第一节
乙型肝炎重症化遗传特征研究概述

邓国宏 王宇明

病毒感染、酒精摄入、肝毒性药物、中毒等多个因素可导致重型肝炎（肝衰竭），而在我国重型肝炎（肝衰竭）通常由各型肝炎病毒所致。其中，由乙型肝炎病毒（HBV）感染所致的重型肝炎（肝衰竭）是威胁我国人民生命健康的重要疾病。乙型肝炎重症化过程涉及病毒和宿主两个方面的相互作用，包括HBV和宿主个体的分子遗传学特点，肝细胞微环境改变、凋亡、坏死以及三者相互交织的作用。这不仅是乙型肝炎重症化基础研究的核心问题，也是重大传染病发生及发展研究中的热点问题。

一、乙型肝炎重症化转归的分子遗传学因素

HBV感染的临床转归包括慢性化和重症化，二者分别具有不同的疾病进展特性。HBV感染慢性化主要体现为慢性乙型肝炎（CHB）、肝纤维化、肝硬化、肝癌等病理进程，进展时间较长。HBV感染重症化主要体现为重型肝炎（肝衰竭）。乙型重型肝炎的病理生理学过程表现为肝细胞大量坏死和凋亡，其发病机制复杂，临床起病迅速，救治困难，病死率高。

乙型肝炎重症化转归包括病毒和宿主两个方面的分子遗传学因素。以往对HBV变异的研究表明，C区基本核心启动子区（BCP区）、前C区和C区变异与乙型肝炎的发作及暴发性肝衰竭（FHF）相关，另有研究发现，HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者更易发生S基因变异，尤其是MHR区变异，可能与HBV-ACLF产生相关。然而，同样的前C区、C区变异既可见于不同的病变表型（普通乙型肝炎、肝硬化、肝癌），亦可见于无症状携带者。许多慢性HBV感染者的HBeAg血清学转换的自然史中，并不出现BCP区及前C区变异株。同时，存在BCP区及前C区变异株并非必然导致肝炎发作或重症化。BCP区、前C区和C区变异可能是病毒与宿主长期相互作用后的自然累积、转变和进化，也可能是免疫清除阶段宿主选择压力下的结果（包括免疫逃逸、复制代偿及混合补偿等）。因此，病毒变异是否导致乙型肝炎重症化的发生和发展，显然还受到宿主因素的制约。同时，体内HBV的感染、复制、进化、免疫逃逸、免疫清除、炎症损伤等过程都受到宿主遗传异质性的影响。因此，乙型肝炎的重症化是在病毒因素（病毒载量、变异、进化、重叠感染等）和宿主因素（遗传异质性、年龄、性别等）基础上，通过免疫应答相互作用导致肝细胞损伤的常见复杂疾病（common complex disease）。

二、宿主遗传变异影响疾病的发生和发展过程

从基因组序列水平观察，人类基因组存在广泛的多态性，表现为个体之间生理和疾病表型的差异。基因组的多态性包括插入/缺失多态性、数以千万计的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、数以百万计的拷贝数变异（copy number variation，CNV）以及决定免疫反应的主要组织相容性复合体基因（MHC）等。位于外显子区域的非同义SNP可能对蛋白质功能产生影响，位于5′非翻译区、3′非翻译区或内含子/外显子交界的SNP可能影响mRNA的稳定性、剪接、翻译效率，位于启动子或顺式调控元件区域的SNP可能影响基因的转录活性及表达水平。CNV可通过破坏基因的编码蛋白的活性部分、改变一个基因的表达量、破坏基因组控制基因活性的调节区域等方式影响基因活性。MHC基因对免疫识别起决定作用，在人群中具有高度多态性（数以千计的等位基因），导致个体之间免疫识别和免疫反应的差异。因此，宿主遗传变异从蛋白功能层面和免疫识别层面决定个体对病毒和环境因素反应的“质”（是否识别、反应的性质、保护性还是病理性），从转录水平、表达水平决定个体对病毒和环境因素反应的“量”（反应强度），从根本上影响乙型肝炎重症化的发生与发展。

有众多证据显示宿主遗传背景在乙型肝炎重症化过程中的作用：①同样是数十年的慢性感染，仅一小部分患者会发生重型肝炎（肝衰竭）；②亚洲与欧美国家人群发生重型肝炎（肝衰竭）的比例存在显著不同；③相同的基因型与相同的前C区/C区变异既可见于无症状携带者，亦可见于重型肝炎（肝衰竭）患者；④在人群中发现多个基因与HBV持续感染、肝癌发生以及肝衰竭进展有关；⑤乙型肝炎重症化具有反应时间遗传学（reaction-time genetics）的特点。

