下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
乙型肝炎的发生、发展和转归，是病毒（病毒载量、变异、进化等）和宿主（遗传异质性、年龄、性别等）通过免疫应答相互作用导致的。过去认为，常见复杂疾病的遗传因素主要是常见变异的贡献。近年来，随着全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）和新一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术的发展及应用，大量与复杂疾病相关联的遗传变异位点被发现和鉴定出来，GWAS在揭示疾病易感位点和通路方面发挥了很大作用，使得复杂疾病遗传学超越了小规模、局部位点研究的限制，给复杂疾病遗传学领域带来了一场革命，也使得大量关联的罕见低频变异得以被重视和认识。本节结合我们的研究经验，重点探讨罕见低频变异在乙型肝炎重症化中的影响和作用。
1.复杂疾病的遗传因素及理论假说
常见复杂疾病（common complex disease）通常由许多微效累加基因与环境因素共同作用而决定，如糖尿病、哮喘、高血压、动脉粥样硬化、精神分裂症、肿瘤等，存在多基因相互作用、遗传异质性、疾病异质性、性状变异呈现连续的数量级差、遗传模式不明确、不完全外显、异位显性等特点。乙型肝炎重症化，是病毒（病毒载量、变异、进化等）和宿主（遗传异质性、年龄、性别等）通过免疫应答相互作用导致的常见复杂疾病。对复杂疾病遗传因素的研究主要依据两种假说：其一是“常见疾病和常见变异（common disease & common variant，CDCV）”假说，此假说认为常见复杂疾病的遗传因素主要来自人群等位频率高但外显率相对较低的常见变异；其二是“常见疾病和罕见变异（common disease & rare variant，CDRV）”假说，此假说则认为复杂疾病的遗传因素主要由大量的人群等位频率低但外显率高的罕见低频变异所致，该假说基于人类进化角度，认为疾病有害健康，在人类进化过程中会被淘汰，因此疾病等位基因应该是罕见的。
2.研究模型
1）常见变异模型
在复杂疾病遗传易感性研究中，关联研究-连锁不平衡分析这类非参数分析方法最为常用，统计效能也远高于家系连锁分析。疾病的遗传关联研究有两种策略，一种是基于功能候选、预先假设的候选基因策略，一种是基于数据驱动、全局性观察的全基因组关联策略。鉴于候选基因策略在基因选择上的局限性和易于受到群体遗传结构的影响导致假阳性，早在20世纪末，人们就提出开展系统的、无选择偏倚的、全基因组范围的关联研究的设想，认为只要把基因组范围内的常见变异进行分型，就能对复杂疾病进行遗传易感位点的作图和鉴定，也就是全基因组关联研究。
候选基因策略研究以及GWAS都基于两个常见变异模型：CDCV模型和无限小模型（infinitesimal model）。CDCV模型认为少量的中等效应的常见位点在个体中起主要作用，多数复杂疾病如糖尿病、心血管疾病、肿瘤的GWAS结果切合这一模型。而无限小模型则认为是大量的微小效应的常见位点在个体中起主要作用，无限小模型在定量性状的GWAS中被得到证实，如身高、身体质量指数（BMI）、血清肝酶水平等定量性状。过去十年，通过GWAS发现了大量与复杂疾病相关联的变异，在揭示新的疾病易感位点和通路方面发挥了很大作用，复杂疾病遗传学超越了小规模、局部位点研究的限制，给复杂疾病遗传学领域带来了一场革命。GWAS策略不需要预先选择候选基因并做出假设，而是直接选取全基因组范围数以十万计的单核苷酸多态性（SNP）位点和数以十万计的拷贝数变异（CNV）探针，进行全基因组关联分析，以找出复杂疾病的易感变异，同时发掘其背后隐藏的生物学机制。这种策略使得人们可以从全基因组角度对复杂疾病的遗传特征产生全局性、系统性的认识。与传统的基于候选基因策略的关联研究相比，全基因组关联策略在统计效能上有着极大的提高，避免了群体分层偏倚和基因选择的偶然性。随着成本的降低，几乎所有的重大复杂疾病和定量性状都完成了全基因组关联分析，在肝病等研究方面，已经报道的GWAS包括药物性肝炎、丙型肝炎、乙型肝炎病毒（HBV）感染清除、HBV疫苗反应性、脂肪肝、HBV相关肝癌、HBV相关慢加急性肝衰竭等疾病表型。
2）罕见变异模型（rare-alleles model）
随着GWAS在各种疾病性状中的广泛开展，人们发现其结果并不能如最初预期的那样将所有致病位点一网打尽，事实上，GWAS发现的常见遗传变异仅能解释部分遗传性状，其原因在于GWAS选取的SNP和CNV标记多是人群常见的高频位点（等位频率≥5%），常见变异频率较高但外显率较低，导致大量的“遗传性丢失（missingheritability）”。越来越多的研究提示低频变异（等位频率<5%）对常见复杂疾病或性状具有同样重要的贡献，罕见变异模型认为低频变异往往具有较高的外显性，可解释部分的遗传性丢失。高通量测序是低频遗传变异关联研究最理想的策略，多项研究发现低频变异与冠心病、炎症性肠病、阿尔茨海默病、痛风、自闭症、抑郁症等复杂疾病相关。
3）广义遗传模型（broad-senseheritability model）
广义遗传模型认为普通变异的加性贡献以及罕见变异的强效应不足以解释遗传力的缺失，因此提出复杂疾病的遗传效应由非加性成分组成，包括基因-基因相互作用（即易位显性或上位效应）、基因-环境相互作用以及表观遗传修饰作用。由于方法本身的局限性，以及环境因素难于界定、测量，并且个体之间所处的环境变量差异巨大，GWAS无法检测基因-基因相互作用，也对基因-环境相互作用无能为力。
有学者认为，在人类的自然进化过程中，常见变异出现较早并经受了负选择压力的净化，大部分倾向于中性效应而对疾病影响较小，即使某些常见变异具有很强的致病性，但同时也能进化出有利的功能来抵消其危害，如ApoL1基因常见变异在非裔美国人群中是慢性肾病的危险因素，但该变异可使该人群免于布氏锥虫罗德西亚亚种（Trypanosoma brucei rhodesiense）的感染；而低频变异出现较晚，尚未经历负选择压力的淘汰，因此在致病性上更具有危害性。事实上，遗传变异的频率与疾病风险程度通常成反比。常见遗传变异大多是低风险位点（相对风险度<1.5），而强效的高风险位点（相对风险度>2）往往罕见或是低频变异。在过去十年中，全世界的科学家开展了大量的针对罕见变异的研究，包括心血管疾病、神经精神疾病、肿瘤、炎症性肠病、痛风等疾病表型，得到了一系列很有意义的成果，不断阐述了罕见低频变异在复杂疾病和复杂性状中的作用，主要体现在以下几个方面。
罕见变异是复杂疾病遗传因素中重要的组成部分，罕见变异的纳入完善了复杂疾病和复杂性状的遗传机制，并进一步揭示了决定疾病表型或定量性状的遗传变异位点的数量及贡献比例（权重）。以抑郁症为例，重度抑郁症（major depression disorder，MDD）是一类常见的复杂性疾病，基于双胞胎和家系的研究显示其遗传度约为40%，然而常见变异仅能解释其中1/4的遗传度。抑郁症常见变异的鉴定并不容易，在2009—2013年超过10项的MDD大样本全基因组关联研究中，均没有发现明确的关联位点，2015年的一项中国人群超过1万人（CONVERGE队列）的基于低覆盖度全基因组测序的GWAS发现两个位点（SIRT1基因附近的rs12415800和LHPP基因上的rs35936514）与复发性抑郁症相关，但其关联性在欧洲7.5万人的两个队列中未得到验证。直到2016年一项基于130620例MDD患者和347620例对照的欧裔人群研究，才真正第一次鉴定出15个与MDD强相关的位点，可解释5%~6%的MDD遗传度。此后的一项135458例MDD患者和344901例对照的Meta研究，认为MDD患者中全基因组关联研究所用的常见SNP位点仅有8.7%的遗传度，不足1/4，该研究鉴定出的44个常见变异与MDD相关。由于基于常见变异的分析所需样本量巨大，而且并不能很好地鉴定抑郁症的遗传变异，因此越来越多的研究关注罕见变异。利用高通量测序技术，多项研究表明STXBP5、RIMS1、CTNNB1、NKPD1、LIPG、PHF21B、RCL1等基因的罕见变异与抑郁症显著相关，涉及钙通道受体、肌动蛋白聚合、树突棘形成、神经鞘磷脂合成等信号通路，研究还进一步发现罕见变异在不同种族的抑郁症患者中所起的作用可能不同，所有这些罕见变异的鉴定和信号通路的发现使得抑郁症的遗传机制得到完善和补充。
基于罕见变异的理论，人们鉴定出很多新的明确的强效致病基因位点。例如，既往研究鉴定出迟发性阿尔茨海默病（AD）的不少常见变异，这些变异虽然能被重复验证，但其遗传效应很弱，并且没有观察到明确的功能效应机制。Cruchaga等通过对14个迟发性阿尔茨海默病大家系进行全外显子组测序分析，在其中2个独立的家系里鉴定出磷脂酶D3（PLD3）基因上的一个罕见错义突变p.Val232Met与疾病共分离，在超过11000人的欧裔病例-对照人群中验证发现携带该突变的个体罹患迟发性阿尔茨海默病的风险是对照人群的2.1倍，把对照人群年龄控制在70岁以上，这种风险甚至提高到4.16倍。对PLD3基因的所有变异进行负荷检验，结果显示PLD3基因多个变异与阿尔茨海默病风险相关，功能实验证实PLD3蛋白参与细胞对β淀粉样前蛋白的处理过程。该研究也为如何利用大家系样本鉴定复杂疾病致病基因和低频强效变异提供了一个范例。另外，有研究对1795个冰岛人进行全基因组测序，在8号染色体（8q24）上鉴定出的一个新低频位点rs188140481A等位与前列腺癌相关（OR=2.9，p=6.2×10 -34 ）。英国万人基因组计划（UK10K）通过对10000人进行低深度全基因组测序（测序深度7×）和高深度全外显子组测序（测序深度80×），鉴定出多个与疾病或健康状态关联的罕见变异，如APOB基因与血清甘油三酯水平，LDLR基因与血清低密度脂蛋白胆固醇水平，ADIPOQ基因变异与脂联素水平等，这些低频变异的人群结构和功能注释也进一步为疾病宿主遗传机制提供了新的视角。
对罕见变异的深入认识有助于精确理解疾病的不同亚型。以肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）为例，HCM是一种比较常见的复杂的遗传心肌病，其绝大部分为常染色体显性遗传，外显率为40%~100%，既往研究认为MYBPC3、MYH7、TNNT2、TNNI3、TPM1、MYL3等基因的变异与HCM相关，这六个基因分别编码了心肌相关蛋白，包括心肌肌球蛋白结合蛋C3、β-肌球蛋白重链、心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I、α-原肌球蛋白以及肌球蛋白轻链3等肌小节结构蛋白，临床上70%的患者携带上述基因突变。而最近，一项对770例HCM患者的全外显子组测序研究发现，4例患者存在TTR基因的罕见突变c.424G>A（p.Val142Ile），该突变的全球人群发生频率为0.559%，同时存在心肌淀粉样变，是遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病亚型（ATTRv-CM）。TTR基因编码转甲状腺素蛋白，其致病突变可导致蛋白错误折叠、过量表达，使得不稳定的TTR淀粉样蛋白纤维在神经、心肌等部位沉积，是遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTRv）的致病基因；当然，随着年龄的增长，野生型TTR基因个体也可形成淀粉样蛋白纤维。研究者还发现，这一亚型的心肌病患者还可以合并经典的MYBPC3和MYL3基因突变。提示肥厚型心肌病患者需要精细鉴定病因、临床表现和致病基因位点。
对罕见变异的挖掘有助于针对功能通路发展靶向药物和促进个体化精准治疗。例如，针对TTR基因变异位点，科学家们开发出了一系列治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTRv）的药物，包括TTR稳定剂氯苯唑酸和二氟尼柳（diflunisal）、siRNA干扰分子Patisiran、反义寡核苷酸分子Inotersen等。其中氯苯唑酸就是针对TTR蛋白p.Val30Met变异的小分子稳定剂，Ⅲ期临床试验结果显示其对早发性神经性ATTRv疗效显著，在欧洲以及部分南美洲和亚洲国家，其已获批用于早期症状性多发神经病的成年患者，以延缓周围神经损伤。最近的一项多中心、国际、双盲、安慰剂对照的Ⅲ期临床试验中，研究人员证实氯苯唑酸对转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病（ATTRv-CM）患者同样有效，近期获得美国FDA批准，成为第一个且目前唯一获得FDA批准治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病（ATTRv-CM）的药物。另外，研究人员开发出一种针对TTR基因的小干扰RNA（siRNA），它可特异性阻碍和干扰细胞生成转甲状腺素蛋白，转甲状腺素蛋白淀粉样变性患者经siRNA治疗7天后转甲状腺素蛋白的水平降低38%；而其脂质纳米颗粒剂型可使转甲状腺素蛋白的水平降低87%。ATTRv特异性药物研发的成功也成为遗传性致死性复杂疾病基于基因罕见变异靶标开发治疗药物成功的典范。
总之，这些研究为人类更加深入地理解疾病的病理生理学过程和基础病因提供了更多的线索，同时也为评估预测罹患某疾病的风险提供了更多方法。这些结果对我们了解疾病的遗传易感性、探讨疾病的发病机制，以及有针对性地开展高危人群遗传筛查、制订干预措施，甚至指导疾病的治疗、预测患者预后等都具有重大意义。当然，受族群遗传背景、生活环境等因素的影响，不同人群中同一种疾病存在明显的异质性，提示我们在新药研发和临床诊疗过程中需要考虑人种的遗传背景差异。
