第四节
乙型肝炎重症化的表观遗传因素

赵英仁

乙型肝炎重症化的发生、发展过程同样涉及宿主、HBV及环境因素（包括干预）等方面相互作用的影响。宿主方面除个体的成长环境外，常与宿主遗传背景密切相关。HBV感染者的年龄、性别、种族、干预应答效果，以及是否有肝硬化和（或）肝癌家族史等众多方面的研究依据，促使学者们更加关注宿主的遗传易感性和宿主的遗传背景与HBV感染结局之间的关系。

宿主遗传因素至少包括两个方面的内容。一方面，是以DNA双螺旋结构为基础的中心法则，主要描述遗传信息是如何自DNA→RNA→蛋白质的单向控制论，是生物繁衍后代保持物种稳定的基本条件。1970年发现的逆转录进一步完善了传统意义上的中心法则，它是促使生物不断适应环境和进化的基础。另一方面，在不同生物的遗传与表型差异研究中发现，在基因的DNA序列未发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的遗传信息变化，并最终产生表型的改变，这不符合孟德尔的遗传规律。人们逐渐认识到，基因组含有两类遗传信息，一类是物种必需的遗传编码信息，另一类是近年发现的大量隐藏在DNA序列之中或之外更高层次的遗传信息，可提供表观遗传学信息。本节主要根据目前研究进展，介绍宿主表观遗传因素（DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA）在乙型肝炎重症化中的作用。尽管有关这方面的研究尚处于起步阶段，但以其在遗传学和在相关疾病中的作用，表观遗传因素必将很快成为研究热点之一。

一、表观遗传学概述

自1939年Waddington首次提出表观遗传学（epigenetics）的概念后，生命科学研究已经进入全新的表观遗传学领域。疾病的发生、发展不仅取决于经典遗传因素，同时也受到表观遗传修饰（epigenetic modification）的影响。经过数十年的发展已经形成了比较统一的认识，表观遗传学是指研究不涉及DNA序列变化、可遗传的和可逆性的基因表达调节的一门新兴的遗传学分支。目前表观遗传学研究内容主要涉及DNA甲基化修饰、染色质组蛋白的修饰、染色质重构及非编码RNA等调控方式，根据基因转录是否参与，表观遗传学分为基因转录前调控及基因转录后调控两大类。

（一）基因转录前调控

1.DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA碱基上通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）的催化，添入甲基基团的化学修饰现象。高等生物中存在着广泛的甲基化，DNA甲基化主要是在基因5′端非编码区CpG岛的胞嘧啶第5位碳原子加上一个甲基基团，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）（图4-3）。DNA的不同甲基化状态（如过甲基化、半甲基化等）与基因的活性和功能有关。一般来说，DNA甲基化多引起基因的失活。

胞嘧啶第5位碳原子加上一个甲基基团，生成5-甲基胞嘧啶。Me：甲基。

基因组DNA既存在甲基化修饰，也存在其逆过程——DNA去甲基化（DNA demethylation）。DNA去甲基化是指在DNA去甲基化酶（DNA demethylase）作用下特异性地脱去甲基的反应过程。一般认为，DNA去甲基化主要发生在生物的早期发育过程中，与基因转录活性相关，对基因表达有诱导作用，是生物发育中重要的调控方式。

与DNA甲基化有关的表观遗传现象的作用途径还包括基因组印记（genomic imprinting）、X染色体失活（X-chromosome inactivation）、转座子的稳定性等。

2.组蛋白的共价修饰

组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）是核小体重要的组成部分，是一组等电点（pI）大于10的碱性蛋白，它由一球状核心区和突出于核小体外富含碱性氨基酸的N端尾部组成。组蛋白被修饰的位点就集中在N端尾部，尾部特定的氨基酸残基经各种酶促反应可进行共价修饰。这些修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、ADP核糖基化、泛素化和苏素化（图4-4）。赖氨酸的游离氨基可发生乙酰化和甲基化，精氨酸的氨基基团可发生甲基化，丝氨酸和苏氨酸的羟基基团可发生磷酸化。

组蛋白被修饰的位点就集中在N端尾部，尾部特定的氨基酸残基经各种酶促反应可进行共价修饰；组蛋白的修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、ADP核糖基化、泛素化和苏素化。histone：组蛋白。

（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.）

通常意义上，组蛋白乙酰化可使相应染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录。组蛋白甲基化有单甲基化、双甲基化及三甲基化三种不同的形式，极大地丰富了组蛋白修饰种类，既可增强也可抑制基因的转录。例如，H3K4、H3K36及H3K79甲基化与基因激活相关，而H3K9、H3K27及H4K20的甲基化与基因沉默相关。到目前为止已经发现70余种不同位点及类型的组蛋白修饰。正是由于组蛋白修饰的多样性，美国学者Strahl和Allis提出了组蛋白密码假说（histone codehypothesis），认为组蛋白尾部的共价修饰及组合，加上其他修饰（如DNA甲基化）构成了一套调控染色质结构和转录活性的遗传密码。

3.染色质重塑

染色质重塑（chromatin remodeling）是指无转录活性的染色质，通过与染色质重构复合物（chromatin remodeling complex）之间相互作用成为有转录活性的染色质的过程。目前已发现多种ATP依赖型的染色质重构复合物，如SWI/SNF、RSC、NURF、ACF、CHRAC和MOT1等。染色质重构使染色质结构发生一系列重要的变化，如染色质去凝聚、核小体变成开放式的疏松结构，使转录因子等能够结合核小体DNA，从而调控基因转录等。核小体的滑动可能是其中一种重要机制模式，它不改变核小体结构，但改变核小体与DNA结合位置，在这种核小体重新组装并与DNA结合的过程中，DNA暴露，从而促进转录因子及RNA聚合酶与启动子结合，开始转录（图4-5）。广义上讲，染色质重构还包括组蛋白的共价修饰、组蛋白变异体及其他引起染色质构型改变的调控方式。

