议受到藩主毛利敬亲的赞赏，以此为长州藩的“藩论”，命其游说朝廷和幕府。5月，长井前往京都活动，“航海远略策”强调的朝廷发布敕令，幕府遵奉执行的君臣名分论，令天皇朝廷颇为受用。长井又向幕府提交了建议书，“航海远略策”的公武合体与开港贸易等主张适合幕府的方针，首席老中安藤欣然接受。
尊攘派展开反击，力图夺回主导地位。1860年2月，接连发生英国公使馆资深译员日本人传吉遇刺、荷兰船长鲍斯在横滨遇害等事件。在荷兰领事抗议下，幕府首次对外赔偿。此后，法国公使馆的意大利籍雇员又被杀伤。幕府穷于应付，狼狈不堪。7月，在停泊于品川海面的长州藩洋式军舰“丙辰丸”上，桂小五郎与水户藩的西丸带刀订立的水户、长州“破成盟约”（“丙辰丸盟约”），约定共同驱逐“夷狄”、扫除幕府“通敌”奸吏，尊攘派志士超越藩界、横向缔约联合。1861年1月，美国驻日公使馆翻译官修斯肯在返回使馆途中，被浪人所杀害。驻日英法公使和荷兰领事联合抗议，幕府再次予以赔偿。2月，俄国军舰“波萨得尼柯号”强行在对马岛芋崎浦停泊，水兵登陆，建造营房，准备永久占领。对马藩和幕府几经交涉，俄舰拒绝撤离并与岛民发生武力冲突。7月，两艘英国军舰驶入对马近海，迫使俄舰在8月撤离，史称“对马事件”。
受“对马事件”刺激，尊攘派加大袭击力度，乘机打击公武合体派。1861年5月，水户藩有贺半弥等14名尊攘派浪人冲进英国公使馆临时所在地东禅寺，袭击公使阿礼国，公使馆秘书和驻长崎领事负伤，阿礼国侥幸逃脱。尊攘派浪人多半非死即伤，震惊舆论，史称“第一次东禅寺事件”。幕府急忙向英国道歉，给予赔偿。12月，幕府派遣身兼勘定奉行和外国奉行的竹内保德为首的遣欧使节团，访问英国、法国、荷兰、普鲁士、葡萄牙、俄国等国，谈判推迟开港、开市日期，但进展迟缓。
1862年旧历正月十五日上午8时，首席老中安藤信正在50名卫士护卫下，前往将军居城西丸祝贺上元佳节。行至坂下门时，一男子直奔乘轿而来，拔枪射击，从道路两旁又冲来5名刺客挥刀杀向乘轿。安藤信正的卫士死战不退，6名刺客被卫士全部杀死。混战中，背部中刀的安藤赤足跳出乘轿，夺路而逃，史称“坂下门外之变”。刺客为水户藩浪人平山兵介等6人，他们臆断安藤促成和宫下嫁是将皇妹扣为人质，迫使天皇批准条约，若遭拒则废其帝位。安藤带伤逃离，被政敌指责为临阵畏缩，此外，他在女色、受贿等问题上又受到追究，4月引咎辞职。5月，久世广周亦被罢免，幕府威信扫地，极端被动。
“坂下门外之变”过后，举国汹汹，尊王攘夷的狂热持续升温。公武合体派也在加紧行动，1862年2月，皇妹和宫与第14代将军德川家茂的大婚隆重举行。5月，日英订立《伦敦备忘录》，以日本取消贸易限制、开放对马港并降低部分商品进口关税为交换条件，英国同意将江户、大坂开市和兵库、新潟开港推迟5年。同月，负责警卫英国使馆的松本藩武士伊藤军兵卫在袭击代理公使尼尔（Neale）、杀害2名英国卫兵后，在警卫室剖腹自杀，史称“第二次东禅寺事件”。幕府照例又是一通忙乱，赔礼道歉，协商赔偿。闰8月，参照《伦敦备忘录》的规定，日荷、日法、日俄之间也订立了类似的备忘录。
突发事件接踵而至，京都朝廷的姿态日益强硬，陷入困境的幕府被迫恭顺朝廷。1862年6月，萨摩藩主监护人岛津久光率兵护送敕使大原重德东下江户，宣布了孝明天皇敦促幕政改革的诏书，要求将军德川家茂来京都，共议国事；幕府任命萨摩、长州、土佐、仙台、加贺等沿海五强藩的藩主为五大老，商议防御“夷狄”事宜；任命德川庆喜为“将军后见职”，辅佐将军，松平庆永为政事总裁，行使幕府大老之权。岛津久光奉旨攘夷的江户之行影响广泛。长州藩的周布政之助、桂小五郎（木户孝允）、久坂玄瑞等尊攘派乘机弹劾长井雅乐，策划实施刺杀。同月，长州藩主毛利敬亲鉴于藩内政局不稳，尊攘派不断制造事端，以及同萨摩藩展开竞争等，下令长井回藩闭门思过。长州藩放弃“航海远略策”，转而实行尊王攘夷方针。