与常见变异位点不同，低频变异和罕见变异位点人群频率低，通常低于5%，甚至低于0.5%，既往成熟的候选基因病例-对照研究、全基因组关联研究理论上并不适用于低频罕见变异位点的研究，相应地，传统的关联分析方法对低频和罕见变异的统计效能也极低。随着测序技术的发展，高通量测序在识别罕见变异、结构变异以及表观遗传学改变等方面，比芯片技术有更大的优势，常被用于低频变异关联研究，随后，科学家们也建立起了与之相应的统计检验方法来提高统计效能。
1.罕见及低频变异的检测方法
罕见变异的常用检测方法如下：①全基因组低深度测序（low-depth WGS），这是为控制成本常采用的一种方法，一个样本测序深度为30×的成本可以进行7~8个测序深度为4×的样本测序。有研究表明，在测序成本一定的情况下，相对于小样本的全基因组深度测序，大样本低深度测序在变异检测和疾病关联分析中都具有更强的效能。Li等研究证实，对于一个等位频率大于0.2%的位点，采用4×低深度测序3000个样本与30×深度测序超过2000个样本的效能是相似的。②全外显子组测序，该方法可以鉴定外显子上的所有变异，因外显子仅占人类基因组的1%~2%，故该方法较全基因组测序更为便宜，是目前最为常用的低频变异和罕见变异的鉴定方法，采用该方法，已鉴定出FOXP3与早发性胰岛素依赖的糖尿病、PLD3基因与迟发性阿尔茨海默病、APOB基因与血清甘油三酯水平、LDLR基因与血清低密度脂蛋白胆固醇水平、PNPLA5基因与血清低密度脂蛋白胆固醇水平等低频变异与疾病的关联，并鉴定出Kabuki综合征等单基因遗传病的致病基因。③靶基因区域测序，可以快速发现候选基因上的低频和罕见变异。④全基因组高深度测序（high-depth WGS）。⑤定制外显子区或者靶基因区的分型芯片。⑥极端表型抽样测序，在所需样本量巨大或者预算不足的情况下，可以考虑极端表型抽样测序，选取最具代表性和信息丰富的极端个体测序以提高分析效能，如家族性聚集的大家系患者。⑦GWAS芯片进行imputation分析得到低频变异，虽然GWAS芯片并不涵盖或极少涵盖频率低于5%的位点，但可以借助基因组数据库的连锁不平衡和单倍型数据，对已有的GWAS芯片分型结果进行imputation分析，也就是基因型插补，可以得到很多低频位点用于关联分析，这一方法只需要进行生物信息学计算，无需实验成本。
2.罕见及低频变异的关联分析统计检验方法
与罕见变异的特点相适应，科学家们开发出一系列罕见变异关联分析的统计方法，包括以下几种：①单变异检验（single-variant test），这是GWAS在加性遗传模型（additive genetic model）下的标准关联分析统计方法，该方法也同样适用于大样本的罕见及低频位点的关联分析，但在相同样本量的前提下，该方法对罕见变异的统计效能不如常见变异。②负荷检验（burden test），该方法将某一区域的多个变异进行遗传评分，然后对评分进行关联分析，该方法在某区域或基因大量低频变异均与疾病关联且方向一致的时候具有强大的检验效能。③适应性负荷检验（adaptive burden test），考虑到某区域或基因的不同变异对疾病的作用方向可能不完全相同，如有的位点是显著关联的风险因素，有的是保护因素，而有的则可能是中性的无关联位点，因此采用对变异进行加权或限定阈值的方式进行统计，可提高单纯的负荷检验的统计效能，这类改良的方法包括基于核函数的自适应聚类加权（kernel-based adaptive cluster，KBAC）检验、估计回归系数（estimated regression coefficient，EREC）检验、数据适应性加和检验（data adaptive sum test）、可变阈值（variable threshold，VT）检验等。④方差成分检验（variance-component test），对遗传效能的方差进行检验，在既有正向关联又有负向关联的情况下，或者致病变异较少的情况下具有强大的检验效能，常用的有序列核心关联检验（sequence kernel association test，SKAT）和C-alpha检验。⑤联合检验（combined test），是负荷检验与方差成分检验的联合应用。⑥其他，包括指数组合检验（exponential combination test，EC test）、效能计分合计检验（sum of powered score test，SPU test）以及基于泊松近似值的计分检验（Poisson approximation-based score test，PAST）等。后五类统计方法均是基于基因或者区域的多变异聚合检验，聚合检验可评估某基因或者某个区域多个位点的累加效应，进而提高检验效能。以各类方法为基础，科学家们开发了众多分析软件包，如EPACTS、MiST、SKAT、PLINK/SEQ、SCORE-Seq等，以及基于测序数据关联结果进行Meta分析的MetaSKAT、Meta-MultiSKAT，它们均可在网站上下载使用。
与其他常见复杂疾病的遗传因素类似，乙型肝炎重症化的遗传特征具有疾病异质性、遗传异质性和变异位点作用效能差异等复杂性。根据疾病的临床特征、疾病进程特性以及对治疗的反应，可以将乙型肝炎患者区分为自限性清除、无症状携带、重症肝炎、肝硬化和肝细胞癌等不同的疾病表型，每一种表型患者可能具有不同的遗传变异特征。虽然乙型重型肝炎是存在于东亚、东南亚的一种常见的乙型肝炎疾病表型，但在西方国家少见。目前，对HBV感染与清除、慢性HBV感染相关肝硬化及肝癌等疾病表型的遗传因素研究较多，但对乙型重型肝炎遗传易感性研究较少。我们在973计划（2007CB512903）和传染病防治国家科技重大专项（2008ZX10002-007、2012ZX10002007）支持下，采用Affymetrix SNP 6.0芯片（包括全基因组范围内90万个SNP位点和90万个CNV位点），在1300例HBV相关慢加急性肝衰竭（ACLF）患者和2087例无症状HBV携带者中进行全基因组关联分析，结果显示，HLA-DR/DQ基因区域是全基因组范围中国人群HBV-ACLF的主要关联位点，位于HLA-DR区域的rs3129859位点和HLA-DRB1*1202是HBV-ACLF最显著的关联位点和基因型，rs3129859是HBV-ACLF的独立风险因素，独立于肝炎突发和HBV再活化，并且风险等位与HBV-ACLF的临床进程相关。对HLA-DR和DQ蛋白进行三维建模，结果显示与HBV-ACLF相关联的HLA-DR和DQ的氨基酸均位于HLA抗原结合区，尤其是关联的DR氨基酸，全部在HLA-DR蛋白的抗原结合沟槽内。提示HBV特异性的CD4 + T淋巴细胞途径在其发病过程中可能起重要作用。我们进一步动态观察了HBV特异性的CD4 + T淋巴细胞反应，发现HBV特异性TNF-α CD4 + T淋巴细胞亚群与患者重型肝炎发作相关，HBV 特异性IFN-γ CD4 + T淋巴细胞亚群与肝炎发作患者发生HBeAg或HBsAg 清除相关。因此，宿主遗传因素在乙型肝炎的发生和发展以及重症化过程中发挥了重要作用。
1.罕见变异与慢性乙型肝炎
既往的全基因组关联研究以及基于候选基因策略的病例-对照研究显示，HLA-DP、HLA-DQ、IL-10、IL-18、IFN-γ、TNF-α、TLR-3、CTLA-4等基因上的常见变异与慢性乙型肝炎相关，HLA-DP、HLA-DQ、IL-28B、CYP27B1、OAS3等基因的常见变异与慢性HBV感染患者IFN-α治疗应答相关，HLA-DP、HLA-DQ等基因常见变异还与慢性HBV感染患者核苷（酸）类似物抗病毒疗效相关，而Patatin样磷脂酶结构域蛋白3（PNPLA3）p.Ile148Met变异增加慢性乙型肝炎患者肝脏脂肪变性和腹部脂肪含量增多的风险。近年来，多项研究表明，除了常见变异外，多个罕见变异也与慢性乙型肝炎相关。
Zhao等采用极端表型，对50例无已知风险因素的慢性乙型肝炎患者和40例未接受过疫苗免疫的HBsAb阳性健康人进行全外显子组测序，并进一步在1728例慢性乙型肝炎患者和1636例健康对照者中对其中6个位点进行Sanger测序，发现4个罕见变异与慢性乙型肝炎相关，包括跨膜蛋白2（TMEM2）p.Ser1254Asn、干扰素-α2（IFN-α2）p.Ala120Thr及其调节剂NLR家族成员X1（NLRX1）p.Arg707Cys和补体成分2（C2）p.Glu318Asp四个变异，联合p值小于2.0×10-16，OR值分别为2.45、4.08、2.34和1.97。
Peng等在1899例慢性乙型肝炎患者和1828例健康对照者中研究了HBV受体蛋白NTCP的编码基因SLC10A1的c.800C>T变异（rs2296651，p.Ser267Phe）对慢性HBV感染临床转归的影响，结果显示p.Ser267Phe变异显著降低HBV的易感性，是一个保护性变异位点（OR=0.36，p=5.7×10-23），建模分析显示p.Ser267Phe变异可能通过干扰配体结合进而阻止HBV进入细胞。Zhang等对2550例持续HBV感染和2124例自发性清除病例进行分析，发现在中国南方人群中SLC10A1基因p.Ser267Phe变异与持续HBV感染并无关联性，进一步在244例患者中进行SLC10A1基因外显子测序，也没有发现该基因存在与HBV持续感染相关联的罕见位点，eQTL分析影响SLC10A1基因表达的SNP与HBV持续感染也不存在关联性，因此作者认为在中国南方人群中SLC10A1基因变异并不是HBV持续感染的主要风险因素。此外，有研究发现SLC10A1基因内含子1的一个低频变异rs4646287可增加汉族人群的HBV感染风险。
除此之外，有学者还对慢性乙型肝炎患者的其他性状进行了罕见低频变异的发掘，如HBsAg和HBsAb双阳性状态。Wang等对101例HBsAg和HBsAb双阳性的患者和102例HBsAb单阳性对照进行全外显子组测序，并进一步在48例患者和200例对照中对OAS3基因测序进行负荷分析，发现OAS3基因的16个罕见变异与HBsAg和HBsAb共存状态显著相关（OR=17.27，p=7.299×10-9）。
2.罕见变异与肝硬化
肝硬化是慢性HBV感染常见的重症化类型，但其致病机制尚未完全阐明。宿主遗传因素在肝硬化的发生过程中起着重要作用，有学者估算肝纤维化和肝硬化的遗传度约为50%，铁氧还蛋白1（ferredoxin 1，FDX1）基因间区rs2724432的T等位与肝硬化和肝癌显著相关，信号转导及转录激活蛋白4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）基因rs7574865风险等位G与高加索人慢性HBV持续感染、肝脏炎症以及纤维化显著相关。甘露糖结合凝集素（mannose-binding lectin，MBL2）基因rs11003123和自噬相关16样蛋白1（autophagy related 16 like 1，ATG16L1）基因rs2241880位点（p.Thr300Ala）与HBV相关肝硬化基础上的肝癌相关。同时，学者还鉴定出一些保护性等位，例如，17-β羟基类固醇脱氢酶13（HSD17B13）基因rs72613567 dupA突变与慢性肝炎以及脂肪变性向脂肪性肝炎进展的风险降低相关，rs72613567 dupA突变发生在HSD17B13基因剪接供体的位置，突变发生后该基因功能丧失，并且与PNPLA3基因表达相协同，携带rs72613567 dupA基因的患者罹患肝硬化和肝癌的风险可分别降低15%和28%，脂肪肝的风险因素（如肥胖、酒精摄入、遗传易感位点等）可增强rs72613567 dupA基因型的保护效应，肿瘤坏死因子受体相关因子家族成员NF-κB的激活剂TANK的rs3820998位点G>T变异可能是肝硬化、肝癌以及HBV-ACLF发生和发展的保护因子。
最近，美国学者在两个大的样本队列——英国生物样本库队列（UK BioBank，UKBB，1088例肝硬化患者和407873例对照者）和密歇根基因组计划队列（Michigan Genomics Initiative，MGI，875例肝硬化患者和30346例对照者）中进行了分析，鉴定出PNPLA3、HFE、TM6SF2、MBOAT7、SERPINA1、HSD17B13、STAT4和IFNL4基因上或基因附近的8个遗传变异可重复影响肝硬化，这些变异与炎症、脂质合成以及蛋白复合物合成通路相关。在这些变异中，rs80215559（SLC17A2内含子上）、rs1800562（HFE基因外显子上，c.845G>A，p.Cys282Tyr）、rs28929474（SERPINA1基因外显子上，c.1096G>A，p.Glu366Lys）是低频变异。Hu等比较了SLC10A1基因p.Ser267Phe变异在3801例慢性HBV感染者（主要来自REVEAL-HBV队列）和3801例匹配的健康对照者中的分布，发现267Phe变异显著降低肝硬化（OR=0.65，p=0.002）和肝癌（OR=0.55，p<0.001）的发生风险，为肝硬化和肝癌的保护性突变。另外，研究者在HCV相关肝纤维化患者中发现TGF-β信号通路中内皮因子（ENG）基因的罕见变异富集，ENG基因p.Thr5Met变异与HCV相关纤维化显著相关（OR=3.04）。
3.罕见变异与肝衰竭
肝衰竭，尤其是HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是亚太地区肝病患者最主要的危急重症。欧洲基于酒精性肝硬化的ACLF以急性肝损伤和脓毒症所致的全身炎症反应及多器官功能衰竭为显著特点，主要激发天然免疫损伤；而我国ACLF与欧洲有所不同，以HBV感染为主，HBV介导的特异性免疫损伤在其发病过程中起重要作用。既往的研究表明，宿主CXCL10、IL-10、HLA-DR、AR、ER、CXCL16等基因上的遗传变异与慢性HBV感染相关肝衰竭显著相关，这些基因集中在宿主免疫应答通路上。
