第四节
乙型肝炎病毒编码蛋白与乙型肝炎重症化

韩梅芳

病毒蛋白对参与炎性损伤的某些宿主基因具有转录调控作用，导致相关基因的高度表达及炎症反应的暴发，参与重型肝炎的病理生理过程。如HBx可激活IP-10及MIG的产生，使中性粒细胞、单核细胞等募集到肝脏；病毒蛋白HBx激活并促进细胞因子IL-6、IL-32在肝细胞的高度表达，促进了炎症反应的发生；病毒蛋白HBc和HBx通过激活转录因子c-Ets-2和MAPK信号途径诱导巨噬细胞高度表达fgl2凝血酶原酶，激活凝血级联途径，导致纤维蛋白沉积在肝脏，最终导致肝脏微循环障碍、肝细胞损伤和坏死的发生。

一、HBV编码蛋白的转录和翻译

（一）HBV编码蛋白的转录

乙型肝炎病毒（HBV）基因组编码合成的病毒蛋白有两类：一类是结构蛋白，包括外膜蛋白和核壳蛋白；另一类是功能蛋白，包括P蛋白（polymerase，简称P）和X蛋白（HBxAg）。分泌型核壳蛋白（HBeAg）不仅是结构蛋白，也是功能蛋白。病毒蛋白分别由不同的mRNA转录和翻译而生成。

以HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）为模板，多个启动子能转录生成多种mRNA。其中包括3.5kb前基因组mRNA以及2.4kb、2.1kb和0.7kb的亚基因组mRNA，均不经拼接，有各自的起始密码子AUG。3.5kb前基因组mRNA同时能编码合成C蛋白（HBcAg）和P蛋白。2.4kb的mRNA虽含编码大蛋白、中蛋白、主蛋白的序列，但主要合成外膜大蛋白。2.1kb的mRNA合成外膜中蛋白和主蛋白。各种mRNA均可编码HBxAg，但仍有0.7kb的X基因转录的mRNA能编码HBxAg，只是数量很少，难以被检测到。转录和翻译核心蛋白（P21）的mRNA不包括整个前C区，开始于前C区 ATG下游的几个核苷酸之后，有5′帽子和多聚A尾巴，长3.3～3.6kb，有些作为前基因组RNA，包裹进核心颗粒，并可以作为模板逆转录合成病毒DNA，另外的一些mRNA有相同的5′端，经拼接编码合成HBcAg。而转录和翻译HBeAg的前体蛋白p25的mRNA则始于前C区的上游，由C基因的前C区起始密码子起始编码合成HBeAg前体p25，不包裹进核心，它在内质网经信号肽酶裂解去信号肽，在胞质内是P22，在血流中羧基端被水解，形成最终的HBeAg。

（二）HBV编码蛋白的翻译

HBV基因组含4个基因，经4种mRNA编码合成9种病毒蛋白，表明HBV结构具有高效率。9种病毒蛋白包括组装病毒的外膜（主蛋白HBsAg、中蛋白、大蛋白）和核壳的结构蛋白（HBcAg）、前C/C基因编码的另一种蛋白可溶性分泌型HBeAg、调节病毒复制功能的HBx蛋白和3种P蛋白（末端蛋白、DNAp和RNA酶H）。

（三）HBV编码蛋白的转录调控机制

HBV基因组至少具有4个启动子序列和2个增强子，即前C/前基因组启动子（CP）、S启动子1（SP1）、S启动子2（SP2）和X启动子（XP），以及增强子Ⅰ（EnhⅠ）和增强子Ⅱ（EnhⅡ）。

前C/前基因组启动子（CP）指导前C/前基因组mRNA的转录，SP1指导前S1 mRNA的转录，SP2指导前S2/S mRNA的转录，XP指导X mRNA的转录，其中CP不仅启动HBeAg、HBcAg及P蛋白翻译模板的转录，而且还作为复制模板启动前基因组（pregenomic RNA，pgRNA）的转录。近期有研究者发现了前X启动子和前S启动子，它们分别指导前X mRNA和前S mRNA的转录。目前研究发现，HBV DNA转染的肝源性及非肝源性细胞系都得到了一种或多种病毒蛋白的表达。研究结果表明：肝脏中存在某些mRNA转录调控的依赖性因子，因而决定了HBV DNA在转染不同细胞系时，得到不同模式的HBV蛋白的表达。

CP由基本核心启动子（BCP）和核心上游调节序列（CURS）组成，位于两个翻译起始密码子（1785nt和1815nt）的周边，即1636~1850nt。BCP指导前C/前基因组RNA的转录，其活性具有细胞种类的依赖性。有研究表明，HBcAg特异性的mRNA的转录需要细胞类型特异性的转录因子的参与。

在BCP上游的调控序列有正向和负向调控启动子的活性，其中紧靠BCP 5′端的是CURS，该CURS对CP有强烈的刺激作用。在CP的上游加上CURS，可以使两种3.5kb的mRNA及42nm的病毒颗粒在转染细胞中的产量显著升高，可上调BCP的活性200~2000倍。

负向调控元件（negative regulatory element，NRE）位于CURS的上游，在肝源性及非肝源性细胞系中都能发挥抑制BCP的作用。在NRE的功能发挥过程中，有一种或多种细胞转录因子参与。

对某些分化的肝癌细胞系的研究表明，可能存在使CP活性改变的特异性转录因子。例如，转录因子SP1、鸡卵白蛋白上游启动子转录因子1（COUP-TF1）、肝细胞核因子3（HNF3）、HNF4、过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）和TATA结合蛋白（TBP）。CP有2个HNF4结合位点，第2个结合位点横跨CP的TATA盒样序列。当HNF4与人睾丸受体2（TR2）相互作用并结合这一位点时，将抑制前C mRNA的转录活性；PPAR-γ/RXR-α异二聚体结合后将激活pgRNA的合成，而COUP-TF1的结合将抑制前C和pgRNA的转录。

在S区ORF内有两个启动子序列，即SP1和SP2，指导两种HBV特异性mRNA的合成；有三个翻译起始密码子，即AUG1、AUG2、AUG3。S区ORF可以编码三种蛋白质，即前S1、前S2和S蛋白。其中S蛋白从AUG3开始编码，表达量最高，为HBV包膜中相对分子质量最小的一种蛋白质，因此又称小蛋白（SHBsAg）或主蛋白。从AUG2开始翻译，包括前S2和S基因区，编码的蛋白称为中蛋白（MHBsAg）。从S区ORF 5′端的AUG开始翻译的蛋白质相对分子质量最大，包括前S1、前S2和S基因区，又称为大蛋白（LHBsAg）。