起始转录染色质重构复合物在ATP的参与下，与染色质相互作用，核小体滑动，改变了核小体与DNA结合位置，暴露DNA，从而促进转录因子及RNA聚合酶与启动子结合，使其成为有转录活性的染色质。ATP（adenosine triphosphate）：三磷酸腺苷。ADP（adenosine diphosphate）：二磷酸腺苷。

（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）

（二）基因转录后调控

1.非编码RNA

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一类不翻译成蛋白质的功能性RNA分子，即除mRNA以外的所有RNA。ncRNA根据其作用可分为功能性ncRNA和调控ncRNA两类：前者包括tRNA、rRNA等，它们具有重要功能，但不参与修饰调控；后者可分为长链ncRNA、中链ncRNA和短链ncRNA，其功能是以不同的形式调控基因的表达。长链ncRNA长度常达到1kb及以上，多在基因簇甚至整个染色体水平发挥顺式调控作用；中链ncRNA长度为50～500nt，反义RNA属于其中一种，多行使反义调控的功能；短链ncRNA长度为21～31nt，主要与argonaute（AGO）蛋白家族的不同成员结合形成核糖蛋白复合物，多在mRNA水平对基因表达进行调控，它们通过形成的RNA诱导沉默复合体（RISC）介导mRNA的降解和（或）抑制mRNA的翻译，还对外源的核酸序列进行降解以保护本身的基因组（图4-6）。

miRNA切割mRNA或者阻断翻译，siRNA切割mRNA，两者均引发转录后基因的沉默。miRNA（microRNA）：微小RNA。siRNA（short interfering RNA，small interference RNA）：小干扰RNA。RISC（RNA-induced silencing complex）：RNA诱导沉默复合体。AGO1：argonaute蛋白1。

（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）

常见的短链ncRNA为小干扰RNA（short interfering RNA，small interference RNA，siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）。外源小分子双链RNA（double strand RNA，dsRNA），也被称为siRNA，通过特异性地结合体内特定基因的mRNA，可诱导相应mRNA降解，引发转录后基因的沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），这种现象称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。RNAi机制依赖于siRNA与体内靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，因此RNAi有可能作为一种简单而有效的敲除基因的工具。真核生物体内另一重要的ncRNA就是miRNA。miRNA是一类长约22nt的单链RNA分子，广泛存在于多种真核生物的细胞中。miRNA的作用机制目前认为与RNAi现象一致，通过碱基互补配对导致体内相应mRNA降解，抑制基因转录后表达。目前已有证据提示体内大量的miRNA可能来源于基因转录后剪切的内含子序列。

2.核糖开关

核糖开关是近年来发现的调控mRNA的一种特殊形式，它充当mRNA表达开关的作用。核糖开关广泛存在于革兰阳性菌的代谢相关基因中。此外，在真菌、植物中也有发现，它相当于mRNA特异性的结合代谢物，通过改变构象在转录或翻译水平上调节基因表达。例如，当葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate，GlcN6P）在细菌细胞内达到较高水平时，相应基因mRNA结构的5′端选择性诱导产生一种具有自我剪切RNA能力的结构单元，诱导mRNA切断自身，这样mRNA的数量极大地减少，从而削弱了GlcN6P的生成（图4-7）。核糖开关也可认为是一种核酶，通过切断自身mRNA而达到控制靶基因表达的目的。

当GlcN6P在细菌细胞内达到较高水平时，相应基因mRNA结构的5′端选择性诱导产生一种具有自我剪切RNA能力的结构单元，诱导mRNA切断自身，减少mRNA的数量。红色代表该基因mRNA保守序列。A：腺嘌呤。G：鸟嘌呤。C：胞嘧啶。U：尿嘧啶。

（引自：Winkler W C，et al.Nature，2000，428（6980）：281-286.）

二、宿主基因甲基化与乙型肝炎重症化

（一）DNA甲基化修饰机制

DNA甲基化（DNA methylation）是目前研究最清楚的也是最重要的表观遗传修饰形式。基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间共价结合，由此胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。哺乳动物基因组DNA中5-mC占胞嘧啶总量的2%~7%，绝大多数5-mC存在于CpG二联核苷（CpG doublets）上。哺乳动物基因组中CpG二联核苷出现的频率远低于四种碱基随机排列所预期的频率，但对蛋白质编码基因而言，CpG二联核苷并不呈现基因组总DNA中的低频率。在结构基因的调控区域，CpG二联核苷常以成簇串联的形式排列。结构基因5′端附近富含CpG二联核苷的区域称为CpG岛（CpG island）。基因调控元件（如启动子）所含CpG岛中的5-mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合，所以DNA甲基化一般与基因沉默（gene silencing）有关；而非甲基化（non-methylated）一般与基因的活化（gene activation）有关。去甲基化（demethylation）则往往是一个沉默基因重新激活（reactivation）的途径之一。

DNA的甲基化遗传通过DNA甲基转移酶（DNMTs）来维持。DNMTs将S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）上的甲基转移至胞嘧啶核苷酸的第5位碳原子。当一个甲基化的DNA序列复制时，新合成的DNA双链呈半甲基化，即只有母链有完整的甲基化标记，这时另一条链会经DNMTs的催化而在与母链5-mC对称的位置上使相应的胞嘧啶甲基化，通过这种方式DNA的甲基化修饰在DNA复制中得以维持（图4-8）。除此之外，哺乳动物基因组DNA甲基化型的建立、维持和改变还涉及DNA去甲基化酶（DNA demethylase）和不依赖半甲基化DNA分子中的甲基化模板链而从头开始合成5-mC的从头甲基化酶（de novo methylase），如DNMT3a、DNMT3b等。