8月，岛津久光的700多人大名行列回藩途中路过神奈川生麦村时，警卫与4名拒绝下马避让的英国人发生冲突，商人理查德森被砍死，同行的店员和朋友受伤。英国提出抗议并要求赔偿，幕府道歉，包括“第二次东禅寺事件”在内，共赔偿10万英镑。肇事的萨摩藩拒绝赔偿，英国公使伺机报复。此时，尊攘声浪愈加高涨，京都朝廷中热衷公武合体的下级公卿岩仓具视、千种有文和堀河纪子、金城重子等被指为“四奸二嫔”，备受指责和攻击。孝明天皇命岩仓等辞官、剃发为僧，远离政治舞台。幕府面临来自各方压力，愈加降低了姿态。11月，敕使三条实美向将军德川家茂传达了天皇敦促实施攘夷、设置近卫兵的旨意；12月，朝廷设置“国事御用挂”，翌年2月增设“国事参政”、“国事寄人”等官职，积极过问政治。朝廷在力主攘夷的过程中提升政治支配能力，幕府则日益处于下风。
1863年1月，长州藩尊攘派武士高杉晋作、久坂玄端、伊藤博文、井上馨等袭击并纵火焚烧正在品川御殿山施工中的英国驻日公使馆，再次给幕府制造麻烦。2月，将军德川家茂、将军监护德川庆喜和政事总裁松平庆永抵达京都，拜见孝明天皇。3月，德川家茂、德川庆喜等跟随参拜贺茂神社。4月21日，幕府违心地宣布以5月30日为期，实行全国大攘夷。其实，幕府对外开放的立场并无变化，也不打算出动幕府军去攘夷。为了减少负担和压力，5月，幕府允许英国、法国在横滨驻军，让攘夷派直接面对荷枪实弹的洋兵。
5月10日，长州藩率先实行攘夷，龟山炮台和藩属军舰“丙辰丸”、“庚申丸”竞相炮击路过下关海峡且毫无防备的美国商船，23日炮击法国军舰，26日炮击荷兰军舰。偷袭得手，举藩欢呼胜利。捷报传到京都，孝明天皇大加褒奖。与此同时，伊藤博文、井上馨、井上胜、山尾庸三、远藤谨助等5名藩士奉藩命，秘密前往英国伦敦大学留学。6月，美国、法国军舰前来报复，先后驶入下关海峡，炮击长州藩的海岸炮台。长州藩的炮台被美法舰队的猛烈炮火打哑，迅即被占领，军舰遭击毁。奉命防守下关的高杉晋作指挥奇兵队，展开抵抗。7月2日，英国为报复一年前“生麦事件”英商被杀伤，萨摩藩拒绝赔偿，派遣舰队前来鹿儿岛讨伐。萨摩藩奉旨攘夷，海岸炮兵在风雨交加中，不惧炮火猛烈，与英国舰队激战竟日（萨英战争）。炮战中，双方均有伤亡，萨摩的3艘军舰被击沉，调练场、御台场的炮台损毁，自筑地町至兴国寺一带鹿儿岛市街和洋式兵工厂集成馆等均遭战火焚毁。
与水户藩浪人多采取个人恐怖行动不同，长州、萨摩两藩的尊王攘夷为举藩实行的武力对抗，效果亦往往始料未及。长州、萨摩藩的中下级武士对欧美列强舰炮的威力印象深刻，随后开始协调与英国的关系；英国为同支持幕府的法国展开竞争，转而关注长州、萨摩藩的外样大名。双方不打不相识又各有所需，相互悄然接近。
尊攘派浪人受到“全国大攘夷”的鼓舞，行动更加无序化，突破了天皇朝廷所能容忍的界限。1863年6月17日，孝明天皇在发给尾张藩主德川庆胜的“宸翰”中指责“表面忠诚、心存奸计的天下好乱之徒”从中作梗，发“伪敕”、施“奸策”，离间朝廷和幕府，表示要“扫除此等奸人”，确保公武“真实合体”。
要求德川庆胜居中处理。8月13日，孝明天皇决定行幸大和，参拜神武天皇陵，发布攘夷亲征诏敕。土佐浪人吉村寅太郎等攘夷派结成天诛组，推举攘夷派公卿中山忠光为主将，挺进大和。17日，天诛组袭击大和国的五条代官所，宣布收归幕府的直辖领地为天朝直辖地，建立了临时性政权机构“御政府”或“总裁所”，为天皇的大和行幸鸣锣开道。
尊攘派浪人的越界行动令孝明天皇恼怒。8月18日，在德川庆喜和会津、萨摩等佐幕诸藩的支持下，天皇发动政变，宣布取消大和行幸，自谓此前的诏令多出于违心，真诏令自即日始。同时解除长州藩主毛利敬亲父子警卫京都的职权，勒令尊攘派立即离开京都。三条实美、东久世通禧、锦小路赖德、泽宣嘉等7名公卿连夜逃往长州。一夜之间，尊攘派沦为天皇朝廷与幕府联手排斥的政治牺牲品。9月，被朝廷斥为“逆贼”的天诛组在吉野山中被幕府军剿灭，吉村阵亡，中山逃匿长州。