SP1是所有HBV调控序列中仅有的含有典型TATA盒的启动子，其上有TBP结合位点，在TBP结合位点上游为HNF1的结合位点，SP1仅需要这两个元件即可发挥功能。在其他转录因子如SP1、TBP、NF1、HNF3的辅助下，SP1的转录活性可以得到提高。SP1结合蛋白1（SBP1）对SP1的转录活性有抑制作用，且对肝细胞的基因表达谱有显著的影响；血清类黏蛋白2（ORM2）也呈现对SP1活性的抑制作用，可下调其活性81.9%；精氨酸琥珀酸裂解酶（ASL）则上调SP1活性3.3倍。

SP2序列的位置在S基因ORF序列之内，与P和前S1的ORF重叠，大约在3152nt处。在S 区ORF序列之内共有三个翻译起始密码子，SP2控制其中的AUG2和AUG3两个，即控制S区ORF编码的MHBsAg和SHBsAg的表达。完整的S基因ORF编码的MHBsAg无反式激活作用，但当其羧基端缺失一段氨基酸残基以后，就开始表现出对各种启动子序列的反式激活作用。MHBsAg的羧基端缺失太多或太少都是影响其是否具有反式激活效应的重要因素。从MHBsAg编码基因3′端序列缺失体的构建及细胞转染的实验结果中，确定了一段与缺失型MHBsAg反式激活功能相关的多肽区域，即TAO区。如果MHBsAg的C端残基缺失超过TAO区达到其N端，则这种缺失型的MHBsAg不具有反式激活功能；只有MHBsAg的C端缺失恰好达到TAO区的缺失突变体，才具有反式激活功能，这一TAO区定位在HBV DNA中的221~573nt。

XP定位于X mRNA转录起始点上游140nt之内，其3′端与增强子Ⅰ重叠20nt，XP的核心部分缺乏典型的TATA盒和GC富含区序列。目前仅发现一种XP序列，但至少可以指导三种不同的X特异性的mRNA，并都具有编码X蛋白的功能。XP包含多个肝脏特异性及泛嗜性转录因子结合位点，如X启动子结合蛋白（X-PBP）、NF1、C/EBP、ATF、AP1/Jun-Fos、p53等，特别是p53与XP的结合能抑制启动子的活性。

HBV基因组共含有两个增强子，即增强子Ⅰ和增强子Ⅱ，它们都以不依赖方向的方式促进HBV基因组的转录，调控启动子的活性。

增强子Ⅰ位于表面抗原基因与X基因开放阅读框之间，并与XP部分重叠，定位于1074~1234nt，主要上调前C/前基因组mRNA、X mRNA的转录，对前S2/S mRNA也有促进转录作用。根据功能不同，将增强子Ⅰ分为3个区域，即5′-调节区、中央核心区和3′-区，其中3′-区与X-ORF重叠。中央区含有视黄酸反应元件（RARE），可以与HNF4、PPAR-γ/RXR-α异二聚体和COUP-TF1结合，其中与COUP-TF1的结合发挥抑制作用。中央区还含有8个核苷酸的回文结构，可同时与NF1、HNF3、STAT3结合，这三者可增强增强子Ⅰ的功能。增强子Ⅰ还有一个LSR元件，可以结合C/EBP、NF1、CREB/ATF2、AP1、HNF3、HNF4、PPAR-γ/RXR-α和COUP-TF，激活X mRNA的转录。研究发现，低浓度的C/EBP能特异性地促进增强子Ⅰ的功能，而高浓度的C/EBP则可结合另外的位点，它激活了XP的活性，却抑制了增强子Ⅰ的功能。

增强子Ⅱ位于BCP上游，与CURS重叠，含148nt，可上调两个表面抗原启动子和XP的活性，以方向依赖性方式上调BCP的转录活性。增强子Ⅱ包含两个功能元件，即Ⅱ2A元件和Ⅱ2B元件，两个功能元件相互依赖而发挥作用。单独的Ⅱ2A元件并没有增强子活性，只有与Ⅱ2B元件同时存在才会获得增强子活性。但单独的含Ⅱ2B元件的报告基因质粒转染入HepG2细胞时，报告基因活性是含有完整增强子Ⅱ报告基因质粒氯霉素乙酰转移酶（CAT）活性的70%，说明Ⅱ2B元件本身具有较强增强子活性。因此认为，Ⅱ2B元件是增强子Ⅱ的基本功能单位，而Ⅱ2A元件是重要的调节元件。增强子Ⅱ上有很多转录因子结合位点，可与很多转录因子结合后促进或抑制增强子Ⅱ的活性，例如，HNF1、HNF3、HNF4、C/EBP、肝白血病因子（HLF）等都可促进增强子Ⅱ的功能，而E4BP4能抑制增强子Ⅱ的活性，并能抑制HBV的基因表达和复制。

二、HBV编码蛋白的结构及功能

（一）外膜蛋白

1.外膜蛋白结构

外膜蛋白是HBV颗粒的外膜，由S基因的开放阅读框（S-ORF，2584-0-832nt）编码合成，S区通过三个框架内起始密码子ATG分为三个结构域：前S1、前S2和S结构域。从这三个ATG开始编码产生三种大小不等的表面蛋白：主蛋白（SHBsAg）、中蛋白（MHBsAg：前S2+ S）和大蛋白（LHBsAg：前S1+前S2+S）。三种蛋白都镶嵌在宿主细胞膜的脂质双分子层中，均为Ⅱ型跨膜糖蛋白，并通过 S结构域半胱氨酸形成的二硫键得以巩固。HBV表面蛋白具有多种功能，在HBV致病（癌）过程中发挥着重要的作用。

前S1蛋白由 108或 119个氨基酸组成，其氨基端（N端）游离，羧基端（C端）与前S2蛋白的N端相连。前S1蛋白仅出现于大蛋白中，位于包膜的内、外两侧，血清中主要存在于具有传染性的Dane颗粒或管状颗粒表面上，是病毒感染复制的一个重要指标；前S2蛋白由55个氨基酸残基组成，不仅存在于病毒颗粒表面，亦可出现在非传染性球形颗粒表面。三种蛋白分子有共同的羧基末端和终止密码子，但氨基端和起始密码子各不相同。大蛋白、中蛋白、主蛋白分别由2.4kb、2.1kb、2.1kb的mRNA翻译而来。