当一个甲基化的DNA序列复制时，新合成的DNA只有母链有完整的甲基化标记，在DNA甲基转移酶的催化下，另一条链上相应的胞嘧啶甲基化，使DNA在复制中得以维持甲基化。图中红色球形标记代表甲基化修饰。

（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）

（二）DNA甲基化与乙型肝炎重症化的关系

异常的DNA甲基化通常被认为与人类多种疾病的发生有关。尤其在肿瘤研究中，人们发现了某些抑癌基因（p16）、肿瘤转移抑制基因（Nm ² 3）及DNA修复基因（MLH1）等肿瘤相关基因的5′端启动子区的CpG岛都发生了高甲基化。已发现HBV相关肝癌中涉及多种DNA甲基转移酶的表达上调，这种DNA甲基转移酶水平的升高大多与抑癌基因的高甲基化有关。近年来很多研究表明，基因组中CpG岛异常甲基化不仅涉及肿瘤的发生，还与多种微生物感染所致的感染性疾病有关（表4-2）。2006年，赵英仁等以21例HBV相关肝癌患者、45例HBV相关肝硬化患者、65例CHB患者、26例急性乙型肝炎患者和95例正常对照者为研究对象，采用生物信息学方法预测CIITA pIV启动子区有一个CpG岛区域，针对该区域设计甲基化特异性引物联合PCR（MSP）检测CIITA pIV启动子在各组HBV感染者中的作用。结果表明，HBV感染者CIITA基因并无基因突变或序列的改变，进一步分析显示CIITA基因甲基化率在HBV相关肝癌、HBV相关肝硬化和CHB组未发现明显差异，但与HBV急性感染组或健康对照组比较，其甲基化率明显高于后者，差异具有统计学意义。数据表明CIITA pIV启动子区的CpG岛DNA甲基化可能与HBV持续感染有关。该研究所2008年又以90例慢性HBV感染者（30例慢性HBV携带者、30例HBeAg阳性和30例HBeAg阴性CHB患者）和30例正常对照者为研究对象，采用甲基化特异性PCR（MSP）、实时定量PCR（RT-PCR）和ELISA法分别检测IFN-γ基因启动子区的甲基化水平和表达量。结果显示，慢性HBV感染者IFN-γ基因启动子区甲基化水平明显升高，且IFN-γ的表达水平与该基因启动子区甲基化状态呈负相关。提示IFN-γ基因启动子区高甲基化可能参与了HBV感染慢性化的病理机制。王凯等在HBV相关慢加急性肝衰竭（ACLF）的临床研究中发现多种基因（IL-10、GSTP1及IFN-γ）启动子的异常甲基化与肝衰竭的发生有关。他们以25例慢加急性肝衰竭患者对比观察CHB患者和正常对照者，采用甲基化特异性PCR（MSP）及ELISA方法检测IL-10甲基化修饰状态和血清表达量之间的关系，结果显示慢加急性肝衰竭组的IL-10基因甲基化率明显低于CHB组，而IL-10的表达水平在慢加急性肝衰竭组较CHB组明显升高，这表明IL-10基因启动子甲基化可能参与了IL-10表达的调控。谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）是氧化应激反应中一种重要的还原酶，可以保护组织免受损伤。研究结果显示35例HBV相关肝衰竭患者发生GSTP1启动子甲基化率明显高于CHB患者，提示GSTP1启动子甲基化可能促进了氧化应激，间接导致肝脏损伤。IFN-γ在HBV感染性疾病中具有重要的抗病毒和调节免疫的功能。该研究组同样采用了甲基化特异性PCR及ELISA方法研究IFN-γ甲基化水平和表达，结果显示HBV相关慢加急性肝衰竭组IFN-γ甲基化率（24/40）显著低于CHB组（14/15），但高于正常对照组（2/10）；还发现IFN-γ在血清中的表达与自身甲基化修饰状态呈负相关，在这一点上与西安交通大学肝炎研究所的研究结果一致。研究认为，IFN-γ基因启动子区的去甲基化可能也介导了HBV相关慢加急性肝衰竭的发生。除了以上这些直接对HBV相关肝衰竭的研究之外，还有一些研究表明宿主基因在HBV感染过程中起着重要作用。2005年，王宇明等对三对单卵双胞胎（其中一对表型不一致，表现为HBeAg阳性和阴性的CHB，其他两对均表现为抗-HBs阳性，母亲均为CHB患者）的基因组进行酶切、凝胶电泳、差异条带克隆并测序，发现表型不一致的双胞胎中存在GSP1（G蛋白通路抑制子1）、LOC390424、LOC388459和ABCC8基因（ATP-结合盒C亚家族的第8个成员）四个差异甲基化基因。提示上述四个差异甲基化基因可能影响了疾病的表型。以上这些结果均提示宿主基因的甲基化状态的改变可能与HBV感染和（或）重症化的发生、发展紧密相关。

