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前期研究者认为，条件化恐惧记忆同其他类型的记忆一样，可以划分为获得（Acquisition）、巩固（Consolidation）与提取（Retrieval）阶段（Abel & Lattal，2001）。不同的记忆阶段具有不同的神经生物学特征，对不同阶段的干预也会产生不同的效果。对于动物条件化恐惧记忆的行为表现来说，在获得阶段，有机体建立对外界线索或环境与足底电击的联结；在巩固阶段，经过几分钟至多日的大脑加工，恐惧记忆被保存在大脑中，从一个不稳定的状态发展为一个稳定、难以破坏的状态；在提取阶段，动物再次被放入受过电击的环境中或再次面对条件化线索，它们会表现出恐惧性的“僵直（Freezing）”反应。在分子水平上，获得和巩固具有许多相同的分子机制。在恐惧记忆获得阶段，外界刺激促使谷氨酸与NMDA受体结合，通过突触后去极化作用使Ca 2+ 进入突触后神经元，进而激活CaMKII、蛋白激酶C和钙调神经磷酸酶，最终激活下游的cAMP/PKA通路。恐惧记忆的巩固过程与此相似，但不需要外界刺激的参与。恐惧记忆的提取与获得由相似的脑区参与，但在分子机制上二者存在差异。
通过实验技术分离不同的记忆阶段存在相当大的困难，针对某个记忆阶段的实验操作不一定仅影响这一特定的记忆阶段，很可能会对多个记忆阶段产生影响。不同实验技术的影响范围也不一样，如药理学方法具有很高的时间特异性，这种方法可以在相对较短的时间窗内有针对性地对不同阶段进行干预。但对有机体的基因进行调控会导致感兴趣的基因对记忆的各个阶段均产生影响。损毁的方法一般会对损毁后的记忆阶段均产生影响。较先进的暂时性基因调控法或暂时性损毁目前也能够特异性地实现对目标记忆阶段进行干预。
除了获得、巩固与提取这三个基本的阶段外，恐惧记忆还会在提取后因未得到加强而产生消退（Extinction），也可能会在提取后由于被再次激活而产生再巩固（Reconsolidation）。巩固、消退与再巩固是干预条件化恐惧记忆研究中一直备受关注的阶段。探索恐惧记忆各阶段相关的行为与神经生物学特征对揭开PTSD的病理机制、PTSD的预防与治疗具有非常重要的意义。
恐惧记忆巩固的过程
记忆在学习或者训练后不会立即保存在大脑中，它需要一个逐渐稳定的过程，即记忆巩固。记忆巩固是保证记忆（包括条件化恐惧记忆）在脑内储存并长时间持续存在的关键阶段。在恐惧记忆巩固过程中，我们的大脑中会进行一系列神经生物学的改变。此时，恐惧记忆还处于不太稳定的状态，若利用行为、药物或其他操作手段干扰恐惧记忆巩固过程，就会使得巩固无法完成，导致恐惧记忆难以获得长期储存（Johansen et al.，2011）。但随着条件化恐惧训练后时间的推移，巩固过程逐渐进行，恐惧记忆也将逐渐变得更加稳定、难以被干扰或破坏（Myers & Davis，2002）。因此可以推测，恐惧记忆的巩固过程有关键的时间窗。
在记忆巩固的一系列神经生物学机制上，长时程增强效应（Long-term Potentiation，LTP）是学习与记忆的主要细胞机制之一。LTP可分为不同的时程阶段（Milner et al.，1998）：持续几分钟的短时LTP（Short-term LTP，S-LTP），由单一高频率刺激引起，不依赖于新蛋白的合成，可能对已存在的蛋白起到修饰作用；长时LTP（Long-term LTP，L-LTP），由多重高频率刺激诱导，可持续数分钟到数小时，依赖于新蛋白的合成（Y. Y. Huang et al.，1994；Nguyen & Kandel，1996）。L-LTP与突触的结构性改变有关，而S-LTP没有发现突触结构性的改变（Milner et al.，1998）。长时记忆的形成与L-LTP相似，也依赖于新蛋白的合成。利用蛋白合成抑制剂干扰恐惧记忆的巩固过程，动物的抑制性回避行为就难以表达（Tronel et al.，2005）。因此，从L-LTP与S-LTP的特征上看，二者很可能分别是参与短时记忆（Short-term Memory，STM）与长时记忆（Long-term Memory，LTM）的重要细胞机制。