HBV主蛋白即SHBsAg，又称小蛋白，由226个氨基酸（156~832nt）组成，以糖基化的GP27和非糖基化的p24两种形式存在，在HBV的Dane颗粒中，SHBsAg约占80%，糖基化和非糖基化的SHBsAg比例大致相同。根据其基因组编码序列进行三级结构分析，推断存在4个跨膜序列（TMD），分别为TMD-Ⅰ，4~24位氨基酸；TMD-Ⅱ，80~100位氨基酸；TMD-Ⅲ，173~193位氨基酸；TMD-Ⅳ，202~222位氨基酸。其间有2个胞质环（CYL）：CYL-Ⅰ，24~80位氨基酸；CYL-Ⅱ，194~201位氨基酸。CYL位于内质网（ER）的内侧。CYL-Ⅰ可与HBcAg相结合，尤其是29~59位氨基酸区，是病毒粒子组装的重要接点。

主要亲水区（MHR）位于99~169位氨基酸（或100~170位氨基酸），内含一系列构象性抗原决定簇，又被进一步细分如下：MHR1，99~119位氨基酸；MHR2，120~123位氨基酸；MHR3，124~137位氨基酸；MHR4，138~147位氨基酸；MHR5，148~169位氨基酸。

目前发现较多的HBsAg变异发生在124~147位氨基酸区域，例如，G145R突变，可导致HBsAg的抗原性和免疫原性发生改变。重要的是MHR内部含有多个半胱氨酸，如位点121、124、137、139和149，这些半胱氨酸的相互作用是形成抗原构象的重要因素。

α决定簇的核心区域为124~147位氨基酸，由MHR3和MHR4两个区域构成，又被细分为两个环，环1为124~137位氨基酸，环2为139~147位氨基酸。环2是α决定簇的核心区，由此可以解释G145R变异可导致HBsAg不能被检测到。α决定簇是公认的HBsAg共有结构，具有相当的普遍性，因此在目前的临床检测中具有重要意义。α决定簇也是病毒进入肝细胞的重要结合部位。构成抗原决定簇的原环（antigenic loop，AGL）位于101~172位氨基酸，涵盖了MHR区域，AGL是病毒黏附、侵入肝细胞及肝细胞内病毒解体的重要功能部位，换言之，AGL的构象不仅决定了HBsAg的抗原性，也决定了HBV的感染性。

根据小蛋白SHBsAg共同抗原表位α决定簇和两组互相排斥的亚型抗原表位d/y和w/r，HBsAg可分为adr、adw、ayr、ayw 4个基本血清型，可用于流行病学调查。这些亚型在世界各地分布不同。欧美各国以adw型为主，中东以ayw型为主。我国内地和沿海各省汉族主要为adr型；在广西壮族自治区以adw型为主；在西藏、内蒙古和新疆以ayw型为主；ayr型在我国罕见。

中蛋白MHBsAg是在主蛋白的氨基端增加55个氨基酸的蛋白，增加的部分即为前S2，其中心部位携带着主要的前S2抗原表位，但是与SHBsAg不同，其免疫表位为非构象依赖性，并且MHBsAg也不是病毒颗粒组装和释放所必需的，与HBV的感染力无直接关系。前S2与主蛋白基因串联表达后，可生成多肽p31和p35，糖基化后生成GP33和GP36。前S2多肽的某些序列对蛋白酶高度敏感，可被许多蛋白酶裂解，融合序列暴露，与细胞膜结合而侵入肝细胞。在前S2的氨基端第14~32位氨基酸存在一亲水区，这19个氨基酸在adr、ayw和ayr血清型均一致，adw血清型在第22位氨基酸与其他3种有所差异，这说明该区段极为保守，具有重要的生物学意义。这19个氨基酸不含半胱氨酸，说明其免疫原性不依赖于构象变化，而是线性表位依赖抗原。

大蛋白LHBsAg是在中蛋白的氨基端再扩增108~119个氨基酸的蛋白，扩增部分即前S1（2854~3211nt），包括前S1、前S2和主蛋白，共有389~400个氨基酸。前S1的长度具有一定的基因型特异性，基因型D前S1编码长度为108个氨基酸，基因型E和G编码118个氨基酸，基因型A、B、C、F、H编码119个氨基酸。LHBsAg缺少分泌信号肽，前48个氨基酸相对较为保守。当LHBsAg表达后加工形成蛋白p39和p43，糖基化后生成GP42。病毒粒子的组成比例是每100个SHBsAg有5个MHBsAg和1个LHBsAg。大蛋白在完整病毒外壳组装过程中起着决定性作用，前S1在病毒粒子中具有独特的双面拓扑结构，一方面在内质网中起到锚定作用，另一方面在细胞内存留，以组装病毒粒子。因此就病毒自然史而言，LHBsAg的功能是非常重要的。当被HBV感染的宿主细胞合成大量SHBsAg时，大部分堆积在内质网内部，它们彼此之间相互作用形成亚病毒颗粒（SVP）。当足量LHBsAg被合成后才与HBV核壳体（HBcAg）相互结合，形成成熟的病毒粒子，之后通过出芽方式释放到血液中。因此，抑制LHBsAg功能将中断HBV合成与释放，可以控制HBV在体内的扩散。

前S1蛋白和HBsAg是构型性的，前S2蛋白是线性的。三种蛋白的比例不同所形成的病毒颗粒也不同：①小球形颗粒仅由主蛋白或同时有约5%中蛋白组成；②管形颗粒由主蛋白、2%~5%中蛋白和5%~10%大蛋白组成；完整的病毒颗粒（Dane颗粒）由主蛋白、5%~10%中蛋白和约20%的大蛋白组成。小球形和管形颗粒为不含病毒核心的空衣壳颗粒。在新发感染患者血液中多为直径22nm的小球形颗粒，而病毒复制期患者还同时含有少量的长短不一、直径22nm的管形颗粒。完整的病毒颗粒直径约42nm，即使在病毒复制活跃的患者血液中，其含量也远较空衣壳外膜颗粒少。HBsAg氨基酸序列中有14个半胱氨酸残基（Cys），其中疏水区中的Cys48、Cys65、Cys69是病毒颗粒分泌所必需的；亲水区中的Cys137/139/147以二硫键（S—S）连接，形成α决定簇的二级结构，为HBsAg的主要抗原决定簇结构所必需。