已知HBV DNA水平与HBV感染患者临床结局、预后等存在密切关系。各国慢性乙型肝炎指南均把最大化抑制HBV复制作为抗病毒治疗的理想目标，可见HBV DNA载量在病情演变中的重要性，重型肝炎进行抗病毒治疗的不同结局亦是另一种提示。近年来研究显示，不仅宿主基因可发生DNA甲基化，而且HBV本身也存在DNA甲基化现象，这种现象与HBV复制密切相关。Vivekanandan等发现，HBV DNA基因组内存在CpG岛，他们通过体外转导未甲基化HBV DNA、部分甲基化HBV DNA和全部甲基化HBV DNA三种不同修饰状态的病毒进入HepG2细胞系，结果表明HBV DNA甲基化程度可以影响HBV mRNA、HBsAg及HBcAg的表达，且在人类的肝脏组织中发现HBV cccDNA存在甲基化现象。2年后Kim等以12例HBV相关肝硬化患者肝脏标本为研究对象，发现HBV cccDNA CpG岛区域甲基化程度与血清HBV DNA水平呈显著负相关。同时以体外转染实验验证HBV cccDNA甲基化程度越高，HBV cccDNA转录活性越低，进一步证实了HBV基因甲基化与HBV DNA载量之间的关系。不仅HBV基因甲基化参与这一过程，其他研究还表明HBc和HBx也存在这一现象。Zheng等研究显示HBx蛋白可通过与DNMT3a相互作用调节某些基因启动子区甲基化从而使该基因表达下调或上调，如IL-1R和金属硫蛋白1F（metallothionein 1F）基因启动子区甲基化引起基因表达下调，而CDH6和IGFBP3基因启动子区去甲基化分别引起相应基因表达上调。Guo等学者在研究CHB患者时发现，HBc蛋白可结合HBV cccDNA CpG岛2区，可使该区域甲基化水平下降，从而上调HBV的转录和复制水平。除此之外，DNA甲基转移酶基因多态性可能也与HBV的清除有关。因此针对基因DNA甲基化修饰这一现象，不仅宿主基因受到调控，病毒本身修饰也在其中发挥着重要的调控作用。然而在重型肝炎中，病毒基因甲基化的研究尚未见到相关报道。

三、宿主基因组蛋白修饰与乙型肝炎重症化

（一）组蛋白修饰机制

表观遗传修饰除了DNA甲基化修饰以外，还有一种常见的方式，即染色质结构修饰，不同的染色质结构常影响到基因的表达。细胞对外在刺激所做出的每一个反应几乎都会涉及染色质结构的改变，这一改变是通过修饰组蛋白、变换组蛋白密码实现的。

核小体中组蛋白和147个DNA碱基的位置及组蛋白尾部的特殊修饰对维持基因的表达模式和染色体正常结构及功能有重要价值。组蛋白在进化中是保守的，但并不是静态不变的，组蛋白翻译后的修饰会导致核小体结构发生改变，从而提供一种可识别的标志，称为组蛋白密码。组蛋白密码提供了效应蛋白的结合位点，后者能与核小体结合并能识别组蛋白尾的修饰形式，通过染色质改型调节基因的表达。组蛋白尾修饰对基因表达调控的作用取决于修饰的种类、被修饰的氨基酸残基及其他在N端多肽链上所处的位置。

组蛋白乙酰化往往与转录激活相关联，转录活跃的染色质部分富含乙酰化的组蛋白，组蛋白乙酰化选择性地使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放相关基因的转录，增加其表达水平；组蛋白H3和H4的低乙酰化与异染色质和转录不活跃的染色质部位相关。组蛋白N端乙酰化时失去正电荷，使其与DNA的结合能力减弱，并以某种方式引起染色质结构变得比较开放，而有利于转录。

组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达。研究发现，在转录活性染色质区，组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）被乙酰化，而在基因沉默的异染色质区则是被甲基化；转录抑制因子异染色质蛋白1（HP1）的Bromdomain能与甲基化H3K9结合，参与异染色质的重新组装，抑制基因转录。Bromdomain是目前发现的第一个能选择性地与组蛋白尾部的共价结合物（如乙酰化赖氨酸等）相互作用的蛋白质结构域，它存在于许多有内源性组蛋白修饰酶（如HAT）活性的转录调节因子中。组蛋白H3的第4、9、27、36、79位和H4第20位赖氨酸的甲基化，在基因表达和染色质功能调节中起重要作用。目前认为，组蛋白精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控较为稳定的标志，H3K4甲基化与基因激活相关，而H3K9和H3K27甲基化与基因沉默相关。赖氨酸甲基化有单甲基化、双甲基化及三甲基化三种不同的形式，它们显著扩大了组蛋白复合体的密码调控信息。

除上述乙酰化和甲基化修饰外，还存在组蛋白的磷酸化、泛素化、ADP核糖基化和苏素化等修饰。染色质内八个核心组蛋白所形成的组蛋白修饰组合大大增加了所蕴含的遗传信息量。靠传统的方法研究单个或几个组蛋白位点的修饰已经很难从基因组水平来研究组蛋白修饰与疾病之间的关系。因此，微型、高通量、集成化的组蛋白修饰抗体芯片的运用，可以从表观遗传学角度更好地帮助人们理解疾病的发病机制并为研究新的治疗手段提供理论基础。