条件化恐惧的短时记忆一般是在条件化恐惧训练后1—4小时进行测试，而长时记忆一般是在训练后的24—72小时进行测试。在条件化恐惧训练后立即给予蛋白合成抑制剂不会影响训练后1—4小时的恐惧行为，也证明短时记忆是不依赖于新蛋白的合成。因此，研究者认为恐惧记忆巩固的时间窗限于条件化恐惧训练后最初的几个小时（McGaugh，2015），一般不超过6小时，这是干预恐惧记忆的关键时刻。研究也证明，在条件化恐惧训练后直接在海马（Hippocampus）内注入能够干预记忆巩固的药物，会以一种时间依赖的方式调节恐惧记忆的巩固（de Oliveira Alvares et al.，2008；Lunardi et al.，2018），提示恐惧记忆确实存在巩固窗口期。这也说明，人类遭受严重的创伤性事件后，也可能存在这样一个关键的干预时间窗。
当然，恐惧记忆巩固的时间窗并不总是固定在6个小时内，它的时间过程会受到特定的学习参数的影响。在条件化恐惧训练时，若给予动物施加的足底电击较强，恐惧记忆的巩固会在6小时内完成；若施加的足底电击较弱，则在训练6小时后给予药物干预仍能破坏恐惧记忆的表达。说明在较弱的应激下，应激6小时后恐惧记忆的巩固仍在继续（Casagrande et al.，2018）。当然，应激过程中的其他环境条件也会影响恐惧记忆巩固的动态进程。
突触巩固与系统巩固
条件化恐惧记忆的巩固还可以分为突触巩固（Synaptic Consolidation）与系统巩固（System Consolidation）。突触巩固指条件化恐惧记忆获得后几分钟到几小时所经历的巩固过程（Schafe et al.，2001），类同于L-LTP阶段；而系统巩固持续时间较长，指持续几天甚至几星期的巩固过程，此过程将记忆痕迹在多个脑区间进行一次新的系统重组，可使记忆终生保存（Katche et al.，2013）。在目前的研究中，研究者一般认为记忆获得后约7天是系统巩固的关键时间窗（Dudai，2004）。Cohen实验室对动物的恐惧记忆与人类PTSD的发病过程在时程上的改变进行了对比研究，也认同应激后7天是恐惧记忆巩固的一个非常关键的时期。对于人类而言，创伤性事件发生后个体的应激反应症状会随着时间的变化而减少，半年后只有约25%的创伤受害者会发展为PTSD。动物在天敌应激训练7天后，同样也有约25%的动物继续表现出显著的恐惧反应，且这部分动物的焦虑与恐惧反应会继续长久保持，与人类的PTSD发病过程相似（H. Cohen & Zohar，2004）。可见，这与传统记忆巩固理论不同。
记忆系统巩固理论认为，记忆的完整巩固过程为：首先在海马内进行突触巩固，然后记忆信息再缓慢向皮层重组进行系统巩固，最终实现记忆的永久储存（McClelland，2013；Tse et al.，2007）。在这个由易被干扰或被破坏的近程恐惧记忆（Recent Fear Memory）到稳定难以干扰的远程恐惧记忆（Remote Fear Memory）的转换过程中，恐惧记忆在行为特征、相关分子机制及相关脑区的神经元形态均发生了显著的变化（Gräff et al.，2014；Vetere et al.，2011）。在系统巩固期间，若长时间抑制海马或新皮层的神经活动，就会破坏记忆的形成（Blum et al.，2006；Nakashiba et al.，2009）。条件化恐惧获得后立即损毁海马不但能够阻断前扣带皮层（Anterior Cingulate Cortex，ACC）树突棘密度的可塑性变化，还能够破坏36天后远程场景恐惧记忆的表达（Restivo et al.，2009），说明海马在影响恐惧记忆的远程行为表达与相应神经生物学改变中具有重要的作用。
根据经典的系统巩固理论，海马只在记忆形成之初起到支撑记忆巩固的作用（Maviel et al.，2004；Varela et al.，2016），而随着记忆的成熟，记忆就开始转向依赖于皮层区域（Frankland & Bontempi，2005），即海马与皮层在记忆形成后的不同时间发挥着相应的作用。但是，高级皮层区并不只是参与了恐惧记忆的系统巩固。破坏ACC区域NMDA受体的功能，也能够阻断近程恐惧记忆的表达（Zhao et al.，2005），提示皮层区域也可能参与了恐惧记忆的突触巩固。另外，利用光遗传学技术在记忆获得数周后抑制海马的活动能够破坏远程恐惧记忆的表达（Goshen et al.，2011），而记忆获得后立即抑制前额叶皮层的神经元活动也能够破坏远程恐惧记忆的表达（Kitamura et al.，2017）。说明在恐惧记忆形成的早期，海马与皮层区域均可能参与了记忆的巩固过程。这些研究结果无法用经典的系统巩固理论进行解释，那么，恐惧记忆习得后，其巩固的过程到底是怎样的？各个神经环路之间是如何协同工作的？这些问题我们仍知之甚少。