三、乙型肝炎重症化宿主遗传因素的特点

常见复杂疾病（如糖尿病、哮喘、高血压、动脉粥样硬化、精神分裂症、肿瘤及感染病等）通常由许多微效累加基因与环境因素共同作用而决定，存在多基因相互作用、遗传异质性、疾病异质性、性状变异呈现连续的数量级差、遗传模式不明确、不完全外显、异位显性等特点。与其他常见复杂疾病的遗传因素类似，乙型肝炎重症化的遗传特征具有疾病异质性、遗传异质性和突变位点作用效能差异等复杂性。同时，乙型肝炎重症化可分为有肝硬化基础和无肝硬化基础，因此，存在疾病表型异质性。其次，不同位点的遗传变异可能对乙型肝炎重症化的不同环节产生影响，存在遗传异质性。另外，遗传变异的频率与疾病风险程度并不一致。常见遗传变异（频率在5%以上）大多是低风险位点（相对风险度＜1.5），而强效的高风险位点（相对风险度＞2）往往是罕见或低频变异（频率在5%以下，甚至0.5%以下）。近年研究发现，多个基因如CXCL10、IL-10、TLR2、TNF-α、HLA-DR、HLA-DQ等的常见变异位点与慢性HBV感染的重症化进展相关。随着新一代测序技术的发展，多项研究表明除了常见变异外，多个基因的罕见低频变异也与慢性乙型肝炎的疾病转归相关。同时，表观遗传学调控，包括DNA甲基化修饰、染色质组蛋白的修饰、染色质重构及非编码RNA等调控方式也参与乙型肝炎重症化的发生和发展。

四、乙型肝炎重症化宿主遗传因素的研究策略

1.连锁与关联分析

对于符合经典孟德尔遗传模式的单基因疾病，通过经典的优势对数记分的统计学方法即可完成致病基因的连锁定位分析，引起疾病的遗传变异对表型的形成具有强效作用。然而，依赖家系的连锁分析-定位克隆方法并不适用于复杂性状易感基因的鉴定。在复杂疾病遗传易感性研究中，非参数分析方法最为常用，统计效能也远高于参数分析。非参数分析方法主要为受累同胞（亲属）对连锁分析（非参数连锁分析）和关联研究-连锁不平衡分析。疾病关联分析是在可能的候选致病基因附近选择多态性遗传标记，在无亲缘关系的患者群体与对照群体之间进行比较，得到某一遗传标记等位基因及引起疾病基因关联的相对危险度，即判断所选标记与疾病易感位点是否存在连锁不平衡。肯定存在遗传标记与疾病关联的现象可归纳为两类：一种是致病基因位点与遗传标记位点存在很强的连锁不平衡；另一种是遗传标记位点本身与疾病发生相关。关联研究易于设计及开展，不需了解疾病的遗传模式、表现型比率、不完全外显率、遗传异质性等，但通常需要较大的样本量以获得足够的统计效能。关联分析比连锁研究在检测微弱效应上具有更强的效力，但是关联分析需要检测更多的标志物。疾病的遗传关联研究有两种策略，一种是基于候选基因的策略，一种是基于发现的全基因组扫描策略。

2.基于候选基因策略的遗传关联研究

基于候选基因策略的遗传关联研究，是选择以前已知或者怀疑与疾病相关（定位候选）和（或）功能上很重要的基因（功能候选）作为候选基因，检测出一个或几个候选基因中一个或多个变异位点与某种表型或疾病状态之间的关联。在家系多位点连锁分析或同胞（亲属）对非参数连锁分析将疾病风险区域定位后，从该区域内选择候选基因进行关联研究，称为定位候选-遗传关联研究。从已证实在疾病通路、疾病机制中起重要作用的基因中选择候选基因，称为功能候选-遗传关联研究（图4-1）。基于候选基因策略的研究，易于开展，花费较少，但不能确定关联基因的确切贡献。

3.基于全基因组关联策略的遗传关联研究

全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）于2005年开始兴起，成为目前复杂疾病遗传关联研究的主流。该策略不需要预先选择候选基因，而是直接选取全基因组范围数以十万甚至百万计的SNP位点和数以十万计的CNV位点进行全基因组关联分析，同时还可以通过Imputation利用HapMap、1000G数据库对标记进行填充，使得可用标记达千万级，该策略常用流程见图4-2。这种策略首次从全基因组角度获得复杂疾病遗传特征的全局、系统的认识。与候选基因策略相比，全基因组关联策略在统计效能上有了极大的提高，同时可以避免群体分层偏倚和基因选择的偶然性。例如，以往基于干扰素信号通路选择候选基因，进行了丙型肝炎患者干扰素-α（IFN-α）应答的遗传关联研究，提示MxA、CD81及IL-15基因的SNP与IFN-α疗效有关。然而，最近美国、欧洲及日本的3项独立大样本全基因组关联研究显示，全基因组范围内只有IL-28B基因附近的rsl297980位点与IFN-α疗效相关（p值达到10-25）。在过去数年内，几乎所有的复杂疾病和定量性状均完成了全基因组关联研究。