（二）组蛋白修饰与乙型肝炎重症化的关系

组蛋白的N末端可通过共价修饰作用发生乙酰化、甲基化、泛素化及磷酸化等翻译后修饰，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密码，其中乙酰化是最为重要的修饰方式。组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶（HAT）和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）协调催化完成的。组蛋白修饰能够引起核小体结构的变化，导致染色体重塑，影响各类转录因子与DNA的结合，进而影响基因的转录。组蛋白乙酰化对维持组蛋白的功能和DNA转录是必需的，组蛋白乙酰化的平衡或失衡将引起相应的染色体结构和基因转录水平的改变，并可参与许多疾病的发生。有文献表明，组蛋白修饰与微生物感染密切相关（表4-3）。赵英仁等通过比较不同组别（慢性乙型肝炎耐受期、慢性乙型肝炎激活期、慢性乙型肝炎相关肝衰竭及正常对照组）外周血CD4 ⁺ T淋巴细胞中组蛋白H3K9在全基因组启动子区乙酰化修饰状态，发现了一些特异性的差异基因。以25例慢性乙型肝炎耐受期患者、19例慢性乙型肝炎激活期患者、23例慢性乙型肝炎相关肝衰竭期患者和28例正常对照者为研究对象，采用磁珠法分选CD4 ⁺ T淋巴细胞，采用染色质免疫共沉淀联合芯片（ChIP-chip）等方法对全基因组进行检测并分析。结果发现，CD4 ⁺ T淋巴细胞基因组H3K9乙酰化修饰在各组慢性乙型肝炎患者中是一种普遍存在的现象。慢性乙型肝炎不同临床分期H3K9乙酰化修饰状态存在显著不同。CD4 ⁺ T淋巴细胞是一种免疫细胞，笔者针对相关免疫炎性基因在各组中H3K9乙酰化修饰差异进行分析，发现CYP4F11、IGF2和IL-27这三个免疫炎性基因在不同临床分期患者中均存在乙酰化修饰，这可能与HBV感染本身密切相关；有四个炎性基因（C1QC、MBL2、P2RX1和REG3A）乙酰化修饰是肝衰竭组独有的，可能主要参与了肝衰竭的发生；三个基因（CD28、KRT1和YWHAZ）为慢性乙型肝炎激活组、肝衰竭组共有，而正常对照组和慢性乙型肝炎耐受期患者均无乙酰化修饰，它们可能参与了肝脏损伤过程。另外，研究报道在托屈嗪药物诱导的肝衰竭患者肝脏中，采用免疫组织化学方法观察到组蛋白H4的乙酰化相对于急性甲型肝炎患者肝脏中的表达显著下降，且进一步在小鼠模型中观察到托屈嗪药物剂量与组蛋白H4乙酰化状态呈明显的负性剂量效应关系，表明组蛋白修饰参与了托屈嗪药物诱导的肝衰竭的发生。这些研究说明，组蛋白修饰在乙型肝炎重症化过程中也发挥了重要作用，可能为今后CHB的发病机制研究提供新的线索。

此外，HBV基因组相关的组蛋白乙酰化作用与HBV DNA载量的关系亦有部分报道。Pollicino等研究发现，HBV cccDNA所包装形成的微小染色体的组蛋白H3与H4均存在乙酰化修饰，通过转染线性HBV DNA进入HuH7细胞系的体外研究表明，HBV cccDNA的H3/H4组蛋白乙酰化修饰程度与HBV DNA复制水平呈正相关，在人类肝脏组织内同样观察到这种现象。何松等最近同样通过转染线性HBV DNA基因组进入HepG2细胞系观察到，HBV cccDNA形成的微小染色体可被乙酰化、单甲基化和磷酸化修饰，进一步发现H3乙酰化和单甲基化程度与HBV DNA复制水平呈正相关。HBx蛋白的反式激活作用及致癌机制目前已获得认可，有研究发现HBx蛋白也参与了cccDNA微小染色体乙酰化修饰过程，且HBx蛋白的表达水平与HBV复制水平平行。进一步研究发现，HBx突变后可导致cccDNA的组蛋白低乙酰化，在早期阶段去乙酰化酶HDAC1和hSirt1相应增加，最终HBV cccDNA转录明显减少，提示HBx蛋白可以通过表观遗传修饰影响HBV cccDNA的转录表达和HBV DNA的复制水平。IFN-α是目前公认为抗HBV的有效药物之一，它可以通过直接抗病毒和间接抗病毒起作用，Guo等报道，IFN-α/IFN-γ和STAT相关通路的基因转录水平均与HDAC的活性呈正相关，提示在HBV感染性疾病中，无论是HBV自身，还是宿主的抗病毒免疫反应均参与组蛋白乙酰化修饰，它们相互之间是如何调控，与疾病发生、发展的关系都有待探索。该部分研究才刚刚起步，相信更多相关的研究会引起科学工作者足够的关注。

至于组蛋白其他修饰，如甲基化、磷酸化、核糖基化、泛素化和苏素化在HBV感染性疾病中的研究报道甚少，与其他病毒性感染相关研究也仅有少数报道。Tseng等团队发现丁型肝炎病毒的小HDAg（small HDAg）基因可被磷酸化、乙酰化、甲基化和苏素化（SUMO）修饰调控，其中苏素化修饰可致病毒基因组RNA合成和相应mRNA转录增加。Matto等报道以HCV转染的Huh7.5细胞系为研究对象，发现ADP核糖基化因子1（Arf1）可以抑制病毒RNA复制和减少病毒分泌。Garcia等学者发现，HBV核心蛋白含有的精氨酸（K7/K96）位点中K96存在泛素化结合位点，一般情况下，此位点的泛素化修饰与病毒颗粒的分泌有关，另有研究结果提示，HBV的该位点修饰不影响HBV复制和分泌，但可能在病毒复制周期中发挥作用。虽然迄今为止尚未见这些组蛋白修饰方式与HBV复制和感染病程关系的报道，但这些修饰调控在病毒感染性疾病中可能是广泛存在的，相信日后的研究会逐渐揭开这些修饰的作用和机制。

四、宿主基因miRNA与乙型肝炎重症化

（一）miRNA的作用机制

miRNA是由约22个核苷酸组成的非编码单链RNA，是一类在动植物中新发现的基因表达调控因子，其参与基因转录后调控。根据miRNA与靶基因互补性的不同，miRNA负性调控靶基因表达的机制可分为以下两种。

（1）当miRNA和靶基因mRNA的3′-UTR几乎完全配对时，miRNA诱导RNA介导的干扰途径，导致靶基因mRNA转录本在miRNA关联的多蛋白RNA介导的沉默复合体（miRISC）中被核酸酶剪切而降解。