2.外膜蛋白功能

1）大蛋白的调节作用

调节HBcAg核移位：细胞中的HBV核心蛋白主要存在于细胞核内，而外膜主蛋白和大蛋白存在于细胞质中，主要聚集在细胞核周围。核壳蛋白与外膜蛋白同时表达时，核壳蛋白与大蛋白都存在于细胞质中。大蛋白可促进核壳蛋白向核外转移，从而降低了它的核内部分的比例直至检测不出，它也可改变核心蛋白的亚细胞分布。在病毒感染早期大蛋白含量还很低，有利于核壳蛋白的胞核内转移，以及cccDNA的大量扩增；在感染后期大蛋白含量已增高，继而可装配成完整病毒颗粒分泌。

空衣壳颗粒和完整的病毒颗粒一样需要正常的外膜蛋白成分才能装配和分泌。小球形颗粒亦如此，当细胞内大蛋白过剩或大蛋白、主蛋白比例偏高时，都将抑制HBsAg颗粒进入血液中。这种抑制作用有助于完整病毒颗粒的装配。慢性HBV感染时细胞内小球形颗粒的输出与病毒复制呈正相关。血清中小球形颗粒的水平与病毒活跃复制的标志物（如血清HBV DNA、肝内HBcAg等）一致，也与HBeAg的输出一致，而与肝内细胞主蛋白含量呈负相关。肝细胞内大蛋白大量滞留，与主蛋白在胞内的存留相关。随着慢性感染事件的延长，肝细胞内主蛋白会持续增加，而其血清水平较低，与肝细胞内含量成反比。LHBsAg在肝细胞内表达最少，但对HBV在肝细胞内的持续感染及细胞生长状态都有重要的影响，介导HBV对肝细胞的黏附，病毒颗粒的装配、释放，超螺旋DNA扩增的调节及转录的反式激活，参与了机体内广泛的信号转导途径。

2）主蛋白的出芽和分泌

外膜主蛋白在细胞质中合成后，锚定在粗面内质网上形成跨膜蛋白，然后出芽进入内质网腔中形成亚病毒颗粒，最终以此形式分泌。

主蛋白有两段信号肽：信号肽Ⅰ近氨基端插入内质网膜，其后的亲水序列（内亲水襻）留在细胞质中，出芽后仍在病毒颗粒内部；信号肽Ⅱ亦插入内质网膜，但其后的亲水序列暴露在病毒颗粒表面，是HBsAg的主要抗原表位。表位肽段中有许多半胱氨酸，其间的双硫键使这一区段形成几个稳定的襻环。羧基端部分亦有很强的亲水性，与病毒颗粒的形成和分泌有关。

主蛋白及其他类型蛋白都以不同比例组合装配成小球形颗粒，管形颗粒或完整的病毒颗粒出芽进入内质网腔，通过细胞的分泌途径排到细胞外。

3）前S蛋白增强病毒复制和表达的作用

虽然HBV感染中亚病毒颗粒大量超过完整病毒颗粒的生物学意义还不明了，但在鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的实验中发现，亚病毒颗粒能明显增强细胞内病毒复制和基因表达。这一增强作用取决于感染量、完整病毒颗粒与亚病毒颗粒的比例。这一作用由亚病毒颗粒的前S蛋白激活，并需要细胞上有病毒受体结合区，可能是前S蛋白的转式激活功能所导致的，或是由亚病毒颗粒结合于细胞受体而激活某些信号途径所导致的。此发现的临床意义在于理解含HBV血清的传染性不仅取决于传染性完整颗粒的数量，而且与无核酸的外膜颗粒数量相关。

前S1大致可分为三个部分：①氨基端十四烷基化位点（1~8位氨基酸）；②下游肝细胞结合配体（2~47位氨基酸）；③下游羧基端部分。前S1蛋白参与病毒与肝细胞受体的结合以及肝细胞摄入病毒颗粒过程，与肝细胞表面病毒受体相结合，使得HBV进入宿主细胞内，对HBV的生活周期是必需的。位于包膜内侧的结构域具有病毒核心颗粒的结合位点，调节病毒颗粒的装配并与病毒包膜建立物理性的相互作用，控制病毒超螺旋基因组的扩增。位于包膜外表面的表位可以诱导出病毒中和抗体，改变宿主对病毒重组的反应。LHBsAg和SHBsAg一样，是HBV粒子合成所必需的结构蛋白，其前S1多肽氨基端是受体-配体结合功能域，存在十四烷基化位点，该位点是否烷基化与病毒合成无关，但是与病毒的感染力有关。虽然SHBsAg和LHBsAg均为病毒侵入的关键因素，但相对而言，前S1是更为重要的因素，尤其是它的前75个氨基酸部分，是病毒受体的配体。

前S2蛋白已被证明具有很强的反式调节作用，可以与蛋白激酶 C（PKC）结合，发生磷酸化反应而触发PKC依赖的 c-Raf1/MPKKK（丝裂原激活蛋白激酶）信号转导系统，从而激活转录因子，如激活蛋白-1（AP-1）、细胞核因子-κB（NF-κB）、激活蛋白-2（AP-2）、血清应答因子（SRF）、SP1和c-myc、c-fos启动子，参与病毒感染后的炎症和HCC的发生。主蛋白有226个氨基酸残基，可以诱导机体产生保护性抗体，也是HBV感染的主要标志之一。另外对病毒颗粒的装配及宿主细胞基因表达的改变也具有显著影响。

4）外膜蛋白的免疫作用

外膜蛋白使病毒能由感染的细胞分泌，并附着和侵入新的细胞，从而扩大感染范围。外膜蛋白上携带有B淋巴细胞和T淋巴细胞表位，给宿主提供保护性免疫的免疫原。其中前S蛋白具有很高的免疫原性，而且能强化对共存的S蛋白的免疫应答。HBV还能通过前S2蛋白与人血清白蛋白单体结合，稳定地存在于血液循环中，以此来逃避抗病毒免疫应答，这有助于病毒血症的持续。

前S2是一个强免疫原区域，可诱导独立的抗-前S2抗体。在H-2小鼠和非H-2小鼠的免疫实验中，研究者发现前S2多肽较SHBsAg具有更强的诱导T淋巴细胞的免疫原性，前S2多肽诱导H-2限制性T淋巴细胞反应的能力远大于SHBsAg，Th细胞在这个过程中具有重要的作用。与之相类似，前S2多肽对体液免疫的诱导能力也强于SHBsAg，在小鼠多肽疫苗接种实验中，较少量的前S2抗原就可诱导出较高水平的抗-前S2特异性抗体。由于前S2多肽在诱导CTL反应和抗体反应方面明显优于SHBsAg，提示前者具有较强的免疫原性，这些特征决定了前S2是较为理想的疫苗靶区域。