目前我们还无法完全理解恐惧记忆长期储存的动态过程。比如，LTP在记忆形成之初具有重要作用，但其在远程记忆存储中的作用还不清楚（Honoré et al.，2021）。在记忆环路上，研究者已经发现经典的从海马依赖向皮层依赖的记忆巩固过程已不能解释最新的研究结果，海马与皮层可能在记忆形成之初就参与了记忆巩固的过程，且可能影响远程记忆的表达。因此，有研究者提出了记忆多重痕迹理论（Multiple Trace Theory，MTT）（Barry & Maguire，2019）。此理论认为，海马、皮层在记忆形成之初存在双向的相互作用，记忆痕迹在最初形成时就存在于海马、皮层等多个神经网络中，且海马的作用也不会随着记忆的成熟而衰退。
到目前为止，已有的研究大多数仍局限于近程记忆向远程记忆转换时海马向皮层的单向转换，我们缺乏对记忆形成后海马与皮层之间的连接是否存在相互的双向作用的研究，我们仍不知道系统巩固的动态神经生物学特征是怎样的。因此，恐惧记忆形成后由近程向远程记忆转换的神经环路、细胞机制及分子机制的动态过程仍有待深入探索。
记忆印迹在恐惧记忆巩固过程中的动态变化
记忆印迹（Memory Engram）的概念在100多年前由德国科学家Richard Semon提出。他认为记忆印迹是由外界刺激引起的脑内生理学的持久改变。由于受到研究条件的限制，他并未指出这种改变的生物学基础是什么。结合最新的对记忆相关分子生物学研究的成果，研究者对记忆印迹有了更深的认识：记忆印迹可以用印迹细胞（Engram Cells）进行标记（Tonegawa，Liu，et al.，2015）。印迹细胞指一群能够在学习时被激活的神经元，这群神经元在学习后能够产生持久的神经生物学改变，且能够在记忆提取时再次被激活。多个印迹细胞可以在学习后形成印迹细胞通路共同支撑记忆的形成与储存。实际上，早期研究者已经通过脑损毁、电生理或脑功能成像技术探索了不同记忆类型所依赖的脑区域，但这类研究无法深入到对记忆的神经细胞层次的探索，也就无从知道恐惧记忆的印迹细胞到底是什么。
随着可控性即刻早期基因（Immediate Early Genes，IEG）、转基因动物、光遗传学技术、病毒载体介导的药理学及基因控制技术等新技术的进步，目前研究者已经可以实现对记忆印迹细胞的可视化操作（Eichenbaum，2017；Sweis et al.，2021；Tonegawa，Pignatelli，et al.，2015）。然而，已有对记忆印迹细胞的研究主要关注近程记忆高度依赖的海马区域，只有极少数研究探索了远程记忆印迹的表达。如Tayler等利用TetTag双转基因小鼠（H2B-GFP TetTag小鼠）在条件化恐惧获得时对记忆印迹细胞进行组蛋白H2B-GFP标记，这种标记过程由IEG c-Fos启动子所驱动。他们发现，获得2天的恐惧记忆会导致海马、杏仁核与皮层等广泛区域均被H2B-GFP标记，但获得14天的恐惧记忆只能够引起H2B-GFP标记在皮层区域（Tayler et al.，2013）。Denny等（2014）利用ArcCreERT2转基因小鼠也研究了获得5天的近程恐惧记忆与获得30天的远程恐惧记忆所诱导的记忆印迹特征。他们发现近程恐惧记忆会使海马部位有丰富的记忆印迹标记，而远程恐惧记忆却无法使Arc-EYFP标记在海马部位。从这两项记忆印迹的相关研究看，似乎海马并不参与远程恐惧记忆的形成。但是，有研究者利用光遗传学及神经元钙成像技术，发现在恐惧记忆获得之初，海马与杏仁核到前额叶皮层的神经投射就会被激活，这种神经连接会迅速激活前额叶皮层的记忆印迹细胞。同时，海马与杏仁核内的记忆印迹细胞也被外界应激刺激所激活。随着条件化恐惧训练结束后时间的推移，前额叶皮层记忆印迹细胞在海马的支持下功能逐渐成熟；相反，海马内的记忆印迹细胞则逐渐沉默（Kitamura et al.，2017）。
由于对记忆印迹的研究起步较晚，且多数研究仍关注近程记忆在海马部位的标记，对远程恐惧记忆形成及保持机制的研究还相当缺乏。我们可以看出，对记忆印迹的可视化标记技术的出现为研究远程恐惧记忆形成的动态过程提供了可行的途径。