已经发表的大多数GWAS研究结果表明，常见遗传变异对疾病的影响效能是低效或微效的（风险度通常在1.1～1.5）。此外，如何在GWAS鉴定出的遗传变异位点区域找到真正的致病位点及功能变异位点也是后续研究面临的挑战。

4.基于深度测序的罕见低频变异挖掘策略

候选基因策略和GWAS策略的关联研究都是基于“常见疾病和常见变异（common disease & common mutation）”的假说。越来越多的研究显示，常见变异不能完全解释复杂疾病的遗传机制，GWAS发现的常见遗传变异仅能解释部分遗传性状，其原因在于GWAS选取的SNP和CNV标记多是人群常见的高频位点（等位频率≥5%），常见变异频率较高但外显率较低，导致大量的“遗传性丢失”。目前看来，复杂疾病的遗传基础很大程度上还取决于低频（等位频率0.5%~5%）和罕见（等位频率≤0.5%）变异，“常见疾病和低频变异（common disease & rare mutation）”假说重新受到重视。在后GWAS时代，疾病遗传学研究开始关注和鉴定影响疾病的低频和罕见变异。研究策略包括针对GWAS关联区域进行功能位点的鉴定，针对极端表型个体进行深度测序（deep sequencing）以及针对外显子组或全基因组进行再测序鉴定低频和罕见变异。目前，已有多项研究报道了罕见低频变异与慢性乙型肝炎重症化相关。特别值得注意的是，伴有遗传代谢性肝病的慢性乙型肝炎患者的重症化问题，临床上不容忽视，如威尔逊病、酪氨酸血症、先天性糖基化障碍等，均有导致肝硬化、肝癌或肝衰竭的报道。另外，Gilbert综合征虽鲜有引发肝衰竭的报道，但现有数据显示Gilbert综合征人群流行率可高达5%，因此慢性乙型肝炎患者群体的Gilbert综合征及其对慢性乙型肝炎重症化的影响也值得关注。本章第三节 将详细介绍低频罕见变异的挖掘策略、统计方法及其在乙型肝炎重症化中的重要作用。

5.表观遗传学研究

表观遗传学研究是疾病遗传学的一个重要维度和方面，表观遗传修饰虽然不包括核苷酸序列的变化，但这种影响基因表达和调控的修饰是可遗传和可逆性的。根据基因转录是否参与，表观遗传修饰分为基因转录前调控及基因转录后调控两大类，前者包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重构等，后者包括非编码RNA等的调控修饰。本章第四节 将详细介绍表观遗传修饰及其与乙型肝炎重症化的关系。

五、乙型肝炎重症化宿主遗传因素的研究进展

虽然乙型重型肝炎是存在于东亚、东南亚地区的一种常见的乙型肝炎疾病表型，但在西方国家较为少见。目前，有关HBV感染与清除、慢性HBV感染相关肝硬化及肝癌等疾病表型的遗传因素研究较多，但对乙型重型肝炎遗传易感性研究较少。仅有少量研究全部来自亚洲人群，采用的是候选基因-疾病关联研究策略。主要针对涉及乙型肝炎免疫反应通路的几个基因，如TNF-α、TNF-β、IL-10、干扰素诱导蛋白10（IP-10，CXCL-10）、维生素D受体（VDR）、人白细胞抗原（HLA）、Toll样受体（TLR-2、TLR-3）等，对这些基因多态性与乙型肝炎严重程度的关系开展了研究，与乙型重型肝炎有关的主要关联研究结果见表4-1。我们对Th1型免疫反应通路上的CXCL-10基因进行了SNP发掘，发现CXCL-10基因的多态性主要集中于启动子区。疾病关联研究证实了CXCL-10基因启动子区-1596T-201A单倍型增加了慢性HBV感染的疾病严重性风险，EMSA、报告基因、ChIP、mRNA定量等功能实验证据表明，G-201A是一个重要的rSNP位点。CXCL-10蛋白参与乙型肝炎患者肝组织的炎症和坏死过程。此外，我们还从群体水平揭示了Th2型免疫反应通路上的IL-10基因启动子多态性与慢性乙型重型肝炎的关系，为IL-10启动子自然选择学说及急性肝衰竭时全身炎症反应综合征的病理生理学机制提供了新的理论证据。另外，有研究显示，携带FasL-844CC基因型的非活动性HBsAg携带者易发生乙型肝炎重症化。