Ye等发现角蛋白K8基因的4个错义变异c.1022G>A（p.Arg341His）、c.1405C>T（p.Arg469Cys）、c.1406G>A（p.Arg469His）和c.1340C>T（p.Ala447Val）可增加慢性乙型肝炎（p=0.006）、HBV相关失代偿性肝硬化（p=0.076）和ACLF（p=0.017）的发生风险。Han等对10例暴发性HBV相关急性肝衰竭进行全外显子组测序，发现罕见变异高度富集于TLR信号通路（包括TLR-2，TIRAP，IRF7，IFNAR2，TRAF6，TLR-1，SPP1，MAPK12，IRF5，IRAK1，IKBKE和IFNAR1基因），10例患者中有9例患者检出上述基因的罕见变异，其中TLR-2基因的罕见杂合突变p.Phe679Ile在2例无亲缘关系患者中检出，进一步在312例非暴发性结局的HBV相关肝炎患者（124 无症状自限性HBV感染者、65例急性乙型肝炎患者、93例慢性乙型肝炎患者、30例HBV相关ACLF患者）中进行对照验证，结果显示暴发性HBV相关急性肝衰竭（ALF）患者679Ile变异频率显著高于非暴发性结局的HBV相关肝炎患者（p<0.001）以及1000G数据库人群（p<0.001）。结构和功能分析显示，p.Phe679Ile变异是一个功能丢失型变异，与野生型小鼠相比，给杂合型或者纯合型TLR-2基因敲除小鼠注射HBV质粒可引起更为显著的ALT水平升高和肝脏坏死性炎症。但Asgari等对21例既往健康发生暴发性HBV感染后需要肝移植的患者以及172例HBsAb/HBcAb阳性的无任何临床症状的对照者进行全外显子组测序，未找到任何基因或变异与成人HBV-ALF相关。
Peng等发现，SLC10A1基因p.Ser267Phe变异与健康状态相关，267Phe变异能显著降低慢性HBV感染者发生ACLF的概率（OR=0.48，p=0.007），其是ACLF的保护性等位。蛋白三维结构分析提示267Phe变异位于NTCP跨膜结构域9b区域，离HBV配体结合结构域（157~165）较近，可能影响HBV进入肝细胞的效率。
另外，罕见低频变异在HAV感染相关肝衰竭的发展中也起重要作用。Kim等发现HAV感染相关的肝衰竭与HAV受体HAVCR1（即TIM1）一个6氨基酸的插入变异（157insMTTTVP）显著相关。功能实验表明，157insMTTTVP插入型TIM1分子能更有效地结合HAV，可导致NKT 淋巴细胞针对HAV感染肝细胞的溶胞活性增强。HAV感染驱动了157delMTTTVP缺失型TIM1分子的自然选择，保护HAV引起的严重肝炎，但可能增加哮喘等变应性疾病的发生风险。一项针对10例HAV相关ALF患者的全外显子组测序结果也显示，多个基因的罕见变异在这一表型患者中富集，提示罕见变异在HAV感染重症化中起作用。
4.罕见变异与其他重症肝病
除病毒感染外，其他慢性肝病如遗传代谢性肝病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病等也可进展为肝纤维化和肝硬化，最终进展为肝癌和肝衰竭等重症肝病，这些疾病相关的遗传变异也在疾病的发生和发展中发挥重要作用。尤其是遗传代谢性肝病，本身就是单基因疾病，其相应致病基因的罕见变异导致其编码的酶缺陷进而引起肝脏代谢障碍，单个病种的遗传代谢性肝病发病率低，多为罕见疾病，如威尔逊病（Wilson disease）、α1-抗胰蛋白酶缺乏症（α1-antitrypsin deficiency）、糖原贮积病（glycogen storage disease）、遗传性血色素沉积症（hereditaryhemochromatosis）、酪氨酸血症（tyrosinemia）、先天性糖基化障碍（congenital disorders of glycosylation）、溶酶体酸性脂酶缺乏症（lysosomal acid lipase deficiency）等，均有导致肝硬化、肝癌或肝衰竭的报道。当这些疾病合并慢性HBV感染时，将给疾病的诊断、病因的鉴定和治疗带来更多困难和挑战。
卡塔尔学者回顾性分析了1997—2016年间收治的272例威尔逊病患者，其中有68例进展为ACLF（APASL标准）。68例患者中55例（80.9%）为未成年人，并且威尔逊病患者进展为ACLF后死亡率为73.1％，值得注意的是，在诱因明确的9例患者中，有6例是病毒性诱因导致的ACLF。ATP7B基因是威尔逊病的致病基因，在中国人群威尔逊病患者中检出频率较高的致病变异包括p.Arg778Leu、p.Pro992Leu和p.Ala874Val等位点，其人群频率极低，分别为0.000096、0.000032和0.000068。
我们也报道了一例患慢性乙型肝炎多年的17岁男性患者，其表现为肝大、脂肪肝、高尿酸血症、血糖偏低、肝脏多发腺瘤、青春期第二性征不发育、生长迟滞、身材矮小，多年来辗转多家医院未得到确诊，通过基因检测发现该患者G6PC基因外显子5上存在经典的致病纯合变异，结合患者肝细胞内大量糖原沉积，确诊为肝糖原贮积病Ⅰa型。通过口服“生玉米淀粉”这一唯一有效的治疗方式，患者病情在一年内得到极大改善，开始生长发育，一年内长高17 cm，第二性征开始显现。
SERPINA1基因是α1-抗胰蛋白酶缺乏症的致病基因，Pi*Z、Pi*S以及Pi*M是其主要的致病基因型。最近，欧裔人群一项大样本研究显示，低频变异位点Pi*Z rs28929474增加非酒精性脂肪性肝病患者（OR=7.31，p=0.001）以及慢性酒精使用者（OR=5.79，p<0.0001）罹患肝硬化的风险；而Pi*S rs17580位点则没有这样的相关性。但是一项立陶宛人群的研究显示了完全相反的结论，该研究共纳入302例肝硬化患者（病因以酒精性和HCV感染为主）、127例肝纤维化患者（HCV感染者占91%）和548例对照者，结果显示，Pi*Z rs28929474位点与肝纤维化或肝硬化无关，而低频变异位点Pi*S rs17580 是进展为肝纤维化（OR=3.42，p=0.001）和肝硬化（OR=2.59，p=0.02）的高风险位点。
酪氨酸血症Ⅰ型（tyrosinemia type Ⅰ，TYR Ⅰ）可导致肝硬化甚至进展为肝癌，酪氨酸血症Ⅰ型是由延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）缺乏引起的，有研究者报道了3例继发于特发性肝脾肿大和肝硬化的婴儿期肝细胞癌，全外显子组测序显示FAH基因上位于FAH酶催化口袋内的一个罕见纯合错义突变c.424A>G（p.Arg142Gly）是这些患者的致病基因。值得注意的是，这些患者并没有典型的琥珀酰丙酮和酪氨酸水平的提高，给疾病的诊断带来极大的难度，也提示临床实践中应重视罕见变异导致的重症肝病。
婴儿肝衰竭综合征是一组罕见的严重肝病症候群，可由一系列的罕见变异引起。例如，RINT1基因罕见变异可导致婴幼儿复发性急性肝衰竭和骨骼畸形，DLD、LARS、SCYL1基因变异也可导致婴幼儿复发性急性肝衰竭，NBAS基因变异可导致发热依赖的复发性急性肝衰竭（小儿肝功能衰竭综合征2型）。Cousin等报道了3例婴幼儿复发性急性肝衰竭患者均有RINT1基因剪接变异（c.1333+1G>A/T），同时携带错义突变p.Ala368Thr或 p.Leu370Pro或框移缺失p.Val618_Lys619del的复合杂合突变。而SCYL1基因的罕见变异可导致SCYL1缺乏症（即CALFAN综合征），这是一种先天性胞内运输障碍性肝病，临床表现为反复的低水平γ-谷氨酰转移酶、胆汁淤积、婴幼儿期早发急性肝衰竭和迟发性神经退行性病变。
另外，先天性糖基化障碍致病基因CCDC115变异，如c.92T>C（p.Leu31Ser）、c.31G>T（p.Asp11Tyr）以及c.19C>T（p.Arg7*）等变异，导致其编码的卷曲螺旋结构域蛋白115缺乏或异常，可使高尔基体内稳态异常，蛋白质糖基化先天性异常，进一步导致严重的早发性肝纤维化、肝硬化，甚至肝衰竭。另外，有文献报道，ACOX2基因终止突变c.207T>A（p.Tyr69*）导致一名8岁男孩间歇性转氨酶水平升高、肝纤维化、轻度共济失调和认知障碍，免疫组织化学证实该患者肝脏中酰基辅酶A氧化酶2表达缺乏。
总之，多个病种的遗传代谢性肝病都可进展为不同程度的重症肝病，包括肝硬化、肝癌以及肝衰竭，发病中相应致病基因的变异是其最根本的致病因素，而这些变异通常都是罕见变异，当这些患者合并HBV感染或者其他肝炎病毒感染时，给疾病的诊断和鉴别带来了更大的挑战，在临床实践中应重视这类罕见变异对疾病的影响。
随着技术的进步和深入的研究，越来越多的罕见低频变异被鉴定和解读，这些结果为人类更加深入地理解疾病的病理生理学过程和基础病因提供了更多的线索，为评估预测罹患某疾病的风险提供了更多方法，同时也为将来的基因诊断、分子分型和个体化治疗奠定了理论基础。但同时我们也应意识到，罕见变异与疾病的关联及其在临床实践中的指导作用仍然存在很多瓶颈和限制因素，解读罕见变异的作用时仍然需要考虑以下因素：①受族群遗传背景、生活环境等因素的影响，不同人群中同一种疾病的易感基因并不完全一致，这解释了复杂疾病的异质性，但也提示我们在新药研发和临床诊疗过程中需要考虑人种的遗传背景差异；②罕见低频变异的定义在不同人群中是相对的，某一个位点在一个人群中可能是高频的，在另一个人群中可能是低频的，因此其在不同种族人群的疾病关联性上可能存在差异，例如中国人群超过1万人的低覆盖度全基因组测序研究发现SIRT1基因附近的rs12415800和LHPP基因上的rs35936514与复发性抑郁症相关，但其关联性在欧洲7.5万人的两个队列中未得到验证，有学者分析其原因可能在于同一个位点在两个人群的频率差异巨大（rs12415800，0.45 vs. 0.02；rs35936514，0.28 vs. 0.06）；③常见变异与罕见变异间可能存在协同作用，例如遗传性血色素沉积症是由HFE基因罕见变异导致的铁代谢异常，有学者发现，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶7（PCSK7）的常见变异位点可与HFE基因协同作用，是遗传性血色素沉积症进展为肝硬化的高危因素，携带PCSK7基因rs236918 C等位的HFE C282Y纯合患者，罹患肝硬化的风险提高5.38倍；④对罕见低频变异的解读仍需要考虑基因-基因交互作用和基因-环境交互作用的因素，常见复杂疾病是分子、细胞和器官等不同水平和环境以及饮食、文化、心理、行为等共同作用的结果，存在大量的基因-基因和基因-环境交互作用，简单地从变异-疾病单一纵向关联研究并不足以解释疾病的发生、发展，但是目前人们对基因-基因、基因-环境交互作用的认识尚不充分；⑤另外，由于疾病致病机制的复杂性以及异质性的广泛存在，其他类型的变异，如插入、缺失、拷贝数变异、结构变异、短的串联重复序列、单碱基的重复、基因融合等，目前也有发现和疾病具有重要的关联，尤其是以前被忽略的拷贝数变异在人类基因组中广泛存在，而且可能与人类复杂疾病有着密切的关系。
在乙型重型肝炎的发生、发展过程中，遗传作用是复杂的，所以不可能把乙型肝炎重症化的遗传因素归结于某一个单一的等位基因的变异。多位点、多基因相互作用使得识别和解析乙型重型肝炎的遗传基础存在挑战。利用我国病毒性肝炎优势疾病资源，我们在全基因组范围内鉴定出HBV相关慢加急性肝衰竭（ACLF）的宿主遗传易感基因，初步阐明了宿主遗传背景和HBV特异性CD4 + T淋巴细胞免疫应答在重型肝炎发展过程中以及肝炎患者发生HBeAg或HBsAg 清除中的作用，为临床治疗和疾病的遗传学干预和预防提供新的思路，但在多基因通路分析、Meta分析、低频功能变异发掘以及基因-基因和基因-环境交互作用解析等方面仍然需要深入探讨，以全面揭示乙型肝炎重症化过程中的关键环节。对于乙型肝炎重症化宿主遗传因素研究，今后在研究设计上应当注意：①对乙型重型肝炎进行精细的表型界定，例如，综合考虑慢性乙型肝炎重度、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭的纳入与排除问题；②选择合理的对照，我们认为应该选择年龄在40岁以上、HBeAg阴性的无症状携带者为对照；③必须有足够大的样本量，最好病例和对照都在1000例以上；④注重关联区域低频功能位点的鉴定，开展阳性关联变异位点在乙型重型肝炎中的生物学功能研究；⑤注重不同地域人群的重复验证，开展数据共享、交换及更大样本的Meta分析。
有人可能会质疑，发现这些在人群中较低风险系数的微效遗传效应到底有什么用处？实际上，遗传流行病学的贡献并不是为了简单地应用于校正这些微效遗传变异。相反，这些发现的真正价值在于认识致病机制。只有认识了环境因素对人群发挥作用的遗传本质特性，才能找到针对环境因素与遗传变异相互作用的有效干预策略。乙型重型肝炎的宿主遗传因素的研究范围和研究模式，今后将聚焦在整合遗传因素与其他因素之间的相互作用，包括遗传因素与病毒基因型/亚型、人群特征、基因-基因交互作用、基因-环境因素准确定量等。可以预见，乙型重型肝炎遗传易感性的研究使我们对乙型肝炎病毒和宿主遗传因素共同作用导致重症化的病因通路及发病机制产生新的理解，为乙型重型肝炎的预防提供新的思路。在此基础上，必将促进乙型重型肝炎防治从疾病晚期推移至早期乃至疾病发生之前，显著提升乙型重型肝炎临床诊疗的技术水平。
［1］Altshuler D，Daly M J，Lander E S.Genetic mapping inhuman disease［J］.Science,2008,322（5903）：881-888.