（2）大多数miRNA与靶基因不完全互补，不足以产生序列特异性断裂。miRNA与AGO蛋白结合形成复合物后，靶向mRNA进入细胞质处理小体（P-bodies），通过三种方式抑制蛋白质合成：①诱导mRNA脱腺苷酸化和脱帽，启动mRNA降解；②通过AGO蛋白和翻译起始因子竞争与mRNA m7G帽子的结合，阻碍功能性核糖体的装配，造成翻译起始抑制；③通过募集与多肽链降解（翻译延伸）相关的细胞因子（如肽酶）翻译后修饰，使核糖体脱离肽链或新合成的肽链迅速降解，这一过程发生在翻译起始后。

（二）miRNA与乙型肝炎重症化的关系

miRNA是非编码单链小RNA分子，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种重要细胞活动的调控。近年来研究发现，miRNA除与肿瘤发生密切相关外，还与多种感染性疾病的发生相关，以“基因降解或基因沉默”的角色参与了多种感染性疾病的发生和发展。在正常状态下，miRNA正常转录、加工、结合到靶mRNA的互补位点，通过抑制蛋白翻译或改变mRNA的稳定性来抑制基因表达，从而使细胞维持在一个正常的功能状态中。但是，如果机体受到某种微生物的感染，会引起某种或某些mRNA的表达失常，细胞内许多有重要作用的免疫细胞分泌细胞因子水平受到异常调控而表达减弱或增强，从而导致疾病活动或恶性进展。因此，有些miRNA通过抑制或增强细胞因子表达而发挥生物学功能，miRNA直接参与感染性疾病的发生及发展。

近两年，miRNA相关研究在HBV感染或肝炎研究领域已经有少许报道，但研究结果不尽一致。Xu等学者以101例肝癌患者、89例正常对照者、48例慢性乙型肝炎患者为研究对象，采用RT-PCR方法定量检测血清中miR-21、miR-122和miR-223的表达。结果显示，血清中miR-21、miR-122及miR-223的表达在肝癌组明显高于正常对照组。另外，这些miRNA在慢性乙型肝炎组也能被检测出，且miR-21及miR-122的表达明显高于肝癌组。ROC分析表明，血清中miR-21、miR-122及miR-223的表达升高可以作为肝损伤的新生物学指标，而不属于肝癌所特有。但最近Tomimaru等学者通过收集126例肝癌患者、30例慢性乙型肝炎患者和50例正常对照者及10例肝癌患者手术前后血浆标本，采用RT-PCR方法检测血浆miR-21的表达并分析其与AFP的相关性，结果显示肝癌患者手术后miR-21的表达较手术前明显减少。miR-21的表达在肝癌组明显高于慢性乙型肝炎组和正常对照组。ROC分析表明，miR-21可作为与AFP相似的诊断肝癌的生物学指标。其结果与Xu等学者研究结果截然相反，可能系由选择标本定义未进一步限定所致，因肝癌和慢性乙型肝炎均可进一步细分为不同临床状态，包括小细胞肝癌、大细胞肝癌、慢性乙型肝炎耐受期、慢性乙型肝炎清除期，以及其他伴随疾病，如肝硬化等。而Kron等的研究结果提示，miR-122a可通过沉默腺病毒包装的HBsAg表达来增强、提高CD8 ⁺ T淋巴细胞功能，从而发挥抗病毒效应，或可解释Xu等关于miR-122可反映肝损伤的发现。此外，以肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎和胃癌、正常对照组作为研究对象，通过实时定量PCR结合miRNA芯片检测法寻找特异性miRNA作为某类疾病的生物标记。结果发现有110个血清miRNA种类被检测到，其中miR-885-5p在肝癌、肝硬化和慢性乙型肝炎组血清中表达量显著高于正常对照组和胃癌组，进一步与AFP、ALT、AST、GGT比较后发现，此miRNA（miR-885-5p）可作为判断肝损伤的指标之一。另有研究对小鼠模型转染可大量表达miR-221的腺病毒，发现过量表达miR-221能够调节（减缓）TNF超家族6诱导的肝炎及暴发性肝衰竭。以上不同学者的研究结果具有明显的差异，这些差异可能与标本选择、实验操作手段和选择检测数据的材料及方法不同有关，且缺乏深入机制上的反复验证实验。然而，这些新近的研究显示了miRNA在HBV感染致肝损伤过程中存在差异性表达现象，与表观遗传学的可逆性调控、不同状态下的调节模式不无关系，有很大的提升空间，尚需进一步探索。

miRNA对HBV复制的影响也有少数文献报道。Zhang等发现miR-1可以通过扩大Farnesoid X受体表达提高HBc基因启动子转录，且能够通过靶向HDAC4和E2F转录因子5来抑制细胞增殖和保持细胞处于G1细胞分化状态，从而有利于HBV复制。研究者在HepG2 2.2.15研究模型中发现，miR-199a-3p和miR-210可抑制HBV复制。另有研究发现，基于HBsAg的慢病毒miRNA表达系统也可抑制HBV复制。这些研究均提示miRNA在HBV感染中普遍存在且各自发挥不同作用。

有研究表明，在不同疾病状态下HBV感染者体内miRNA的表达存在显著差异，且在HBV感染相关慢加急性肝衰竭组检测到的差异，miRNA数量最多。中国科学院微生物研究所田波教授等以HBV携带者、CHB患者、HBV相关慢加急性肝衰竭患者和正常对照者为对象，采用ABI公司miRNA表达芯片检测不同组别患者血清中整体miRNA表达水平，并分析它与临床指标的相关性。结果显示，属于HBV相关慢加急性肝衰竭组的特异性miRNA种类达36种之多，它们分别为miR-200b、miR-212、miR-15a、miR-139-3p、miR-18a、miR-652、miR-28-5p、miR-152、miR-886-5p、miR-101、miR-100、miR-18b、miR-128、miR-363、miR-502-5p、miR-629、miR-449b、miR-501-5p、miR-130b、miR-296-5p、miR-27b、miR-362-5p、miR-505、miR-337-5p、miR-133b、miR-183、miR-142-5p、miR-148b、miR-501-3p、miR-148a、miR-22、miR490-3p、miR-625、miR-296-3p、miR-375、miR-886-3p。虽然进一步的研究资料仍较缺乏，但至少可从侧面反映出miRNA参与了乙型肝炎重症化的发生，其机制尚需进一步阐明。