对于乙型肝炎重症化，以往基于候选基因策略遗传关联研究的局限性在于：①样本量有限，统计效能不足。②疾病表型的定义及对照的选择标准参差不齐。例如，对于重症化表型的界定标准，有的研究单纯以血清转氨酶或胆红素水平为标准，也有的研究以肝组织学活动程度或肝纤维化积分为标准。在对照选择方面，有的研究以慢性乙型肝炎患者作为对照，有的以无症状携带者为对照，对这些研究结果的解读应加以区分。③缺乏多个人群的重复验证。④凭主观判断或借鉴其他疾病研究选择候选基因开展研究，无法精确衡量基因组全局范围内究竟有哪些（多少）遗传变异对乙型重型肝炎产生影响。

目前，我们一项纳入1300例HBV-ACLF患者和2058例无症状携带者的全基因组关联研究显示，HLA-DR区域的rs3129859位点是HBV-ACLF显著的关联位点，HLA-DRB1*1202等位是HBV-ACLF最显著的易感风险等位。从氨基酸层面看，与ACLF显著相关的氨基酸全部位于抗原识别区。rs3129859是HBV-ACLF的独立风险因素，独立于CHB自然史阶段、HBV再活化及肝硬化因素；风险等位rs3129859*C与HBV-ACLF临床进程相关，携带风险等位rs3129859*C的患者，入院28天INR达到1.5以及发生腹水的风险更高，28天病死率更高。风险等位rs3129859*C和HLA-DRB1*1202可作为HBV-ACLF临床预警预后的标志物，提示HLA-Ⅱ类分子限制的CD4 ⁺ T淋巴细胞途径在HBV-ACLF的免疫病理过程中的重要作用。

六、展望

Boyle等在分析了众多复杂性状的GWAS结果后发现，复杂性状的关联信号往往遍布大部分基因组，因此他们提出了一种“全基因模型”的假设，即某种特定的性状或疾病不仅受相关的核心基因影响，还受无数基因在基因网络中相互协同作用的影响，所有与疾病相关的细胞中表达的基因都容易影响与疾病相关的核心基因的功能，大多数遗传力（heritability）可以用对核心信号通路外基因的影响来解释。在乙型重型肝炎的发生、发展过程中，遗传作用是复杂的，因而不可能把乙型重型肝炎的遗传因素归结于某一个单一的等位基因的变异。多位点、多基因相互作用使得识别和解析乙型重型肝炎的遗传基础存在挑战。今后在研究设计上应当注意：①采用国内外同行认可的定义对乙型重型肝炎进行精细的表型界定；②选择合理的对照，我们认为选择年龄在40岁以上、HBeAg阴性的无症状携带者为对照更好；③足够大的样本量；④注重关联区域低频功能位点的鉴定，开展阳性关联变异位点在乙型重型肝炎中的生物学功能研究；⑤注重不同地域人群的重复验证，开展数据共享、交换及更大样本的Meta分析；⑥整合解读遗传因素与其他因素的相互作用，如病毒基因型/亚型、基因-基因相互作用、基因组-微生物组相互作用等。

可能有人会质疑，发现这些在人群中较低风险系数的微效遗传效应到底有什么用处？实际上，遗传流行病学发现的贡献并不是为了简单地应用于校正这些微效遗传变异。相反，这些发现的真正价值在于认识疾病的发病机制。只有认识了环境因素对人群发挥作用的遗传本质特性，才能找到针对环境因素与遗传变异的相互作用进行有效干预的策略。我们有理由相信，乙型重型肝炎的宿主遗传因素的研究范围和研究模式必将发生巨大的变化。以后将整合遗传因素与其他因素之间的相互作用，包括遗传因素与病毒基因型/亚型、人群特征、基因-基因相互作用、基因-环境因素准确定量等。可以预见，乙型重型肝炎遗传易感性的研究使我们对乙型肝炎病毒（HBV）和宿主遗传因素共同作用导致重症化的病因通路及发病机制产生新的理解，为乙型重型肝炎的预防提供新的思路。在此基础上，必将促进乙型重型肝炎防治从疾病晚期推移至早期乃至疾病发生之前，显著提升乙型重型肝炎临床诊疗的技术水平。

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