条件化恐惧形成后的消退训练是在动物模型中对人类PTSD患者的暴露疗法的模拟（Bouton et al.，2001；Rothbaum & Davis，2003）。消退指重复呈现条件化恐惧记忆的条件线索CS或暴露于原训练环境而不伴随非条件线索US的过程，这个过程能够促使条件化恐惧反应减少。消退过程通过反复的相关条件线索或创伤情景的暴露，使个体产生新的CS-no US学习，这也是一种蛋白合成依赖的过程（Yang & Lu，2005）。研究者一般认为消退并不能消除已获得的条件化恐惧记忆，而是抑制了条件化恐惧记忆的表达。消退学习更新了原来的CS-US联结，从而使CS不再预示US的到来，即习得新的CS-no US联结（Milad et al.，2006）。在条件化恐惧记忆消退之后，记忆痕迹应该一直存在，而不受消退学习的影响，消退学习只是暂时抑制了条件化恐惧记忆痕迹的表达（图4-1）。条件化恐惧记忆消退一段时间后，在一定的条件下仍能够表达。虽然消退训练后条件化恐惧记忆可以重新再表达，但消退记忆也能得到巩固。因此，在条件化恐惧消退后，条件化恐惧记忆与消退记忆是同时独立并存的记忆系统，都可以保持为长时记忆（Quirk，2002）。
图4-1 消退不能清除条件化恐惧记忆，消退记忆与恐惧记忆会同时存在，个体的恐惧水平取决于恐惧记忆与消退记忆的相对强度。
Tronel等（2005）认为，原有条件化恐惧记忆被激活后，不但会引起消退过程，还会引起另外一个独立的过程——再巩固。再巩固与消退具有不同的行为、分子与脑机制。再巩固过程能够使新的信息整合进已建立的记忆系统中（Duvarci & Nader，2004；Nader et al.，2000）。研究者认为当每次记忆被激活的时候，都可能会对新信息进行重新整合而更新一次原有记忆（Eisenberg & Dudai，2015；Sara，2000）。新信息的整合是通过再巩固过程实现的，在记忆再次被激活的时候，新信息与原有信息的整合并不会损害原有记忆的稳定性（Tronel et al.，2005）。将新信息整合进原有记忆的过程可能包括二级条件化过程与消退学习过程。Alberini（2005）假设认为，记忆被再次激活后启动的再巩固过程为整合新信息提供了机会，再巩固过程可以看作是相对较长期的巩固过程。参与记忆再巩固的环路与参与先前学习过程的环路部分上可能有重叠，但是过程不同，记忆再巩固最终会导致记忆痕迹的增强（Eisenberg & Dudai，2015）。情绪对记忆的增强效应证明，条件化恐惧记忆更易于被提取激活，从而使记忆痕迹较强的条件化恐惧记忆更易于进入再巩固的过程，以致原有记忆痕迹更加固化，产生记忆消退困难。
从以上分析可见，消退与再巩固都是恐惧记忆提取之后所产生的过程。这是两个相互平行的过程，消退依赖于外部的反复暴露强化，而再巩固依赖于内部强化（Eisenhardt & Menzel，2007）。但在恐惧记忆提取之后，消退与再巩固会同时存在且相互独立、互不影响（Tronel et al.，2005）。记忆提取后个体的行为表现是消退与再巩固过程平衡的结果（Myers & Davis，2007）。
再巩固与消退并存的现象使抑制恐惧记忆的表达更加复杂。如果能够抑制再巩固过程而促进消退过程将对治疗恐惧记忆相关的精神障碍非常有帮助。那么记忆提取后如何干扰再巩固过程而促进消退过程呢？这可能取决于到底哪种过程占据主导地位。研究者认为记忆被激活的时候，恐惧记忆强度是影响再巩固与消退的关键参数。记忆被激活时线索呈现的次数较少或呈现的时程较短、恐惧水平较低、巩固程度较高的记忆易于在被激活后进入再巩固过程，反之则易于进入消退过程（Maren & Chang，2006；Pedreira & Maldonado，2003；Power et al.，2006；Suzuki et al.，2004）。或者说，恐惧记忆提取后如果消退过程没有出现，那么再巩固就会发生（Dudai，2006；Nader，2003）。
有研究者提出了“痕迹主导”假设。他们认为记忆痕迹的强度决定了消退与再巩固过程到底哪个占主导地位（Dudai & Eisenberg，2004；Nader，2003）。Maren与Chang（2006）研究了消退前的不同恐惧水平对消退的影响。他们尽量降低大鼠的恐惧表达，如减少电击次数，改变消退环境。结果发现，降低消退时的恐惧水平能够很大程度上加强消退效果，特别是在条件化恐惧获得后立即进行消退训练。因此，他们认为消退记忆的保持依赖于获得与消退训练的间隔时间及US强度的交互作用。还有人认为，环境也是影响消退与再巩固的一个因素，他们认为环境信息的输入门控了条件化恐惧记忆联结（CS-US）与消退记忆联结（CS-no CS）的提取，即在一定的时间内恐惧的表达是由环境支配的（Bouton & King，1983）。另外，在条件化线索暴露时，变换CS的呈现间隔时间会产生更好的消退效果（Auchter et al.，2017）。