［2］Schork N J，Murray S S，Frazer K A，et al.Common vs.rare allelehypotheses for complex diseases［J］.Curr Opin Genet Dev,2009，19：212-219.
［3］Lander E S.The new genomics：global views of biology［J］.Science,1996,274（5287）：536-539.
［4］Gibson G.Rare and common variants：twenty arguments［J］.Nat Rev Genet,2012,13（2）：135-145.
［5］de Bakker P I，Telenti A.Infectious diseases not immune to genome-wide association［J］.Nat Genet,2010,42（9）：731-732.
［6］Tan W，Xia J，Dan Y，et al.Genome-wide association study identifies HLA-DR variants conferring risk of HBV-related acute-on-chronic liver failure［J］.Gut,2018,67（4）：757-766.
［7］Maher B.The case of the missingheritability［J］.Nature,2008，456（7218）：18-21.
［8］Raychaudhuri S.Mapping rare and common causal alleles for complexhuman diseases［J］.Cell,2011，147（1）：57-69.
［9］Genovese G，Friedman D J，Ross M D，et al.Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans［J］.Science,2010,329（5993）：841-845.
［10］Wray N R,Ripke S,Matteisen M,et al.Genome-wide association analyses identify 44 risk variants and refine the genetic architecture of major depression［J］.Nat Genet,2018,50（5）：668-681.
［11］CONVERGE consortium.Sparse whole-genome sequencing identifies two loci for major depressive disorder［J］.Nature,2015,523（7562）：588-591.
［12］Hyde C L，Nagle M W，Tian C，et al.Identification of 15 genetic loci associated with risk of major depression in individuals of European descent［J］.Nat Genet,2016,48（9）：1031-1036.
［13］Amin N，de Vrij F M S，Baghdadi M，et al.A rare missense variant in RCL1 segregates with depression in extended families［J］.Mol Psychiatry,2018,23（5）：1120-1126.
［14］Cruchaga C，Karch C M，Jin S C，et al.Rare coding variants in the phospholipase D3 gene confer risk for Alzheimer’s disease［J］.Nature,2014,505（7484）：550-554.
［15］Gudmundsson J，Sulem P，Gudbjartsson D F，et al.A study based on whole-genome sequencing yields a rare variant at 8q24 associated with prostate cancer［J］.Nat Genet,2012,44（12）：1326-1329.
［16］UK10K Consortium，Walter K，Min J L，et al.The UK10K project identifies rare variants inhealth and disease［J］.Nature,2015,526（7571）：82-90.
［17］Lopes L R，Futema M，Akhtar M M，et al.Prevalence of TTR variants detected by whole-exome sequencing inhypertrophic cardiomyopathy［J］.Amyloid,2019,26（4）：243-247.
［18］Adams D，Koike H，Slama M，et al.Hereditary transthyretin amyloidosis：a model of medical progress for a fatal disease［J］.Nat Rev Neurol,2019,15（7）：387-404.
［19］Coelho T，Maia L F，Martins da Silva A，et al.Tafamidis for transthyretin familial amyloid polyneuropathy：a randomized，controlled trial［J］.Neurology,2012，79（8）：785-792.
［20］Maurer M S，Schwartz J H，Gundapaneni B，et al.Tafamidis treatment for patients with transthyretin amyloid cardiomyopathy［J］.N Engl J Med,2018,379（11）：1007-1016.
［21］Coelho T，Adams D，Silva A，et al.Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis［J］.N Engl J Med,2013,369（9）：819-829.
［22］Lee S，Abecasis G R，Boehnke M，et al.Rare-variant association analysis：study designs and statistical tests［J］.Am J Hum Genet,2014,95（1）：5-23.
［23］Morrison A C，Voorman A，Johnson A D，et al.Whole-genome sequence-based analysis ofhigh-density lipoprotein cholesterol［J］.Nat Genet,2013,45（8）：899-901.
［24］Li Y，Sidore C，Kang H M，et al.Low-coverage sequencing：implications for design of complex trait association studies［J］.Genome Res,2011,21（6）：940-951.
［25］Ge T，Wang Y，Che Y，et al.Atypical late-onset immune dysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrome with intractable diarrhea：a case report［J］.Front Pediatr,2017,5：267.
［26］Lange L A，Hu Y，Zhang H，et al.Whole-exome sequencing identifies rare and low-frequency coding variants associated with LDL cholesterol［J］.Am J Hum Genet,2014,94（2）：233-245.
［27］Lee S，Abecasis G R，Boehnke M，et al.Rare-variant association analysis：study designs and statistical tests［J］.Am J Hum,Genet 2014，95（1）：5-23.
［28］Fang H，Zhang H，Yang Y.Poisson approximation-based score test for detecting association of rare variants［J］.Ann Hum Genet,2016,80（4）：221-234.
［29］Ionita-Laza I，Lee S，Makarov V，et al.Sequence kernel association tests for the combined effect of rare and common variants［J］.Am J Hum Genet,2013,92（6）：841-853.
［30］Dutta D，Gagliano Taliun S A，Weinstock J S，et al.Meta-MultiSKAT：multiple phenotype meta-analysis for region-based association test［J］.Genet Epidemiol,2019,43（7）：800-814.
［31］Wong V W，Chan H L.Severe acute exacerbation of chronichepatitis B：a unique presentation of a common disease［J］.J Gastroenterol Hepatol,2009,24（7）：1179-1186.
［32］Wang H，Luo H，Wan X，et al.TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection［J］.J Hepatol,2020,72（1）：45-56.
［33］Mbarek H，Ochi H，Urabe Y，et al.A genome-wide association study of chronichepatitis B identified novel risk locus in a Japanese population［J］.Hum Mol Genet,2011,20（19）：3884-3892.
［34］Zhang Z，Wang C，Liu Z，et al.Host genetic determinants ofhepatitis B virus infection［J］.Front Genet,2019,10：696.
［35］Zampino R，Coppola N，Cirillo G，et al.Patatin-like phospholipase domain-containing 3 I148M variant is associated with liver steatosis and Fat distribution in chronichepatitis B［J］.Dig Dis Sci,2015,60（10）：3005-3010.
［36］Zhao Q，Peng L，Huang W，et al.Rare inborn errors associated with chronichepatitis B virus infection［J］.Hepatology,2012,56（5）：1661-1670.
［37］Peng L，Zhao Q，Li Q，et al.The p.Ser267Phe variant in SLC10A1 is associated with resistance to chronichepatitis B［J］.Hepatology,2015,61（4）：1251-1260.
［38］Zhang Y，Li Y，Wu M，et al.Comprehensive assessment showed no associations of variants at the SLC10A1 locus with susceptibility to persistent HBV infection among Southern Chinese［J］.Sci Rep,2017,7：46490.
［39］Yang J，Yang Y，Xia M，et al.A genetic variant of the NTCP gene is associated with HBV infection status in a Chinese population［J］.BMC Cancer,2016,16：211.
［40］Wang S，Wang J，Fan M J，et al.Identified OAS3 gene variants associated with coexistence of HBsAg and anti-HBs in chronic HBV infection［J］.J Viral Hepat,2018,25（8）：904-910.
［41］Loomba R，Schork N，Chen C H，et al.Heritability ofhepatic fibrosis and steatosis based on a prospective twin study［J］.Gastroenterology,2015,149（7）：1784-1793.
［42］Al-Qahtani A，Khalak H G，Alkuraya F S，et al.Genome-wide association study of chronichepatitis B virus infection reveals a novel candidate risk allele on 11q22.3［J］.J Med Genet,2013,50（11）：725-732.
［43］El Sharkawy R，Thabet K，Lampertico P，et al.A STAT4 variant increases liver fibrosis risk in Caucasian patients with chronichepatitis B［J］.Aliment Pharmacol Ther,2018,48（5）：564-573.
［44］Wang P S，Kuai J，Li H，et al.Mannose-binding lectin 2 rs11003123 polymorphism is associated with the development ofhepatocellular carcinoma in patients withhepatitis B-related cirrhosis in the Chinese population［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2016,15（3）：282-288.
［45］Reuken P A，Lutz P，Casper M，et al.The ATG16L1 gene variant rs2241880（p.T300A）is associated with susceptibility to HCC in patients with cirrhosis［J］.Liver Int,2019,39（12）:2360-2367.
［46］Abul-Husn N S，Cheng X，Li A H，et al.A protein-truncating HSD17B13 variant and protection from chronic liver disease［J］.N Engl J Med,2018,378（12）：1096-1106.
［47］Gellert-Kristensen H，Nordestgaard B G，Tybjaerg-Hansen A，et al.High risk of fatty liver disease amplifies the alanine transaminase-lowering effect of a HSD17B13 variant［J］.Hepatology,2020,71（1）:56-66.
［48］Song Q L，He X X，Yang H，et al.Association of a TANK gene polymorphism with outcomes ofhepatitis B virus infection in a Chinese Han population［J］.Viral Immunol,2012,25（1）：73-78.
［49］Chen V L，Chen Y，Du X，et al.Genetic variants that associate with liver cirrhosishave pleiotropic effects onhuman traits［J］.Liver Int,2020,40（2）:405-415.
［50］Hu H H，Liu J，Lin Y L，et al.The rs2296651（S267F）variant on NTCP（SLC10A1）is inversely associated with chronichepatitis B and progression to cirrhosis andhepatocellular carcinoma in patients with chronichepatitis B［J］.Gut,2016,65（9）：1514-1521.
［51］About F，Bibert S，Jouanguy E，et al.Identification of an endoglin variant associated With HCV-related liver fibrosis progression by next-generation sequencing［J］.Front Genet,2019,10：1024.
［52］Deng G，Zhou G，Zhang R，et al.Regulatory polymorphisms in the promoter of CXCL10 gene and disease progression in malehepatitis B virus carriers［J］.Gastroenterology,2008,134（3）：716-726.
［53］Xu Z，Liu Y，Liu L，et al.Association of interferon-gamma induced protein 10 promoter polymorphisms with the disease progression ofhepatitis B virus infection in Chinese Han population［J］.PLoS One,2013,8（9）：e72799.
［54］Yan Z，Tan W，Zhao W，et al.Regulatory polymorphisms in the IL-10 gene promoter and HBV-related acute liver failure in the Chinese population［J］.J Viral Hepat,2009,16（11）：775-783.
［55］Xu B Y，Tan W T，Tan S，et al.Serum testosterone levels and androgen receptor CAG polymorphism correlate withhepatitis B virus（HBV）-related acute liver failure in male HBV carriers［J］.PLoS One,2013,8（12）：e84213.
［56］Yan Z，Tan W，Dan Y，et al.Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and risk of HBV-related acute liver failure in the Chinese population［J］.BMC Med Genet,2012,13（1）：49.