前S1既有线性抗原，又有构象性抗原，既有B淋巴细胞抗原，又有T淋巴细胞抗原。前S1多肽是以21~47位氨基酸区为主的中和抗原位点。这段区域又分为两段，21~32位氨基酸区是感染力决定位点，32~47位氨基酸区是中和抗体结合表位（37~45位氨基酸）。Lian等认为31~36位氨基酸区是前S区折叠成为构象性抗原的重要位点。2009年，Hellstorm等报告了含有前S1、前S2和SHBsAg的第三代疫苗（Sci-B-VacTm，BioHepB）的效果。比较而言，其诱导的抗体反应较强，生成速度较快。目前认为前S1抗原具有重要的抗原中和作用。

（二）核壳蛋白

HBV的C基因有两个与核心相关的开放阅读框，以第一个和第二个起始密码子ATG区分为前C区和C区。前C-ATG在1814nt，C-ATG在1901nt，前C区和C区有共同的终止密码子，在2458nt。C区ORF编码合成P21核壳蛋白，即HBcAg，成为病毒核衣壳的结构成分；前C区ORF编码合成p25前C蛋白，经信号肽裂解成为P22蛋白，进入内质网腔细胞分泌途径，其C末端被水解后成为P17，这一截短的蛋白即为HBeAg，最终分泌到细胞外。C基因附近区段是HBV复制的关键部位，有多种调节序列，如C-启动子（1742~1849nt）和增强子Ⅱ（1645~1803nt）可调节核壳蛋白的合成。

1.核壳蛋白的结构

1）核壳蛋白HBcAg的结构

HBcAg有保守的三维结构，可因血清型不同而有183~185个氨基酸残基，相对分子质量为21000（P21c），180个HBcAg经组装后形成27nm的正二十面体以构成核心颗粒。HBcAg的1～144位氨基酸区是核壳装配区，其双体自发组装进入核壳；而羧基端的150~185位氨基酸区是精氨酸富集区，可与前基因组RNA结合，将其包裹进入核心。HBcAg的羧基末端是与RNA/DNA结合的区段，也可以与DNA聚合酶的包装信号ε结合而启动逆转录，此外其羧基末端有鱼精蛋白样亲胞核性，可介导细胞核内转运信号，导致大量HBcAg进入细胞核内。HBcAg受细胞激酶作用后部分磷酸化，此磷酸化对核心内DNA合成、复制和传染的建立都至关重要。

2）可溶性分泌型HBeAg的形成及结构

HBeAg是核壳蛋白的分泌型，在病毒间和感染个例间都是高度保守的。

从前C-ATG起始合成的212个氨基酸的前C/C蛋白p25 ^e （相对分子质量为25000）是HBeAg的前体。前体的氨基端有一个19肽的信号肽，介导转运p25进入内质网腔。该信号肽带正电荷的氨基末端与带负电荷的细胞质膜内侧结合，中间部分为疏水区，具有跨膜的结构特点。随着新生肽段的延伸，信号肽断裂位点暴露在膜外侧而为信号肽酶所切割，成为处理过程的中间产物P22 ^e 。P22 ^e 可转运和插入细胞膜，释放入细胞质中，也可转运入细胞核，亦可被抗HBe所识别，可能在免疫应答介导的发病机制和病毒清除中有重要作用。P22 ^e 在细胞腔膜系统中被蛋白酶水解而失去羧基端的33个氨基酸残基，形成157个氨基酸的P17 ^e ，即HBeAg。HBeAg在血流中罕见游离存在，常与血清蛋白结合。

3）HBV核心相关抗原（HBcrAg）的组成

HBcrAg由三种病毒蛋白（HBcAg、HBeAg和小的核心相关蛋白（p22蛋白））组成，是HBV复制的新型血清学标志（图3-2）。亚洲和欧洲的研究证实，未接受过治疗的CHB患者的血清HBcrAg水平与血清HBV DNA水平之间存在密切相关性。此外，一些研究还发现血清HBcrAg水平与cccDNA定量和转录活性相关。

2.核壳蛋白的功能

1）核壳蛋白HBcAg的功能

HBcAg有高度的免疫原性，几乎所有HBV感染者都产生抗HBc，同时伴有T淋巴细胞免疫应答。一些HBV感染者缺乏抗HBc，一般不是由于病毒HBc序列的变异，而主要是宿主免疫系统的应答性较弱。对HBcAg的免疫应答在病毒清除中可能有重要作用。HBcAg还可用作HBV外膜，甚至成为其他病毒抗原的载体分子，而且在动物中口服或注射免疫都相当成功。抗HBc识别的主要表位取决于HBcAg的构型，它展现在天然核心颗粒表面的区段是特异性针对B淋巴细胞的表位。模拟一些亲水区段的合成寡肽进行抑制性抗HBc-EIA，结果表明HBcAg的主要B淋巴细胞表位在107~118位氨基酸和77~82位氨基酸等区域，可能是非连续性的表位。

Th1和Th2细胞通过分泌的细胞因子相互下调对方的生长分化，刺激自身的增生。机体的Th1型免疫反应可促进对病毒的清除，Th2型免疫反应则可加重机体的病理损害。在HBcAg的诱导下，外周血单个核细胞（PBMC）产生Th1类细胞因子的数量明显增多；在HBeAg诱导下，Th2类细胞因子的数量明显增多。慢性HBV感染者进行免疫调节治疗的一个目的是使HBeAg特异性T淋巴细胞由Th2细胞主导型转化为Th1细胞型，HBcAg有望打破HBeAg诱导的免疫耐受状态而增强Th1细胞的优势表达。CHB患者和HBV携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，纠正CTL的这种低反应状态，对于机体有效地清除HBV至关重要。

近年来发现，HBcAg具有一定的基因调控功能，可以调节宿主某些基因的表达，参与疾病的发生、发展。例如，有研究发现HBcAg可以调节IL-18在CHB患者中的表达。另外还有研究发现，HBcAg可以诱导胰岛素样生长因子-Ⅱ（insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ）的表达。HBcAg还可以诱导凋亡相关基因Bcl-X的表达。HBcAg可激活重型肝炎相关的凝血酶原酶fgl2基因的转录，使之高度表达并促进肝细胞坏死的发生及发展。