五、宿主基因siRNA与乙型肝炎重症化

（一）siRNA的作用机制

siRNA是通过人工体外合成而转染进入体内的，是RNA干扰的主要执行者。它的作用机制与miRNA基本相同，明显不同之处在于siRNA往往是外源导入或病毒感染诱导产生的，而miRNA则是内源性产生的。siRNA通过与mRNA同源配对而使mRNA降解，使靶基因沉默，它既可用于某种疾病发病机制的研究，又可用于疾病的治疗，其作用如同特异性生物导弹。目前至少有五种siRNA药物已进入临床验证。

（二）siRNA与乙型肝炎重症化的关系

如前所述，siRNA主要针对特异性靶位点导入外源性小RNA分子，从而封闭或降解相应的RNA转录。因此，目前研究主要体现在何种位点siRNA导入可以引起哪些相应的生物效应。暂时还鲜见siRNA与乙型肝炎重症化关系的研究报道，但已在其他因素（如四氯化碳、伴刀豆球蛋白A、脂多糖等）诱导的急性暴发性肝衰竭患者体内进行尝试性研究。采取的靶位点主要为与凋亡及凋亡诱导相关基因（如Fas、Caspase 8、TGF受体Ⅱ基因等）和参与肝衰竭发生的细胞因子基因（如细胞因子骨桥蛋白（OPN）基因），结果均显示siRNA可下调肝细胞凋亡和（或）缓解暴发性肝炎中肝细胞损伤程度。Song等将Fas siRNA预先给雄性BALB/c小鼠尾静脉高压注射3次，在siRNA给药后的24h，采用尾静脉高压注射伴刀豆球蛋白A诱导小鼠暴发性肝炎，结果显示伴刀豆球蛋白A给药20h后对照组和绿色荧光蛋白siRNA对照组出现了广泛的肝细胞损伤，而预先用Fas siRNA治疗则阻断了肝细胞坏死，消除了炎性细胞浸润，肝细胞只发生肝细胞坏死；例外的是Saito等在相同小鼠模型中发现，给予OPN siRNA尾静脉注射3次后同样可阻断伴刀豆球蛋白A诱发的肝细胞损伤，肝组织几乎正常，很少出现肝坏死和出血，而对照组出现了大块的肝细胞坏死。体外实验中Zender等将Caspase 8 siRNA预防性孵育HepG2细胞48h，再利用腺病毒表达的Fas配体诱导HepG2细胞凋亡，12h后与对照组比较发现，Caspase 8 siRNA可阻断Fas介导的HepG2细胞凋亡。Mizuguchi等体外实验表明，预先应用shTGFβRⅡ-1转染小鼠肝细胞株BNL CL2 3次，从而抑制了重组人TGF-β1诱导的肝细胞凋亡。上述研究提示在肝衰竭发病中的各个环节均可作为siRNA治疗的候选靶标。与此相关的结果有希望对乙型肝炎重症化治疗提出新的治疗路径。

有关siRNA对HBV复制影响的研究已有多方面报道。目前研究主要针对HBV DNA或HBV cccDNA各个不同区域片段进行相应siRNA设计（如HBc编码区、HBsAg编码区、RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ编码区、HBV RNA转录保守区等），探讨对HBV DNA或相应蛋白表达水平的影响。研究结果表明，这些区域所设计的siRNA通过慢病毒或腺病毒转染入肝癌细胞系，均可不同程度地抑制HBV DNA复制。尤其值得注意的是，Yu等尝试通过针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）设计siRNA进行免疫机制干扰，结果发现可下调CTLA-4 mRNA表达并上调IFN-γ和IL-2的分泌，从而为慢性HBV感染患者的治疗带来新希望。相信有关研究同样对利用siRNA治疗乙型重型肝炎有一定的启发。

六、表观遗传修饰之间的相互调控与乙型肝炎重症化

表观遗传修饰能从多个水平或层面调控基因的表达，而不同水平的调控之间是相互关联的，任何一方面的异常都可能影响到其他水平或层面的表观遗传修饰。正如研究得出的结果，不同水平的表观遗传修饰在真核细胞中是相互制约和调控的。

（一）表观遗传相互调控的机制

1.启动子区甲基化诱导组蛋白去乙酰化

大多数启动子区高甲基化均有其CpG结合蛋白（methy-CpG binding proteins，MeCPs，包括MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4五个家族成员）存在，而非甲基化的启动子区通常缺少MBD蛋白。启动子区甲基化的CpG与MBD蛋白特异性结合，后者再招募组蛋白去乙酰化酶（HDAC）形成复合物，使核心组蛋白尾区去乙酰化，形成更紧密的DNA包装，限制了转录因子到达它们结合部位的通道，抑制了甲基化的DNA转录。这方面的研究发现正好把MBD蛋白招募HDAC与染色质改型的机制联系起来。

2.miRNA的表达受其他表观遗传修饰调控

如前所述，miRNA的发生和组织特异性调节都已经有明确的阐释。然而对于翻译后产物miRNA是否同样也受其他表观遗传修饰的调控？在肿瘤相关研究中，显示miRNA的表达也会受到甲基化和其他表观遗传修饰的调控。一个证据是用去甲基化药物或组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理膀胱癌细胞，可导致大约5%的miRNA表达上调。例如，miR-127基因的启动子区CpG岛的高甲基化导致了miR-127表达沉默，用去甲基化药物或组蛋白乙酰化酶抑制剂治疗后，miR-127的潜在靶基因Bcl-6的表达明显下调。另外在71例原发性乳腺癌患者中，研究人员发现，多种miRNA（miR-91、miR-124a3、miR-148、miR-152及miR-663）都发生了不同程度的甲基化异常（34%～86%），相关性分析发现这些miRNA甲基化与患者体内肿瘤抑制基因（如RASSF1A、cyclin D2、DAP kinase、SOCS-1等）的甲基化水平高度相关。毫无疑问，除了缺失和突变外，miRNA表达异常同样受其他表观遗传修饰的影响。