［57］Ajmera V，Huang H，Dao D，et al.Host genetic variant in CXCL16 may be associated withhepatitis B virus-related acute liver failure［J］.Cell Mol Gastroenterol Hepatol,2019,7（2）：477-479.
［58］Ye J，Wu Y，Li M，et al.Keratin 8 mutations were associated with susceptibility to chronichepatitis B and related progression［J］.J Infect Dis,2020,221（3）:464-473
［59］Han Y，Gu L，Liu J，et al.Association of mutations in Toll-like receptor 2 signaling genes with fulminant form ofhepatitis B-related acute liver failure［J］.J Infect Dis,2017,215（8）：1221-1230.
［60］Asgari S，Chaturvedi N，Scepanovic P，et al.Human genomics of acute liver failure due tohepatitis B virus infection：an exome sequencing study in liver transplant recipients［J］.J Viral Hepat,2019,26（2）：271-277.
［61］Kim H Y，Eyheramonho M B，Pichavant M，et al.A polymorphism in TIM1 is associated with susceptibility to severehepatitis A virus infection inhumans［J］.J Clin Invest,2011,121（3）：1111-1118.
［62］Chatenoud L，Bach J F.Genetic control ofhepatitis A severity and susceptibility to allergy［J］.J Clin Invest,2011,121（3）：848-850.
［63］Long D，Fix O K，Deng X，et al.Whole genome sequencing to identifyhost genetic risk factors for severe outcomes ofhepatitis a virus infection［J］.J Med Virol,2014,86（10）：1661-1668.
［64］Devarbhavi H，Reddy V V，Singh R.Wilson disease presenting with acute on chronic liver failure：a single-center experience of outcome and predictors of mortality in 68 patients［J］.J Clin Exp Hepatol,2019,9（5）：569-573.
［65］谭文婷，向密，但芸婕，等.119例肝豆状核变性临床特征及致病基因ATP7B变异谱分析［J］.第三军医大学学报,2018，40（18）：1674-1681.
［66］Wang W，Yu R，Tan W，et al.A patient with glycogen storage disease type Ia combined with chronichepatitis B infection：a case report［J］.BMC Med Genet,2019,20（1）：85.
［67］Strnad P，Buch S，Hamesch K，et al.Heterozygous carriage of the alpha1-antitrypsin Pi*Z variant increases the risk to develop liver cirrhosis［J］.Gut,2019,68（6）：1099-1107.
［68］Basyte-Bacevice V，Skieceviciene J，Valantiene I，et al.SERPINA1 and HSD17B13 gene variants in patients with liver fibrosis and cirrhosis［J］.J Gastrointestin Liver Dis,2019,28（3）：297-302.
［69］Blackburn P R，Hickey R D，Nace R A，et al.Silent tyrosinemia type Ⅰ without elevated tyrosine or succinylacetone associated with liver cirrhosis andhepatocellular carcinoma［J］.Hum Mutat,2016,37（10）：1097-1105.
［70］Cousin M A，Conboy E，Wang J S，et al.RINT1 Bi-allelic variations cause infantile-onset recurrent acute liver failure and skeletal abnormalities［J］.Am J Hum Genet,2019,105（1）：108-121.
［71］Lenz D，McClean P，Kansu A，et al.SCYL1 variants cause a syndrome with low γ-glutamyl-transferase cholestasis，acute liver failure，and neurodegeneration（CALFAN）［J］.Genet Med,2018,20（10）：1255-1265.
［72］Haack T B，Staufner C，Kpke M G，et al.Biallelic mutations in NBAS cause recurrent acute liver failure with onset in infancy［J］.Am J Hum Genet,2015,97（1）：163-169.
［73］Jansen J C，Cirak S，van Scherpenzeel M，et al.CCDC115 deficiency causes a disorder of Golgihomeostasis with abnormal protein glycosylation［J］.Am J Hum Genet,2016,98（2）：310-321.
［74］Girard M，Poujois A，Fabre M，et al.CCDC115-CDG：a new rare and misleading inherited cause of liver disease［J］.Mol Genet Metab,2018,124（3）：228-235.
［75］Vilarinho S，Sari S，Mazzacuva F，et al.ACOX2 deficiency：a disorder of bile acid synthesis with transaminase elevation，liver fibrosis，ataxia，and cognitive impairment［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113（40）：11289-11293.
［76］Stickel F，Buch S，Zoller H，et al.Evaluation of genome-wide loci of iron metabolism inhereditaryhemochromatosis identifies PCSK7 as ahost risk factor of liver cirrhosis［J］.Hum Mol Genet,2014,23（14）：3883-3890.
［77］Ioannidis J P，Trikalinos T A，Khoury M J.Implications of small effect sizes of individual genetic variants on the design and interpretation of genetic association studies of complex diseases［J］.Am J Epidemiol,2006,164（7）：609-614.
乙型肝炎重症化的发生、发展过程同样涉及宿主、HBV及环境因素（包括干预）等方面相互作用的影响。宿主方面除个体的成长环境外，常与宿主遗传背景密切相关。HBV感染者的年龄、性别、种族、干预应答效果，以及是否有肝硬化和（或）肝癌家族史等众多方面的研究依据，促使学者们更加关注宿主的遗传易感性和宿主的遗传背景与HBV感染结局之间的关系。
宿主遗传因素至少包括两个方面的内容。一方面，是以DNA双螺旋结构为基础的中心法则，主要描述遗传信息是如何自DNA→RNA→蛋白质的单向控制论，是生物繁衍后代保持物种稳定的基本条件。1970年发现的逆转录进一步完善了传统意义上的中心法则，它是促使生物不断适应环境和进化的基础。另一方面，在不同生物的遗传与表型差异研究中发现，在基因的DNA序列未发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的遗传信息变化，并最终产生表型的改变，这不符合孟德尔的遗传规律。人们逐渐认识到，基因组含有两类遗传信息，一类是物种必需的遗传编码信息，另一类是近年发现的大量隐藏在DNA序列之中或之外更高层次的遗传信息，可提供表观遗传学信息。本节主要根据目前研究进展，介绍宿主表观遗传因素（DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA）在乙型肝炎重症化中的作用。尽管有关这方面的研究尚处于起步阶段，但以其在遗传学和在相关疾病中的作用，表观遗传因素必将很快成为研究热点之一。
自1939年Waddington首次提出表观遗传学（epigenetics）的概念后，生命科学研究已经进入全新的表观遗传学领域。疾病的发生、发展不仅取决于经典遗传因素，同时也受到表观遗传修饰（epigenetic modification）的影响。经过数十年的发展已经形成了比较统一的认识，表观遗传学是指研究不涉及DNA序列变化、可遗传的和可逆性的基因表达调节的一门新兴的遗传学分支。目前表观遗传学研究内容主要涉及DNA甲基化修饰、染色质组蛋白的修饰、染色质重构及非编码RNA等调控方式，根据基因转录是否参与，表观遗传学分为基因转录前调控及基因转录后调控两大类。
（一）基因转录前调控
1.DNA甲基化
DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA碱基上通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）的催化，添入甲基基团的化学修饰现象。高等生物中存在着广泛的甲基化，DNA甲基化主要是在基因5′端非编码区CpG岛的胞嘧啶第5位碳原子加上一个甲基基团，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）（图4-3）。DNA的不同甲基化状态（如过甲基化、半甲基化等）与基因的活性和功能有关。一般来说，DNA甲基化多引起基因的失活。
图4-3 胞嘧啶甲基化反应
胞嘧啶第5位碳原子加上一个甲基基团，生成5-甲基胞嘧啶。Me：甲基。
基因组DNA既存在甲基化修饰，也存在其逆过程——DNA去甲基化（DNA demethylation）。DNA去甲基化是指在DNA去甲基化酶（DNA demethylase）作用下特异性地脱去甲基的反应过程。一般认为，DNA去甲基化主要发生在生物的早期发育过程中，与基因转录活性相关，对基因表达有诱导作用，是生物发育中重要的调控方式。
与DNA甲基化有关的表观遗传现象的作用途径还包括基因组印记（genomic imprinting）、X染色体失活（X-chromosome inactivation）、转座子的稳定性等。
2.组蛋白的共价修饰
组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）是核小体重要的组成部分，是一组等电点（pI）大于10的碱性蛋白，它由一球状核心区和突出于核小体外富含碱性氨基酸的N端尾部组成。组蛋白被修饰的位点就集中在N端尾部，尾部特定的氨基酸残基经各种酶促反应可进行共价修饰。这些修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、ADP核糖基化、泛素化和苏素化（图4-4）。赖氨酸的游离氨基可发生乙酰化和甲基化，精氨酸的氨基基团可发生甲基化，丝氨酸和苏氨酸的羟基基团可发生磷酸化。
图4-4 组蛋白尾部修饰位点
组蛋白被修饰的位点就集中在N端尾部，尾部特定的氨基酸残基经各种酶促反应可进行共价修饰；组蛋白的修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、ADP核糖基化、泛素化和苏素化。histone：组蛋白。
（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.）
通常意义上，组蛋白乙酰化可使相应染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录。组蛋白甲基化有单甲基化、双甲基化及三甲基化三种不同的形式，极大地丰富了组蛋白修饰种类，既可增强也可抑制基因的转录。例如，H3K4、H3K36及H3K79甲基化与基因激活相关，而H3K9、H3K27及H4K20的甲基化与基因沉默相关。到目前为止已经发现70余种不同位点及类型的组蛋白修饰。正是由于组蛋白修饰的多样性，美国学者Strahl和Allis提出了组蛋白密码假说（histone codehypothesis），认为组蛋白尾部的共价修饰及组合，加上其他修饰（如DNA甲基化）构成了一套调控染色质结构和转录活性的遗传密码。
3.染色质重塑