2）可溶性分泌型HBeAg的功能

HBeAg不是病毒的结构蛋白，也不参与病毒复制，其高度保守性有重要功能。HBeAg能阻断CTL对HBc相关表位的免疫活性。新生儿的免疫耐受是由HBeAg通过HBV感染母亲的胎盘引起的，HBeAg导致小儿长期保持稳定的免疫耐受状态（高水平的病毒血症和对感染细胞免疫应答的抑制），使得HBV逃避免疫清除而在无症状携带者群体中长期存在；成人体内的HBeAg可调节免疫发病机制，分泌HBeAg是HBV引起机体免疫无应答的策略。一般认为，HBV感染细胞的清除，发生在核壳蛋白表达的肝细胞膜上和T淋巴细胞被激活以后，HBeAg阻断CTL，将免疫攻击由感染的肝细胞转移开。

（三）HBx蛋白

1.HBx蛋白的结构

X-ORF位于1374~1835nt（462 bp），是HBV的4个ORF中最小的一个。其中一个亚型adr的X-ORF有27 bp缺失，不同亚型HBx的氨基酸残基数不同。X-mRNA约0.8kb，启动子x-promoter在其上游的200个核苷酸内。HBx蛋白是一个含有145~154个氨基酸残基的多肽，转式激活的功能性区段在49~143位氨基酸之间，其中以107~130位氨基酸区段活性最重要，在氨基端有一转录活性的负性调节区。HBx表达很弱，HBx抗原性亦很弱或很不稳定，目前还未从血液、感染的肝脏或转染的细胞中纯化出来。

2.HBx蛋白的反式激活

1）HBx的反式激活机制

HBx并不直接和DNA结合，故不是典型的反式激活因子。HBx必须与一些特定的细胞因子相连接，它是细胞特异性的；而这些细胞因子又不是DNA序列的特异性结构。HBx与细胞转录因子相结合，转录因子与特定的DNA序列如顺式作用元件等结合形成转录起始复合物。HBx与转录起始复合物的相互作用可提高转录的效率。HBx可与一些核转录因子结合，如与AP-1、AP-2、NF-κB结合，进而与诱导基因表达的启动子或增强子结合，形成转录起始复合物，实现反式激活过程。

HBx的转录激活作用主要通过直接蛋白反应和信号转导通路实现。在细胞核内HBx与各种DNA结合蛋白连接，以激活基础转录机制。HBx在细胞质中刺激cAMP的应答元件、蛋白激酶C、丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、活性氧介质（ROI）。HBx可激活Ras-Raf-MEK-MAPK的细胞质激酶信号级联途径，从而激活转录因子AP-1和NF-κB（图3-3）。

细胞质内HBx刺激细胞内信号途径，细胞核内HBx与DNA结合蛋白结合可直接激活转录机制。CRE，cAMP应答元件；PKC，蛋白激酶C；ROI，活性氧介质；MAPK，丝裂原激活的蛋白激酶。

（引自：Henkler F，et al.J Viral Hepat，1996，3（3）：109-121.有修改。）

2）HBx对HBV复制的激活作用

HBx参与RNA聚合酶（poly）Ⅱ活性的调节：RPB5是poly中对激活转录非常重要的亚单位，HBx可与RPB5的结合蛋白（RPB5 mediating protein，RMP）相互作用。RMP与HBx的作用是相互对立的，它们能够竞争性地与RPB5 结合。RMP通过与RPB5的相互作用抑制poly的转录活性；而HBx通过与RPB5的相互作用提高poly的转录活性。

HBx是转录因子的调节子，它能通过顺式元件反式激活病毒和宿主基因。与HBx共同作用的因子属于bZIP家族，HBx能通过增强bZIP二聚体促进bZIP DNA的稳定性，也能促进此二聚体的亲和力。HBx可通过调控多种转录因子而反式激活病毒或宿主基因的启动子促进病毒的复制和转录。

HBx还可与一些蛋白质酶相互作用，例如，与26S蛋白质酶体的2个亚基PSMA1、PSMA7在其同一区域发生直接竞争作用，从而抑制26S蛋白质酶体的活性，从而可保证病毒蛋白质的正确加工和折叠，干扰宿主细胞抗原呈递反应的正常进行。

HBx可能通过反式激活作用、与细胞蛋白间的相互作用或者其他途径影响多条细胞信号转导通路。相关研究已证实，HBx通过Src激酶家族活化Ras，激活Ras-Raf-MAPK信号级联途径，活化相应转录因子。HBx可活化Ras-MEK-MAPK信号转导途径，促进中心体扩增、多极纺锤体形成，使有丝分裂异常，染色体传代发生错误，进而影响细胞功能。HBx通过活化IKKα和IKKβ使NF-κB 的抑制因子 IκB 磷酸化，进一步导致 IκB 泛素化和蛋白酶体介导的降解反应，使NF-κB从细胞质复合体中释放出来，移位到细胞核，恢复其转录激活活性，进而转录激活相应靶基因如Bcl-2和IAP等。Bouchard等发现，HBx通过作用于细胞质Ca ²⁺ 储存库，促进Ca ²⁺ 释放，进而活化Ca ²⁺ 依赖的Pyk2，激活Pyk2-Src激酶信号转导途径，促进HBV 的逆转录和DNA 复制。HBx还可通过JAK1 激酶活化JAK/STAT 途径，促进各种STAT激酶的磷酸化，增加STAT和DNA结合，从而调控相关基因的转录。HBx对这些信号转导通路的调节，可能影响病毒的转录和复制，以及细胞周期、细胞增殖分化、细胞凋亡等过程。

3）HBx对宿主基因的调控作用

HBx抑制野生型p53的活性：野生型p53（wtp53）是抑癌基因，是一种转录因子，wtp53具有广泛的生物学功能，参与控制细胞周期、诱导凋亡、调节细胞信号系统等。HBx蛋白的反式激活功能区内有与p53结合的位点，而p53内有2个HBx的结合位点。HBx与p53的C端结合后，p53功能丧失。Lin等发现，HBx与p53结合后，wtp53的正常功能被抑制，从而干扰了G0～G1细胞周期检测点的调控，因此提高了细胞的存活率。