在打压尊攘派的同时，天皇在公武合体框架内试行权力机构的调整。12月29日，幕府基于政治谋略考虑，派遣外国奉行池田长发率领使节团前往欧洲，交涉横滨闭港事宜。30日，朝廷准予德川庆喜、松平庆永、伊达宗城、山内容堂、岛津久光等出任朝政参予，以朝廷、幕府和雄藩三方联手的朝议参予会议为平台，稳定统治秩序。由于开港或锁港问题引发幕府与雄藩大名之间的意见对立。1864年2月20日，山内容堂不满幕府的骄横而辞职。至3月，其他参予也辞职而去，参予会议不欢而散。
同年3月，武田耕云斋、藤田小四郎等水户藩内激进的尊攘派“天狗党”为敦促幕府攘夷，挺进京都途中受挫，武田、藤田等被处斩。至此，多次以制造攘夷暴力事件的水户藩的影响力衰落，尊攘派将希望寄托于长州藩。6月，支持幕府的近藤勇指挥佐幕浪士别动队“新撰组”突袭京都客栈池田屋，将聚集在那里的长州、土佐、肥后诸藩志士几乎杀尽，仅木户孝允等幸免。
在一系列重大挫折中，以长州藩为中心的尊攘派迅速分化。久坂玄瑞等继续追随朝廷的老路线，主张重返京都，恢复长州藩对政局的主导权。7月，受池田屋事件的刺激，久坂与长州藩的家老福原越后、国司信浓等为给藩主父子申冤，率领藩兵东进京都，来岛又兵卫、真木保臣等尊攘派骨干踊跃随行。幕府调动萨摩、会津、彦根诸藩士兵在皇宫御所、京都近郊周边布防，以逸待劳。7月18日至19日，双方激烈交战，孤军深入的长州藩兵被迅速击败，久坂战死，真木等自裁，史称“禁门之变”。在蛤门附近激烈的战斗中，长州藩军的大炮指向了皇宫，枪弹击中御所大门，枪炮声中皇太子睦仁当场休克。朝廷宣布长州藩毛利敬亲父子为“朝廷之敌”、“国贼”，长州藩被孤立起来。萨摩藩借此压制长州藩，其政治影响力一跃为诸雄藩之首。
桂小五郎、高山晋作等判明形势，放弃重返京都的老路线，转而立足本藩，实施割地自强的“大割据”新政策。同时，设法联络在长崎、横滨开设商店的苏格兰军火商格洛弗（Thomas Blake Glover），通过土佐藩坂本龙马的居中斡旋，长州藩开展对英贸易，并以萨摩藩名义购置大量英国的新式武器，奠定了实施“大割据”政策的军备基础。以此为标志，武力倒幕派初步形成。
7月22日，池田长发等回国，带来下关海峡通航、降低输入关税的“巴黎约定”，力陈锁港不可取。23日，幕府尽管感到恼火，却只对池田等给予降职处分。24日，幕府向英、法、美、荷公使宣布“巴黎约定”作废。同日，幕府利用朝廷宣布长州藩为“朝敌”之机，调集西日本21个藩的军队，发动对长州藩的第一次围剿。8月5日，英、法、美、荷四国舰队，猛烈炮击长州藩的海岸炮台。面对幕府和列强的联合进攻，出掌长州藩藩厅实权的保守派“俗论党”，借口保存毛利家族的身家性命，停止对抗幕府，转而“谢罪恭顺”。11月，处死率兵进京的福原越后、国司信浓等家老，暗杀避难长州的公卿中山忠光，软禁藩主毛利敬亲。高压之下，木户孝允、高衫晋作等无法在藩内立足，出走躲避。
12月，奇兵队总督高衫冒死从北九州潜回长州藩，在伊藤博文等支持下，率领草莽志士诸队在马关起义。激战经月，1865年1月，打垮了俗论党政府。自称正义派的木户、高衫等转化为武力倒幕派，掌握藩政实权，加速“大割据”的步伐。此前，萨摩藩因权力分配问题与幕府闹翻，岛津久光退出朝议参予会议。藩内的保守派失势，大久保利通、西乡隆盛、小松带刀等藩内的革新派掌握了藩厅的权力。萨摩藩与长州藩政权均为倒幕的中下级武士掌握，出现联合对敌的契机。经过坂本龙马等人的奔走，1866年1月，萨摩藩的西乡、大久保、小松与长州藩的木户等，在京都萨摩藩邸秘密订立《萨长盟约》。双方“以六条约定将来”，即萨摩藩出兵两千，扼守京坂要地，向朝廷为长州藩申冤；准备与佐幕的土佐、一桥、会津、桑名等藩“决战”；“长州的冤罪免除后，双方真诚联合”；自缔约之日起，“无论采取任何方式，双方都要为皇国、光耀并恢复皇威为目标，竭尽忠诚和努力。”
萨长联盟，武力倒幕派与幕府的力量对比发生了重大逆转。