3.siRNA指导DNA甲基化和组蛋白修饰

siRNA诱导的基因沉默最早仅认为是发生在细胞质内的转录后水平的调控过程，随着siRNA指导DNA甲基化现象的发现，人们已证实siRNA可通过指导基因组表观遗传修饰引起转录水平基因沉默。siRNA诱导的转录水平的基因沉默是通过基因组表观遗传修饰完成的，包括指导基因组DNA甲基化和指导组蛋白修饰。在细胞质中，siRNA指导的基因组修饰和诱导转录水平的基因沉默则是RNA与DNA序列相互识别产生的生物学效应。siRNA可以和一些蛋白质复合物结合，指导它们作用于核内的基因组靶DNA，引起基因在转录水平发生沉默。

（二）表观遗传修饰相互调控与乙型肝炎重症化的关系

目前针对乙型肝炎重症化作用机制在表观遗传方面上的研究尚处于起步阶段，少量研究如前所述。这可能与其疾病本身的背景相关，随着各种抗HBV药物的开发上市，药物疗效资料的积累，抗病毒治疗在阻止该疾病进一步进展中的重要性越来越明确。宿主基因种类繁多，达数万个，研究一时难以界定某种基因在该疾病中是否占有绝对的作用，但HBV本身是一个仅有3.2kb的基因序列。因此学者们常针对HBV基因组进行有针对性的与病毒复制有关的研究。HBV cccDNA本身可以组装成含有组蛋白和非组蛋白的微型染色质结构，Gong等探讨该微型染色质结构H3组蛋白是否受到多个种类的修饰调控，以含有HBV基因组的细胞模型为对象，发现HBV cccDNA的组蛋白H3可发生乙酰化、单甲基化和磷酸化，进一步分析提示H3乙酰化和单甲基化程度与HBV DNA复制水平呈正相关，表明这两种组蛋白修饰可能共同参与了HBV DNA复制调节。Zhang等通过转染许多已知的miRNA进入肝癌细胞系发现，miR-1可以显著增加HBV复制和其相关RNA及蛋白质的表达。通过生物信息学和荧光报告基团方法证实miR-1主要通过影响组蛋白去乙酰化酶4和E2F转录因子5来抑制细胞增殖和保持细胞处于G1期细胞分化状态，从而有利于HBV复制。此外，在与HBV密切相关的HDV致病机制中，同样发现了小型丁型肝炎抗原（S-HDAg）基因可被多种表观遗传修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化和苏素化，且发现苏素化修饰致HDV基因组RNA合成和相应mRNA转录增加。以上结果提示表观遗传修饰在病毒基因表达调控时可以是多个种类，且它们相互协调和制约，但机制尚需进一步研究。

七、展望

大量研究提示，表观遗传与经典遗传及环境因素等在疾病发生及发展中同样起着十分重要的作用（图4-9）。DNA甲基化、组蛋白乙酰化等表观遗传修饰同时发生，也可能出现修饰类型的异常和相互之间平衡的紊乱，从而造成基因表达的上调或下调，引起细胞生物学功能改变，包括机体实质细胞、免疫细胞等多个方面。同时表观遗传的一个重要属性是其修饰具有可逆性，有可能与疾病演化过程的关系更为密切。

ncRNAs，非编码RNA；Me，甲基。

（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）

HBV感染呈多种转归模式，包括急性肝炎、重型肝炎、慢性肝炎、病毒携带状态、HBV相关肝硬化和肝癌等，且有重型肝炎早期、极期及慢性HBV感染免疫耐受期、清除期、控制期和再激活期等多种不同的疾病状态。在不同状态下表观遗传修饰的动态变化规律和疾病预后之间的关系，是值得下一步关注和探讨的课题。核苷（酸）类似物及IFN-α治疗过程中涉及哪些表观遗传学的改变，这种改变与治疗预后之间的关系同样需要我们继续探索。HBV本身的表观遗传修饰，除对病毒本身的影响以外，是否与机体的表观遗传修饰之间存在联系的研究还未涉及。在肿瘤研究方面，采用DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白乙酰化酶抑制剂治疗已经进行了临床前研究。是否通过重型肝炎表观遗传规律的改变寻找新的治疗靶点和路径也会成为人们感兴趣的课题。

总之，无论从表观遗传修饰的模式上，还是从不同修饰模式的平衡调节上，笔者的研究仅处于研究初始阶段，相信它会成为未来的热点方向。

综上所述，表观遗传学是一门不同于传统遗传学的新兴学科，它是可逆、可遗传的和不涉及基因组序列改变的调控方式，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰（乙酰化、甲基化、磷酸化、核糖基化、泛素化和苏素化等）及RNA干扰等。乙型肝炎重症化表观遗传学研究提示，DNA甲基化、组蛋白乙酰化和microRNA可能参与了乙型肝炎重症化的发生及发展。关于HBV的表观遗传修饰调控研究已表明：表观遗传调控可能以多种修饰模式影响HBV复制水平。这些研究展示了乙型肝炎重症化的表观遗传修饰可能不仅涉及单个模式调控研究，还可能存在多种其他模式。结合表观遗传可逆性特点，在HBV相关肝炎的不同疾病状态，不同转归模式中的动态研究可能是今后探索的方向和未来的热点。

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