染色质重塑（chromatin remodeling）是指无转录活性的染色质，通过与染色质重构复合物（chromatin remodeling complex）之间相互作用成为有转录活性的染色质的过程。目前已发现多种ATP依赖型的染色质重构复合物，如SWI/SNF、RSC、NURF、ACF、CHRAC和MOT1等。染色质重构使染色质结构发生一系列重要的变化，如染色质去凝聚、核小体变成开放式的疏松结构，使转录因子等能够结合核小体DNA，从而调控基因转录等。核小体的滑动可能是其中一种重要机制模式，它不改变核小体结构，但改变核小体与DNA结合位置，在这种核小体重新组装并与DNA结合的过程中，DNA暴露，从而促进转录因子及RNA聚合酶与启动子结合，开始转录（图4-5）。广义上讲，染色质重构还包括组蛋白的共价修饰、组蛋白变异体及其他引起染色质构型改变的调控方式。
图4-5 染色质重构——核小体滑动机制示意图
起始转录染色质重构复合物在ATP的参与下，与染色质相互作用，核小体滑动，改变了核小体与DNA结合位置，暴露DNA，从而促进转录因子及RNA聚合酶与启动子结合，使其成为有转录活性的染色质。ATP（adenosine triphosphate）：三磷酸腺苷。ADP（adenosine diphosphate）：二磷酸腺苷。
（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）
（二）基因转录后调控
1.非编码RNA
非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一类不翻译成蛋白质的功能性RNA分子，即除mRNA以外的所有RNA。ncRNA根据其作用可分为功能性ncRNA和调控ncRNA两类：前者包括tRNA、rRNA等，它们具有重要功能，但不参与修饰调控；后者可分为长链ncRNA、中链ncRNA和短链ncRNA，其功能是以不同的形式调控基因的表达。长链ncRNA长度常达到1kb及以上，多在基因簇甚至整个染色体水平发挥顺式调控作用；中链ncRNA长度为50～500nt，反义RNA属于其中一种，多行使反义调控的功能；短链ncRNA长度为21～31nt，主要与argonaute（AGO）蛋白家族的不同成员结合形成核糖蛋白复合物，多在mRNA水平对基因表达进行调控，它们通过形成的RNA诱导沉默复合体（RISC）介导mRNA的降解和（或）抑制mRNA的翻译，还对外源的核酸序列进行降解以保护本身的基因组（图4-6）。
图4-6 miRNA和siRNA介导的mRNA沉默效应机制
miRNA切割mRNA或者阻断翻译，siRNA切割mRNA，两者均引发转录后基因的沉默。miRNA（microRNA）：微小RNA。siRNA（short interfering RNA，small interference RNA）：小干扰RNA。RISC（RNA-induced silencing complex）：RNA诱导沉默复合体。AGO1：argonaute蛋白1。
（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）
常见的短链ncRNA为小干扰RNA（short interfering RNA，small interference RNA，siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）。外源小分子双链RNA（double strand RNA，dsRNA），也被称为siRNA，通过特异性地结合体内特定基因的mRNA，可诱导相应mRNA降解，引发转录后基因的沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），这种现象称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。RNAi机制依赖于siRNA与体内靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，因此RNAi有可能作为一种简单而有效的敲除基因的工具。真核生物体内另一重要的ncRNA就是miRNA。miRNA是一类长约22nt的单链RNA分子，广泛存在于多种真核生物的细胞中。miRNA的作用机制目前认为与RNAi现象一致，通过碱基互补配对导致体内相应mRNA降解，抑制基因转录后表达。目前已有证据提示体内大量的miRNA可能来源于基因转录后剪切的内含子序列。
2.核糖开关
核糖开关是近年来发现的调控mRNA的一种特殊形式，它充当mRNA表达开关的作用。核糖开关广泛存在于革兰阳性菌的代谢相关基因中。此外，在真菌、植物中也有发现，它相当于mRNA特异性的结合代谢物，通过改变构象在转录或翻译水平上调节基因表达。例如，当葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate，GlcN6P）在细菌细胞内达到较高水平时，相应基因mRNA结构的5′端选择性诱导产生一种具有自我剪切RNA能力的结构单元，诱导mRNA切断自身，这样mRNA的数量极大地减少，从而削弱了GlcN6P的生成（图4-7）。核糖开关也可认为是一种核酶，通过切断自身mRNA而达到控制靶基因表达的目的。
图4-7 GlcN6P核糖开关结构
当GlcN6P在细菌细胞内达到较高水平时，相应基因mRNA结构的5′端选择性诱导产生一种具有自我剪切RNA能力的结构单元，诱导mRNA切断自身，减少mRNA的数量。红色代表该基因mRNA保守序列。A：腺嘌呤。G：鸟嘌呤。C：胞嘧啶。U：尿嘧啶。
（引自：Winkler W C，et al.Nature，2000，428（6980）：281-286.）
（一）DNA甲基化修饰机制
DNA甲基化（DNA methylation）是目前研究最清楚的也是最重要的表观遗传修饰形式。基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间共价结合，由此胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。哺乳动物基因组DNA中5-mC占胞嘧啶总量的2%~7%，绝大多数5-mC存在于CpG二联核苷（CpG doublets）上。哺乳动物基因组中CpG二联核苷出现的频率远低于四种碱基随机排列所预期的频率，但对蛋白质编码基因而言，CpG二联核苷并不呈现基因组总DNA中的低频率。在结构基因的调控区域，CpG二联核苷常以成簇串联的形式排列。结构基因5′端附近富含CpG二联核苷的区域称为CpG岛（CpG island）。基因调控元件（如启动子）所含CpG岛中的5-mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合，所以DNA甲基化一般与基因沉默（gene silencing）有关；而非甲基化（non-methylated）一般与基因的活化（gene activation）有关。去甲基化（demethylation）则往往是一个沉默基因重新激活（reactivation）的途径之一。
DNA的甲基化遗传通过DNA甲基转移酶（DNMTs）来维持。DNMTs将S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）上的甲基转移至胞嘧啶核苷酸的第5位碳原子。当一个甲基化的DNA序列复制时，新合成的DNA双链呈半甲基化，即只有母链有完整的甲基化标记，这时另一条链会经DNMTs的催化而在与母链5-mC对称的位置上使相应的胞嘧啶甲基化，通过这种方式DNA的甲基化修饰在DNA复制中得以维持（图4-8）。除此之外，哺乳动物基因组DNA甲基化型的建立、维持和改变还涉及DNA去甲基化酶（DNA demethylase）和不依赖半甲基化DNA分子中的甲基化模板链而从头开始合成5-mC的从头甲基化酶（de novo methylase），如DNMT3a、DNMT3b等。
图4-8 DNA甲基化遗传机制
当一个甲基化的DNA序列复制时，新合成的DNA只有母链有完整的甲基化标记，在DNA甲基转移酶的催化下，另一条链上相应的胞嘧啶甲基化，使DNA在复制中得以维持甲基化。图中红色球形标记代表甲基化修饰。
（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）
（二）DNA甲基化与乙型肝炎重症化的关系
异常的DNA甲基化通常被认为与人类多种疾病的发生有关。尤其在肿瘤研究中，人们发现了某些抑癌基因（p16）、肿瘤转移抑制基因（Nm 2 3）及DNA修复基因（MLH1）等肿瘤相关基因的5′端启动子区的CpG岛都发生了高甲基化。已发现HBV相关肝癌中涉及多种DNA甲基转移酶的表达上调，这种DNA甲基转移酶水平的升高大多与抑癌基因的高甲基化有关。近年来很多研究表明，基因组中CpG岛异常甲基化不仅涉及肿瘤的发生，还与多种微生物感染所致的感染性疾病有关（表4-2）。2006年，赵英仁等以21例HBV相关肝癌患者、45例HBV相关肝硬化患者、65例CHB患者、26例急性乙型肝炎患者和95例正常对照者为研究对象，采用生物信息学方法预测CIITA pIV启动子区有一个CpG岛区域，针对该区域设计甲基化特异性引物联合PCR（MSP）检测CIITA pIV启动子在各组HBV感染者中的作用。结果表明，HBV感染者CIITA基因并无基因突变或序列的改变，进一步分析显示CIITA基因甲基化率在HBV相关肝癌、HBV相关肝硬化和CHB组未发现明显差异，但与HBV急性感染组或健康对照组比较，其甲基化率明显高于后者，差异具有统计学意义。数据表明CIITA pIV启动子区的CpG岛DNA甲基化可能与HBV持续感染有关。该研究所2008年又以90例慢性HBV感染者（30例慢性HBV携带者、30例HBeAg阳性和30例HBeAg阴性CHB患者）和30例正常对照者为研究对象，采用甲基化特异性PCR（MSP）、实时定量PCR（RT-PCR）和ELISA法分别检测IFN-γ基因启动子区的甲基化水平和表达量。结果显示，慢性HBV感染者IFN-γ基因启动子区甲基化水平明显升高，且IFN-γ的表达水平与该基因启动子区甲基化状态呈负相关。提示IFN-γ基因启动子区高甲基化可能参与了HBV感染慢性化的病理机制。王凯等在HBV相关慢加急性肝衰竭（ACLF）的临床研究中发现多种基因（IL-10、GSTP1及IFN-γ）启动子的异常甲基化与肝衰竭的发生有关。他们以25例慢加急性肝衰竭患者对比观察CHB患者和正常对照者，采用甲基化特异性PCR（MSP）及ELISA方法检测IL-10甲基化修饰状态和血清表达量之间的关系，结果显示慢加急性肝衰竭组的IL-10基因甲基化率明显低于CHB组，而IL-10的表达水平在慢加急性肝衰竭组较CHB组明显升高，这表明IL-10基因启动子甲基化可能参与了IL-10表达的调控。谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）是氧化应激反应中一种重要的还原酶，可以保护组织免受损伤。研究结果显示35例HBV相关肝衰竭患者发生GSTP1启动子甲基化率明显高于CHB患者，提示GSTP1启动子甲基化可能促进了氧化应激，间接导致肝脏损伤。IFN-γ在HBV感染性疾病中具有重要的抗病毒和调节免疫的功能。该研究组同样采用了甲基化特异性PCR及ELISA方法研究IFN-γ甲基化水平和表达，结果显示HBV相关慢加急性肝衰竭组IFN-γ甲基化率（24/40）显著低于CHB组（14/15），但高于正常对照组（2/10）；还发现IFN-γ在血清中的表达与自身甲基化修饰状态呈负相关，在这一点上与西安交通大学肝炎研究所的研究结果一致。研究认为，IFN-γ基因启动子区的去甲基化可能也介导了HBV相关慢加急性肝衰竭的发生。除了以上这些直接对HBV相关肝衰竭的研究之外，还有一些研究表明宿主基因在HBV感染过程中起着重要作用。2005年，王宇明等对三对单卵双胞胎（其中一对表型不一致，表现为HBeAg阳性和阴性的CHB，其他两对均表现为抗-HBs阳性，母亲均为CHB患者）的基因组进行酶切、凝胶电泳、差异条带克隆并测序，发现表型不一致的双胞胎中存在GSP1（G蛋白通路抑制子1）、LOC390424、LOC388459和ABCC8基因（ATP-结合盒C亚家族的第8个成员）四个差异甲基化基因。提示上述四个差异甲基化基因可能影响了疾病的表型。以上这些结果均提示宿主基因的甲基化状态的改变可能与HBV感染和（或）重症化的发生、发展紧密相关。
表4-2 微生物致病与DNA甲基化作用机制的关系
注：HBV，乙型肝炎病毒：HCV，丙型肝炎病毒：HIV，人类免疫缺陷病毒：HPV，人乳头瘤病毒：EBV，Epstein-Barr病毒。
已知HBV DNA水平与HBV感染患者临床结局、预后等存在密切关系。各国慢性乙型肝炎指南均把最大化抑制HBV复制作为抗病毒治疗的理想目标，可见HBV DNA载量在病情演变中的重要性，重型肝炎进行抗病毒治疗的不同结局亦是另一种提示。近年来研究显示，不仅宿主基因可发生DNA甲基化，而且HBV本身也存在DNA甲基化现象，这种现象与HBV复制密切相关。Vivekanandan等发现，HBV DNA基因组内存在CpG岛，他们通过体外转导未甲基化HBV DNA、部分甲基化HBV DNA和全部甲基化HBV DNA三种不同修饰状态的病毒进入HepG2细胞系，结果表明HBV DNA甲基化程度可以影响HBV mRNA、HBsAg及HBcAg的表达，且在人类的肝脏组织中发现HBV cccDNA存在甲基化现象。2年后Kim等以12例HBV相关肝硬化患者肝脏标本为研究对象，发现HBV cccDNA CpG岛区域甲基化程度与血清HBV DNA水平呈显著负相关。同时以体外转染实验验证HBV cccDNA甲基化程度越高，HBV cccDNA转录活性越低，进一步证实了HBV基因甲基化与HBV DNA载量之间的关系。不仅HBV基因甲基化参与这一过程，其他研究还表明HBc和HBx也存在这一现象。Zheng等研究显示HBx蛋白可通过与DNMT3a相互作用调节某些基因启动子区甲基化从而使该基因表达下调或上调，如IL-1R和金属硫蛋白1F（metallothionein 1F）基因启动子区甲基化引起基因表达下调，而CDH6和IGFBP3基因启动子区去甲基化分别引起相应基因表达上调。Guo等学者在研究CHB患者时发现，HBc蛋白可结合HBV cccDNA CpG岛2区，可使该区域甲基化水平下降，从而上调HBV的转录和复制水平。除此之外，DNA甲基转移酶基因多态性可能也与HBV的清除有关。因此针对基因DNA甲基化修饰这一现象，不仅宿主基因受到调控，病毒本身修饰也在其中发挥着重要的调控作用。然而在重型肝炎中，病毒基因甲基化的研究尚未见到相关报道。
（一）组蛋白修饰机制
表观遗传修饰除了DNA甲基化修饰以外，还有一种常见的方式，即染色质结构修饰，不同的染色质结构常影响到基因的表达。细胞对外在刺激所做出的每一个反应几乎都会涉及染色质结构的改变，这一改变是通过修饰组蛋白、变换组蛋白密码实现的。