HBx抑制Fas介导的细胞凋亡：Fas/FasL系统是介导细胞凋亡的主要系统之一，包括Fas及其配体FasL和可溶性Fas。Fas与FasL结合，就可触发Fas（+）细胞凋亡。细胞表达HBx蛋白后，可上调SAPK-JNK活性，从而抑制Fas介导的细胞凋亡。Terradillos等研究发现，HBx通过诱导细胞色素C的释放和上调Caspase 3的活性，进而对Fas介导的细胞凋亡呈现低敏感性，使细胞出现无限增殖的可能。

HBx抑制Caspase 3的活性：Caspase 3属于半胱氨酸蛋白酶家族成员，能通过蛋白裂解作用分解凋亡下游底物，使DNA裂解，导致细胞死亡。实验证明，HBx与Caspase 3虽然不能发生直接相互作用，但是作为Caspase 3的抑制剂，它可以与Caspase 3的底物发生竞争性结合，抑制Caspase 3的活性，从而使Caspase 3所参与的凋亡过程难以启动。

HBx可以通过激活HBx-PI3K-AKT-Bad的信号转导通路，而发挥抗凋亡作用：HBx可以活化PI-3激酶，活化的 PI-3激酶传递细胞存活的信号，它可以进一步活化AKT，AKT使Bad磷酸化，磷酸化的Bad能使Bcl-2 家族中的2个凋亡蛋白质Bcl-2和Bcl-xL 失去促凋亡活性，从而发挥抗凋亡作用。

诱导凋亡：有实验表明，HBx能诱导细胞凋亡。对HepG2细胞转染HBx后，用流式细胞仪检测发现细胞凋亡增多，提示HBx可以诱导细胞凋亡，但是确切机制尚不明确，可能与HBx在胞内的聚集形式有关系。Davis等研究发现，ERK和JNK途径可被HBx同时活化，但是ERK途径导致细胞增殖和分化，而JNK途径则诱导凋亡，但其具体机制不清楚，可能与JNK途径的持续活化有关。

HBx对肝细胞遗传学的影响：Livezey等报道，HBx可诱导肝细胞染色体改变和微粒体形成。转染HBx的HepG2细胞与对照组细胞相比，微粒体明显增多，2号、18号、20号染色体发生重排，基因组稳定性受到影响，这增加了细胞基因突变的可能性。Forgues等发现HBx能促进异常中心体和多极纺锤体的形成，增多的中心体导致有丝分裂功能异常及染色体传代错误的概率增大。HBx还可使细胞质中Crm1（核输出受体1）分离，诱导NF-κB的核定位，Crm1参与维持中心体的完整性，这提示HBx通过抑制Crm1的活性破坏基因组的完整性，促进细胞恶性转化，进而增加癌变的危险性。

HBx可上调端粒酶逆转录酶活性，使端粒持续合成并加到染色体末端，阻止其缩短，促进肝癌细胞持续增殖，对肿瘤的发生有重要意义。HBx可与X相关蛋白-1（XAP-1）结合，影响核苷酸切除修复的后续步骤，从而阻止损伤DNA的修复。HBx通过诱导膜基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）和环氧合酶（COX-2）的表达，促进肿瘤血管增生，加速肿瘤的侵袭和转移。HBx通过缩短c-myc诱导癌变的潜伏期，加快肝细胞增殖，促进肝癌的发生。Zhu等发现在转基因小鼠中，HBx使小鼠对二乙基亚硝胺诱导的肿瘤更敏感。这表明HBx可使肝细胞对其他致癌因子的敏感性增加，从而加速肝癌发展。

（四）P蛋白

1.P蛋白的结构

在HBV DNA序列中P基因是最长的ORF，其开始区段与C基因的后部区段重叠，中间区段与前S/S基因重叠，末端则与X基因的后侧大部分区段重叠。其编码产物是一种多蛋白，即P蛋白，P蛋白总共含有816个氨基酸残基，含有N末端蛋白（TP）、逆转录酶（RT）/DNA多聚酶、RNase H和隔离片（spacer，SP）4个结构域，各结构域分别位于2307~2840nt、133~1128nt、1129~1621nt和2841-0-132nt。其前面紧邻逆转录聚合酶，在编码末端蛋白和两种酶之间的核苷酸区段与前S区重叠，该区段序列可有相当不同，可能是无功能的间隔区段。活性型聚合酶全长产物相对分子质量为134000，经蛋白酶K水解成相对分子质量为7300的活性成分。

2.P蛋白的功能

HBV RNA的逆转录需要如下几种功能：RNA的包装，DNA合成的引导，在RNA和DNA的模板上DNA的聚合，以及在RNA-DNA杂交体中RNA的消化。这些功能主要由P基因的编码蛋白来完成，P蛋白几乎参与病毒复制的全过程。

嗜肝病毒逆转录酶（多聚酶P）含有的4个区域中，末端蛋白和隔离片对嗜肝病毒多聚酶是独特的，末端蛋白内的第96位酪氨酸残基可引导DNA合成，并使多聚酶与病毒DNA共价结合，隔离片无已知的功能，只是将末端蛋白和其他分子连接起来，逆转录酶和RNase H包含2个已知的酶活性位点，后两者与其他相关的逆转录病毒和逆转录因子的多聚酶是一致的。Lott等用昆虫细胞同时感染独立表达核心蛋白和多聚酶的杆状病毒，结果发现核心蛋白与多聚酶相互作用的几个特征如下：①核心蛋白与表达全长的多聚酶及多聚酶的TP、RT、RNase H每个区域能共同结合沉淀；②核心蛋白的共同沉淀不依赖ε凸出环序列；③核心蛋白-多聚酶复合物在蔗糖梯度分析中作为完整的衣壳体移动。

Lin等研究了两个自然发生的HBV颗粒56和2-18，核酸序列有98.7%的同源性，但是复制效率不同。转染到HepG2细胞后，从56转染细胞的细胞内病毒核心颗粒分离出的HBV DNA明显高于2-18。在RT区域内，2-18与56的氨基酸差异在617位（蛋氨酸对亮氨酸）、652位（丝氨酸对脯氨酸）、682位（缬氨酸对亮氨酸）。652位氨基酸上的点突变是这种复制效率差异的原因。HBV RT结构域的同源性模型研究提示652位氨基酸残基从脯氨酸到丝氨酸突变可能影响对模板-引物相互作用的HBV RT的构造，导致多聚酶活性减弱。