核小体中组蛋白和147个DNA碱基的位置及组蛋白尾部的特殊修饰对维持基因的表达模式和染色体正常结构及功能有重要价值。组蛋白在进化中是保守的，但并不是静态不变的，组蛋白翻译后的修饰会导致核小体结构发生改变，从而提供一种可识别的标志，称为组蛋白密码。组蛋白密码提供了效应蛋白的结合位点，后者能与核小体结合并能识别组蛋白尾的修饰形式，通过染色质改型调节基因的表达。组蛋白尾修饰对基因表达调控的作用取决于修饰的种类、被修饰的氨基酸残基及其他在N端多肽链上所处的位置。
组蛋白乙酰化往往与转录激活相关联，转录活跃的染色质部分富含乙酰化的组蛋白，组蛋白乙酰化选择性地使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放相关基因的转录，增加其表达水平；组蛋白H3和H4的低乙酰化与异染色质和转录不活跃的染色质部位相关。组蛋白N端乙酰化时失去正电荷，使其与DNA的结合能力减弱，并以某种方式引起染色质结构变得比较开放，而有利于转录。
组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达。研究发现，在转录活性染色质区，组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）被乙酰化，而在基因沉默的异染色质区则是被甲基化；转录抑制因子异染色质蛋白1（HP1）的Bromdomain能与甲基化H3K9结合，参与异染色质的重新组装，抑制基因转录。Bromdomain是目前发现的第一个能选择性地与组蛋白尾部的共价结合物（如乙酰化赖氨酸等）相互作用的蛋白质结构域，它存在于许多有内源性组蛋白修饰酶（如HAT）活性的转录调节因子中。组蛋白H3的第4、9、27、36、79位和H4第20位赖氨酸的甲基化，在基因表达和染色质功能调节中起重要作用。目前认为，组蛋白精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控较为稳定的标志，H3K4甲基化与基因激活相关，而H3K9和H3K27甲基化与基因沉默相关。赖氨酸甲基化有单甲基化、双甲基化及三甲基化三种不同的形式，它们显著扩大了组蛋白复合体的密码调控信息。
除上述乙酰化和甲基化修饰外，还存在组蛋白的磷酸化、泛素化、ADP核糖基化和苏素化等修饰。染色质内八个核心组蛋白所形成的组蛋白修饰组合大大增加了所蕴含的遗传信息量。靠传统的方法研究单个或几个组蛋白位点的修饰已经很难从基因组水平来研究组蛋白修饰与疾病之间的关系。因此，微型、高通量、集成化的组蛋白修饰抗体芯片的运用，可以从表观遗传学角度更好地帮助人们理解疾病的发病机制并为研究新的治疗手段提供理论基础。
（二）组蛋白修饰与乙型肝炎重症化的关系
组蛋白的N末端可通过共价修饰作用发生乙酰化、甲基化、泛素化及磷酸化等翻译后修饰，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密码，其中乙酰化是最为重要的修饰方式。组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶（HAT）和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）协调催化完成的。组蛋白修饰能够引起核小体结构的变化，导致染色体重塑，影响各类转录因子与DNA的结合，进而影响基因的转录。组蛋白乙酰化对维持组蛋白的功能和DNA转录是必需的，组蛋白乙酰化的平衡或失衡将引起相应的染色体结构和基因转录水平的改变，并可参与许多疾病的发生。有文献表明，组蛋白修饰与微生物感染密切相关（表4-3）。赵英仁等通过比较不同组别（慢性乙型肝炎耐受期、慢性乙型肝炎激活期、慢性乙型肝炎相关肝衰竭及正常对照组）外周血CD4 + T淋巴细胞中组蛋白H3K9在全基因组启动子区乙酰化修饰状态，发现了一些特异性的差异基因。以25例慢性乙型肝炎耐受期患者、19例慢性乙型肝炎激活期患者、23例慢性乙型肝炎相关肝衰竭期患者和28例正常对照者为研究对象，采用磁珠法分选CD4 + T淋巴细胞，采用染色质免疫共沉淀联合芯片（ChIP-chip）等方法对全基因组进行检测并分析。结果发现，CD4 + T淋巴细胞基因组H3K9乙酰化修饰在各组慢性乙型肝炎患者中是一种普遍存在的现象。慢性乙型肝炎不同临床分期H3K9乙酰化修饰状态存在显著不同。CD4 + T淋巴细胞是一种免疫细胞，笔者针对相关免疫炎性基因在各组中H3K9乙酰化修饰差异进行分析，发现CYP4F11、IGF2和IL-27这三个免疫炎性基因在不同临床分期患者中均存在乙酰化修饰，这可能与HBV感染本身密切相关；有四个炎性基因（C1QC、MBL2、P2RX1和REG3A）乙酰化修饰是肝衰竭组独有的，可能主要参与了肝衰竭的发生；三个基因（CD28、KRT1和YWHAZ）为慢性乙型肝炎激活组、肝衰竭组共有，而正常对照组和慢性乙型肝炎耐受期患者均无乙酰化修饰，它们可能参与了肝脏损伤过程。另外，研究报道在托屈嗪药物诱导的肝衰竭患者肝脏中，采用免疫组织化学方法观察到组蛋白H4的乙酰化相对于急性甲型肝炎患者肝脏中的表达显著下降，且进一步在小鼠模型中观察到托屈嗪药物剂量与组蛋白H4乙酰化状态呈明显的负性剂量效应关系，表明组蛋白修饰参与了托屈嗪药物诱导的肝衰竭的发生。这些研究说明，组蛋白修饰在乙型肝炎重症化过程中也发挥了重要作用，可能为今后CHB的发病机制研究提供新的线索。
表4-3 微生物感染与组蛋白修饰作用机制的关系
续表
注：HBV，乙型肝炎病毒：HCV，丙型肝炎病毒：HIV，人类免疫缺陷病毒：HSV，人类单纯疱疹病毒：HPV，人乳头瘤病毒：EBV，Epstein-Barr病毒：HAdV，人类腺病毒。
此外，HBV基因组相关的组蛋白乙酰化作用与HBV DNA载量的关系亦有部分报道。Pollicino等研究发现，HBV cccDNA所包装形成的微小染色体的组蛋白H3与H4均存在乙酰化修饰，通过转染线性HBV DNA进入HuH7细胞系的体外研究表明，HBV cccDNA的H3/H4组蛋白乙酰化修饰程度与HBV DNA复制水平呈正相关，在人类肝脏组织内同样观察到这种现象。何松等最近同样通过转染线性HBV DNA基因组进入HepG2细胞系观察到，HBV cccDNA形成的微小染色体可被乙酰化、单甲基化和磷酸化修饰，进一步发现H3乙酰化和单甲基化程度与HBV DNA复制水平呈正相关。HBx蛋白的反式激活作用及致癌机制目前已获得认可，有研究发现HBx蛋白也参与了cccDNA微小染色体乙酰化修饰过程，且HBx蛋白的表达水平与HBV复制水平平行。进一步研究发现，HBx突变后可导致cccDNA的组蛋白低乙酰化，在早期阶段去乙酰化酶HDAC1和hSirt1相应增加，最终HBV cccDNA转录明显减少，提示HBx蛋白可以通过表观遗传修饰影响HBV cccDNA的转录表达和HBV DNA的复制水平。IFN-α是目前公认为抗HBV的有效药物之一，它可以通过直接抗病毒和间接抗病毒起作用，Guo等报道，IFN-α/IFN-γ和STAT相关通路的基因转录水平均与HDAC的活性呈正相关，提示在HBV感染性疾病中，无论是HBV自身，还是宿主的抗病毒免疫反应均参与组蛋白乙酰化修饰，它们相互之间是如何调控，与疾病发生、发展的关系都有待探索。该部分研究才刚刚起步，相信更多相关的研究会引起科学工作者足够的关注。
至于组蛋白其他修饰，如甲基化、磷酸化、核糖基化、泛素化和苏素化在HBV感染性疾病中的研究报道甚少，与其他病毒性感染相关研究也仅有少数报道。Tseng等团队发现丁型肝炎病毒的小HDAg（small HDAg）基因可被磷酸化、乙酰化、甲基化和苏素化（SUMO）修饰调控，其中苏素化修饰可致病毒基因组RNA合成和相应mRNA转录增加。Matto等报道以HCV转染的Huh7.5细胞系为研究对象，发现ADP核糖基化因子1（Arf1）可以抑制病毒RNA复制和减少病毒分泌。Garcia等学者发现，HBV核心蛋白含有的精氨酸（K7/K96）位点中K96存在泛素化结合位点，一般情况下，此位点的泛素化修饰与病毒颗粒的分泌有关，另有研究结果提示，HBV的该位点修饰不影响HBV复制和分泌，但可能在病毒复制周期中发挥作用。虽然迄今为止尚未见这些组蛋白修饰方式与HBV复制和感染病程关系的报道，但这些修饰调控在病毒感染性疾病中可能是广泛存在的，相信日后的研究会逐渐揭开这些修饰的作用和机制。
（一）miRNA的作用机制
miRNA是由约22个核苷酸组成的非编码单链RNA，是一类在动植物中新发现的基因表达调控因子，其参与基因转录后调控。根据miRNA与靶基因互补性的不同，miRNA负性调控靶基因表达的机制可分为以下两种。
（1）当miRNA和靶基因mRNA的3′-UTR几乎完全配对时，miRNA诱导RNA介导的干扰途径，导致靶基因mRNA转录本在miRNA关联的多蛋白RNA介导的沉默复合体（miRISC）中被核酸酶剪切而降解。
（2）大多数miRNA与靶基因不完全互补，不足以产生序列特异性断裂。miRNA与AGO蛋白结合形成复合物后，靶向mRNA进入细胞质处理小体（P-bodies），通过三种方式抑制蛋白质合成：①诱导mRNA脱腺苷酸化和脱帽，启动mRNA降解；②通过AGO蛋白和翻译起始因子竞争与mRNA m7G帽子的结合，阻碍功能性核糖体的装配，造成翻译起始抑制；③通过募集与多肽链降解（翻译延伸）相关的细胞因子（如肽酶）翻译后修饰，使核糖体脱离肽链或新合成的肽链迅速降解，这一过程发生在翻译起始后。
（二）miRNA与乙型肝炎重症化的关系
miRNA是非编码单链小RNA分子，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种重要细胞活动的调控。近年来研究发现，miRNA除与肿瘤发生密切相关外，还与多种感染性疾病的发生相关，以“基因降解或基因沉默”的角色参与了多种感染性疾病的发生和发展。在正常状态下，miRNA正常转录、加工、结合到靶mRNA的互补位点，通过抑制蛋白翻译或改变mRNA的稳定性来抑制基因表达，从而使细胞维持在一个正常的功能状态中。但是，如果机体受到某种微生物的感染，会引起某种或某些mRNA的表达失常，细胞内许多有重要作用的免疫细胞分泌细胞因子水平受到异常调控而表达减弱或增强，从而导致疾病活动或恶性进展。因此，有些miRNA通过抑制或增强细胞因子表达而发挥生物学功能，miRNA直接参与感染性疾病的发生及发展。
近两年，miRNA相关研究在HBV感染或肝炎研究领域已经有少许报道，但研究结果不尽一致。Xu等学者以101例肝癌患者、89例正常对照者、48例慢性乙型肝炎患者为研究对象，采用RT-PCR方法定量检测血清中miR-21、miR-122和miR-223的表达。结果显示，血清中miR-21、miR-122及miR-223的表达在肝癌组明显高于正常对照组。另外，这些miRNA在慢性乙型肝炎组也能被检测出，且miR-21及miR-122的表达明显高于肝癌组。ROC分析表明，血清中miR-21、miR-122及miR-223的表达升高可以作为肝损伤的新生物学指标，而不属于肝癌所特有。但最近Tomimaru等学者通过收集126例肝癌患者、30例慢性乙型肝炎患者和50例正常对照者及10例肝癌患者手术前后血浆标本，采用RT-PCR方法检测血浆miR-21的表达并分析其与AFP的相关性，结果显示肝癌患者手术后miR-21的表达较手术前明显减少。miR-21的表达在肝癌组明显高于慢性乙型肝炎组和正常对照组。ROC分析表明，miR-21可作为与AFP相似的诊断肝癌的生物学指标。其结果与Xu等学者研究结果截然相反，可能系由选择标本定义未进一步限定所致，因肝癌和慢性乙型肝炎均可进一步细分为不同临床状态，包括小细胞肝癌、大细胞肝癌、慢性乙型肝炎耐受期、慢性乙型肝炎清除期，以及其他伴随疾病，如肝硬化等。而Kron等的研究结果提示，miR-122a可通过沉默腺病毒包装的HBsAg表达来增强、提高CD8 + T淋巴细胞功能，从而发挥抗病毒效应，或可解释Xu等关于miR-122可反映肝损伤的发现。此外，以肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎和胃癌、正常对照组作为研究对象，通过实时定量PCR结合miRNA芯片检测法寻找特异性miRNA作为某类疾病的生物标记。结果发现有110个血清miRNA种类被检测到，其中miR-885-5p在肝癌、肝硬化和慢性乙型肝炎组血清中表达量显著高于正常对照组和胃癌组，进一步与AFP、ALT、AST、GGT比较后发现，此miRNA（miR-885-5p）可作为判断肝损伤的指标之一。另有研究对小鼠模型转染可大量表达miR-221的腺病毒，发现过量表达miR-221能够调节（减缓）TNF超家族6诱导的肝炎及暴发性肝衰竭。以上不同学者的研究结果具有明显的差异，这些差异可能与标本选择、实验操作手段和选择检测数据的材料及方法不同有关，且缺乏深入机制上的反复验证实验。然而，这些新近的研究显示了miRNA在HBV感染致肝损伤过程中存在差异性表达现象，与表观遗传学的可逆性调控、不同状态下的调节模式不无关系，有很大的提升空间，尚需进一步探索。
miRNA对HBV复制的影响也有少数文献报道。Zhang等发现miR-1可以通过扩大Farnesoid X受体表达提高HBc基因启动子转录，且能够通过靶向HDAC4和E2F转录因子5来抑制细胞增殖和保持细胞处于G1细胞分化状态，从而有利于HBV复制。研究者在HepG2 2.2.15研究模型中发现，miR-199a-3p和miR-210可抑制HBV复制。另有研究发现，基于HBsAg的慢病毒miRNA表达系统也可抑制HBV复制。这些研究均提示miRNA在HBV感染中普遍存在且各自发挥不同作用。
有研究表明，在不同疾病状态下HBV感染者体内miRNA的表达存在显著差异，且在HBV感染相关慢加急性肝衰竭组检测到的差异，miRNA数量最多。中国科学院微生物研究所田波教授等以HBV携带者、CHB患者、HBV相关慢加急性肝衰竭患者和正常对照者为对象，采用ABI公司miRNA表达芯片检测不同组别患者血清中整体miRNA表达水平，并分析它与临床指标的相关性。结果显示，属于HBV相关慢加急性肝衰竭组的特异性miRNA种类达36种之多，它们分别为miR-200b、miR-212、miR-15a、miR-139-3p、miR-18a、miR-652、miR-28-5p、miR-152、miR-886-5p、miR-101、miR-100、miR-18b、miR-128、miR-363、miR-502-5p、miR-629、miR-449b、miR-501-5p、miR-130b、miR-296-5p、miR-27b、miR-362-5p、miR-505、miR-337-5p、miR-133b、miR-183、miR-142-5p、miR-148b、miR-501-3p、miR-148a、miR-22、miR490-3p、miR-625、miR-296-3p、miR-375、miR-886-3p。虽然进一步的研究资料仍较缺乏，但至少可从侧面反映出miRNA参与了乙型肝炎重症化的发生，其机制尚需进一步阐明。
（一）siRNA的作用机制
siRNA是通过人工体外合成而转染进入体内的，是RNA干扰的主要执行者。它的作用机制与miRNA基本相同，明显不同之处在于siRNA往往是外源导入或病毒感染诱导产生的，而miRNA则是内源性产生的。siRNA通过与mRNA同源配对而使mRNA降解，使靶基因沉默，它既可用于某种疾病发病机制的研究，又可用于疾病的治疗，其作用如同特异性生物导弹。目前至少有五种siRNA药物已进入临床验证。
（二）siRNA与乙型肝炎重症化的关系
如前所述，siRNA主要针对特异性靶位点导入外源性小RNA分子，从而封闭或降解相应的RNA转录。因此，目前研究主要体现在何种位点siRNA导入可以引起哪些相应的生物效应。暂时还鲜见siRNA与乙型肝炎重症化关系的研究报道，但已在其他因素（如四氯化碳、伴刀豆球蛋白A、脂多糖等）诱导的急性暴发性肝衰竭患者体内进行尝试性研究。采取的靶位点主要为与凋亡及凋亡诱导相关基因（如Fas、Caspase 8、TGF受体Ⅱ基因等）和参与肝衰竭发生的细胞因子基因（如细胞因子骨桥蛋白（OPN）基因），结果均显示siRNA可下调肝细胞凋亡和（或）缓解暴发性肝炎中肝细胞损伤程度。Song等将Fas siRNA预先给雄性BALB/c小鼠尾静脉高压注射3次，在siRNA给药后的24h，采用尾静脉高压注射伴刀豆球蛋白A诱导小鼠暴发性肝炎，结果显示伴刀豆球蛋白A给药20h后对照组和绿色荧光蛋白siRNA对照组出现了广泛的肝细胞损伤，而预先用Fas siRNA治疗则阻断了肝细胞坏死，消除了炎性细胞浸润，肝细胞只发生肝细胞坏死；例外的是Saito等在相同小鼠模型中发现，给予OPN siRNA尾静脉注射3次后同样可阻断伴刀豆球蛋白A诱发的肝细胞损伤，肝组织几乎正常，很少出现肝坏死和出血，而对照组出现了大块的肝细胞坏死。体外实验中Zender等将Caspase 8 siRNA预防性孵育HepG2细胞48h，再利用腺病毒表达的Fas配体诱导HepG2细胞凋亡，12h后与对照组比较发现，Caspase 8 siRNA可阻断Fas介导的HepG2细胞凋亡。Mizuguchi等体外实验表明，预先应用shTGFβRⅡ-1转染小鼠肝细胞株BNL CL2 3次，从而抑制了重组人TGF-β1诱导的肝细胞凋亡。上述研究提示在肝衰竭发病中的各个环节均可作为siRNA治疗的候选靶标。与此相关的结果有希望对乙型肝炎重症化治疗提出新的治疗路径。
有关siRNA对HBV复制影响的研究已有多方面报道。目前研究主要针对HBV DNA或HBV cccDNA各个不同区域片段进行相应siRNA设计（如HBc编码区、HBsAg编码区、RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ编码区、HBV RNA转录保守区等），探讨对HBV DNA或相应蛋白表达水平的影响。研究结果表明，这些区域所设计的siRNA通过慢病毒或腺病毒转染入肝癌细胞系，均可不同程度地抑制HBV DNA复制。尤其值得注意的是，Yu等尝试通过针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）设计siRNA进行免疫机制干扰，结果发现可下调CTLA-4 mRNA表达并上调IFN-γ和IL-2的分泌，从而为慢性HBV感染患者的治疗带来新希望。相信有关研究同样对利用siRNA治疗乙型重型肝炎有一定的启发。
表观遗传修饰能从多个水平或层面调控基因的表达，而不同水平的调控之间是相互关联的，任何一方面的异常都可能影响到其他水平或层面的表观遗传修饰。正如研究得出的结果，不同水平的表观遗传修饰在真核细胞中是相互制约和调控的。
（一）表观遗传相互调控的机制
1.启动子区甲基化诱导组蛋白去乙酰化
大多数启动子区高甲基化均有其CpG结合蛋白（methy-CpG binding proteins，MeCPs，包括MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4五个家族成员）存在，而非甲基化的启动子区通常缺少MBD蛋白。启动子区甲基化的CpG与MBD蛋白特异性结合，后者再招募组蛋白去乙酰化酶（HDAC）形成复合物，使核心组蛋白尾区去乙酰化，形成更紧密的DNA包装，限制了转录因子到达它们结合部位的通道，抑制了甲基化的DNA转录。这方面的研究发现正好把MBD蛋白招募HDAC与染色质改型的机制联系起来。
2.miRNA的表达受其他表观遗传修饰调控
如前所述，miRNA的发生和组织特异性调节都已经有明确的阐释。然而对于翻译后产物miRNA是否同样也受其他表观遗传修饰的调控？在肿瘤相关研究中，显示miRNA的表达也会受到甲基化和其他表观遗传修饰的调控。一个证据是用去甲基化药物或组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理膀胱癌细胞，可导致大约5%的miRNA表达上调。例如，miR-127基因的启动子区CpG岛的高甲基化导致了miR-127表达沉默，用去甲基化药物或组蛋白乙酰化酶抑制剂治疗后，miR-127的潜在靶基因Bcl-6的表达明显下调。另外在71例原发性乳腺癌患者中，研究人员发现，多种miRNA（miR-91、miR-124a3、miR-148、miR-152及miR-663）都发生了不同程度的甲基化异常（34%～86%），相关性分析发现这些miRNA甲基化与患者体内肿瘤抑制基因（如RASSF1A、cyclin D2、DAP kinase、SOCS-1等）的甲基化水平高度相关。毫无疑问，除了缺失和突变外，miRNA表达异常同样受其他表观遗传修饰的影响。
3.siRNA指导DNA甲基化和组蛋白修饰
siRNA诱导的基因沉默最早仅认为是发生在细胞质内的转录后水平的调控过程，随着siRNA指导DNA甲基化现象的发现，人们已证实siRNA可通过指导基因组表观遗传修饰引起转录水平基因沉默。siRNA诱导的转录水平的基因沉默是通过基因组表观遗传修饰完成的，包括指导基因组DNA甲基化和指导组蛋白修饰。在细胞质中，siRNA指导的基因组修饰和诱导转录水平的基因沉默则是RNA与DNA序列相互识别产生的生物学效应。siRNA可以和一些蛋白质复合物结合，指导它们作用于核内的基因组靶DNA，引起基因在转录水平发生沉默。
（二）表观遗传修饰相互调控与乙型肝炎重症化的关系
目前针对乙型肝炎重症化作用机制在表观遗传方面上的研究尚处于起步阶段，少量研究如前所述。这可能与其疾病本身的背景相关，随着各种抗HBV药物的开发上市，药物疗效资料的积累，抗病毒治疗在阻止该疾病进一步进展中的重要性越来越明确。宿主基因种类繁多，达数万个，研究一时难以界定某种基因在该疾病中是否占有绝对的作用，但HBV本身是一个仅有3.2kb的基因序列。因此学者们常针对HBV基因组进行有针对性的与病毒复制有关的研究。HBV cccDNA本身可以组装成含有组蛋白和非组蛋白的微型染色质结构，Gong等探讨该微型染色质结构H3组蛋白是否受到多个种类的修饰调控，以含有HBV基因组的细胞模型为对象，发现HBV cccDNA的组蛋白H3可发生乙酰化、单甲基化和磷酸化，进一步分析提示H3乙酰化和单甲基化程度与HBV DNA复制水平呈正相关，表明这两种组蛋白修饰可能共同参与了HBV DNA复制调节。Zhang等通过转染许多已知的miRNA进入肝癌细胞系发现，miR-1可以显著增加HBV复制和其相关RNA及蛋白质的表达。通过生物信息学和荧光报告基团方法证实miR-1主要通过影响组蛋白去乙酰化酶4和E2F转录因子5来抑制细胞增殖和保持细胞处于G1期细胞分化状态，从而有利于HBV复制。此外，在与HBV密切相关的HDV致病机制中，同样发现了小型丁型肝炎抗原（S-HDAg）基因可被多种表观遗传修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化和苏素化，且发现苏素化修饰致HDV基因组RNA合成和相应mRNA转录增加。以上结果提示表观遗传修饰在病毒基因表达调控时可以是多个种类，且它们相互协调和制约，但机制尚需进一步研究。
大量研究提示，表观遗传与经典遗传及环境因素等在疾病发生及发展中同样起着十分重要的作用（图4-9）。DNA甲基化、组蛋白乙酰化等表观遗传修饰同时发生，也可能出现修饰类型的异常和相互之间平衡的紊乱，从而造成基因表达的上调或下调，引起细胞生物学功能改变，包括机体实质细胞、免疫细胞等多个方面。同时表观遗传的一个重要属性是其修饰具有可逆性，有可能与疾病演化过程的关系更为密切。
图4-9 表观遗传与经典遗传和环境因素的关系及在疾病发生及发展中的作用
ncRNAs，非编码RNA；Me，甲基。
（引自：Allis C D，et al.Epigenetics［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009.有修改。）
HBV感染呈多种转归模式，包括急性肝炎、重型肝炎、慢性肝炎、病毒携带状态、HBV相关肝硬化和肝癌等，且有重型肝炎早期、极期及慢性HBV感染免疫耐受期、清除期、控制期和再激活期等多种不同的疾病状态。在不同状态下表观遗传修饰的动态变化规律和疾病预后之间的关系，是值得下一步关注和探讨的课题。核苷（酸）类似物及IFN-α治疗过程中涉及哪些表观遗传学的改变，这种改变与治疗预后之间的关系同样需要我们继续探索。HBV本身的表观遗传修饰，除对病毒本身的影响以外，是否与机体的表观遗传修饰之间存在联系的研究还未涉及。在肿瘤研究方面，采用DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白乙酰化酶抑制剂治疗已经进行了临床前研究。是否通过重型肝炎表观遗传规律的改变寻找新的治疗靶点和路径也会成为人们感兴趣的课题。
总之，无论从表观遗传修饰的模式上，还是从不同修饰模式的平衡调节上，笔者的研究仅处于研究初始阶段，相信它会成为未来的热点方向。
综上所述，表观遗传学是一门不同于传统遗传学的新兴学科，它是可逆、可遗传的和不涉及基因组序列改变的调控方式，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰（乙酰化、甲基化、磷酸化、核糖基化、泛素化和苏素化等）及RNA干扰等。乙型肝炎重症化表观遗传学研究提示，DNA甲基化、组蛋白乙酰化和microRNA可能参与了乙型肝炎重症化的发生及发展。关于HBV的表观遗传修饰调控研究已表明：表观遗传调控可能以多种修饰模式影响HBV复制水平。这些研究展示了乙型肝炎重症化的表观遗传修饰可能不仅涉及单个模式调控研究，还可能存在多种其他模式。结合表观遗传可逆性特点，在HBV相关肝炎的不同疾病状态，不同转归模式中的动态研究可能是今后探索的方向和未来的热点。
［1］Allis C D，Jenuwein T，Reinberg D，et al.表观遗传学［M］.朱冰，孙方霖，译.北京：科学出版社，2009.
［2］Chen R L，Lin S M，Ye F，et al.Methylation status of the interferon-gamma gene promoter in chronichepatitis B［J］.Academic Journal of Xi’an Jiaotong University，2008，20（3）：206-212.
［3］He Y，Zhao Y，Zhang S，et al.Not polymorphism but methylation of class Ⅱ transactivator gene promoter Ⅳ associated with persistent HBV infection［J］.J Clin Virol，2006，37（4）：282-286.
［4］Minárovits J.Microbe-induced epigenetic alterations inhost cells：the coming era of patho-epigenetics of microbial infections［J］.Acta Microbiol Immunol Hung，2009，56（1）：1-19.
［5］戚朝霞，于淑霞，郝洪升，等.慢加急性肝衰竭中IL-10的表达及其启动子甲基化状态的研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2011，25（2）：99-101.
［6］Li T，Meng Q H，Zou Z Q，et al.Correlation between promoter methylation of glutathione-S-transferase P1 and oxidative stress in acute-on-chronichepatitis B liver failure［J］.J Viral Hepat，2011，18（7）：e226-e231.
［7］Fan X P，Zou Z Q，Long B，et al.Enhanced demethylation of interferon-γ gene promoter in peripheral blood mononuclear cells is associated with acute-on-chronichepatitis B liver failure［J］.Tohoku J Exp Med，2011，224（1）：13-19.
［8］Murata K，Hamada M，Sugimoto K，et al.A novel mechanism for drug-induced liver failure：inhibition ofhistone acetylation byhydralazine derivatives［J］.J Hepatol，2007，46（2）：322-329.
［9］Ji F，Yang B，Peng X，et al.Circulating microRNAs inhepatitis B virusinfected patients［J］.J Viral Hepat，2011，18（7）：e242-e251.
［10］Winkler W C，Nahvi A，Roth A，et al.Control of gene expression by a natural metabolite-responsive ribozyme［J］.Nature，2004，428（6980）：281-286.