Li等在T7噬菌体启动子的调控下构建HBV多聚酶cDNA，并在兔的网状细胞裂解液中表达，组成一对转录翻译系统。在指定位点的突变中进一步证实重组多聚酶cDNA产生3种产物，即全长蛋白（相对分子质量约94000）、内在的始动蛋白（相对分子质量约81000）、N末端蛋白（相对分子质量约40000）。体外表达的多聚酶具有蛋白引物的活性，由体外32P标记的dGTP全长多聚酶和TP引导的检测可得到证实。

Kim等将人HBV多聚酶的N末端或C末端和DNA多聚酶的结构域同时缺失形成变异株，并在大肠埃希菌中表达，经直链淀粉柱层析法纯化后，其纯化蛋白的DNA依赖性DNA多聚酶活性与野毒株进行比较，结果TP与SP缺失分别可以使酶活性减少到70%，而RNase H缺失对多聚酶活性的影响要大于前两者。单个RT或将其N末端缺失仍能保持酶活性。将人的HBV多聚酶在兔网状细胞裂解系统中表达，表达蛋白显示出DNA依赖性的DNA多聚酶活性，在体外转录和翻译产生相对分子质量约100000的大蛋白。HBV DNA多聚酶在pH为7.5和温度37℃时聚合反应最佳，同时，多聚酶活性需要有MnCl ₂ 、MgCl ₂ （最好是MnCl ₂ ）参与。

三、HBV编码蛋白与乙型肝炎重症化

（一）HBV核心蛋白与重型肝炎

1.HBcAg的免疫原性与重型肝炎

目前公认的HBV导致肝细胞坏死的主要原因不是HBV在其内大量复制，而是机体强烈的细胞免疫反应。乙型肝炎的肝细胞免疫病理损伤以T淋巴细胞毒性反应为主。在肝细胞膜上表达的核心抗原（HBcAg）是CD8 ⁺ CTL攻击的靶抗原。此外，在肝细胞膜上表达的HBeAg、前S1蛋白、前S2蛋白也可能是CTL攻击的靶抗原。

2.HBcAg对宿主基因的激活作用与重型肝炎

病毒核心蛋白可通过调节某些宿主细胞基因的表达参与重型肝炎发病过程。小鼠暴发性肝炎模型的研究表明，鼠肝炎病毒3型（MHV-3）的核心蛋白能特异性激活具有凝血酶原酶功能的鼠纤维介素基因（mfgl2）的表达，而该基因在人及小鼠暴发性肝炎中均发挥着重要作用。通过进一步研究发现，MHV-3的核心蛋白通过肝细胞核因子4作为转录因子与相应的顺式作用元件区结合从而激活该基因的表达，激活凝血级联途径，促进肝脏微循环障碍和肝细胞坏死的发生。研究发现，在人类，HBc蛋白可激活宿主纤维介素基因hfgl2的表达从而导致纤维蛋白的沉积，促进肝细胞坏死的发生。HBcAg通过激活肝细胞内的p38、ERK1/2和NF-κB来增强IL-6的产生，这说明胞质中HBcAg与严重的肝脏损伤和炎症相关。

3.分泌型HBeAg在重型肝炎中的作用

Milich等发现，循环中的HBeAg耗竭能促进病毒持续感染，而持续的病毒复制是引发重型肝炎的发病机制之一。

HBeAg能与NEMO相互作用，NEMO是与IκB激酶相关的调节亚基，而IκB调节NF-κB的活性。HBeAg抑制IL-1β介导的TRAF6依赖的K63相关的NEMO的泛素化，以此下调NF-κB活性，促进病毒复制。

4.HBcrAg与HBV复制密切相关

有研究显示，血清HBcrAg阳性是接受高风险免疫抑制治疗的隐匿性肝炎患者（HBsAg阴性、HBcAb阳性）发生病毒学反弹的重要风险因素。Zoulim Fabien团队采用化学发光法定量检测130例未经治疗的慢性乙型肝炎患者血清HBcrAg水平，发现HBcrAg水平与血清HBV DNA、HBsAg定量及ALT水平呈正相关，与肝内总的HBV DNA、cccDNA、pgRNA定量及cccDNA转录活性呈正相关，与纤维化及炎症活动性相关。结果提示HBcrAg定量有可能作为肝内HBV cccDNA水平及转录活性的替代指标，用来评估新药抗病毒疗效，对cccDNA池的影响，以及是否达到功能性治愈等。

（二）HBx蛋白与重型肝炎

1.HBx蛋白与肝细胞坏死

1）HBx蛋白对纤维介素基因hfgl2的激活作用及其机制

fgl2纤维介素基因又名fgl2凝血酶原酶基因，简称fgl2基因，属纤维蛋白原相关蛋白超家族，主要由活化的单核-巨噬细胞及内皮细胞产生。fgl2有两种表型，即跨膜型和分泌型。跨膜型fgl2主要的生物学活性类似于活化的凝血因子Ⅹa，可直接催化凝血酶原转变为凝血酶，继而使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，从而快速启动凝血途径。已有的研究表明，fgl2与重型肝炎、自发性流产、同种及异种移植排斥反应等疾病的病情进展有密切关系。在MHV-3感染的敏感小鼠体内，鼠纤维介素基因（mfgl2）高度表达，已证实MHV-3的核心蛋白可以激活mfgl2的高度表达，且这种高度表达是通过体内转录因子HNF-4与mfgl2基因启动子调控区域的顺式作用元件位点结合而导致该基因激活的。

在亚洲，HBV感染是引起人类重型肝炎的主要病因之一。HBV编码蛋白已被证实具有激活人体内多种基因的功能。研究发现，HBV蛋白HBc及HBx分别通过激活ERK途径及JNK途径，继而激活转录因子c-Ets-2，使之移位至核内，并与hfgl2基因启动子上顺式作用元件结合，上调hfgl2基因的表达（图3-4）。该研究从病毒蛋白与宿主基因的相互作用角度上进一步阐明了乙型重型肝炎hfgl2基因高度表达的分子机制，而c-Ets-2有可能成为此疾病干预的又一分子靶点。

HBV野生株编码的蛋白HBc和HBx分别激活ERK 和JNK信号途径，继而激活转录因子c-Ets-2，使其转位至细胞核内，与hfgl2基因启动子上相应顺式作用元件结合，激活该基因的表达。

2）HBx对其他炎性损伤相关基因的调控作用

（1）HBx对炎性趋化因子MIG启动子的激活作用机制。在通过实时PCR、ELISA等方法检测HBV转染细胞、HBx转染细胞及肝癌细胞趋化因子的表达，并发现若干炎性趋化因子的差异表达的基础上，进一步通过基因芯片检测证明了高压注射HBV的小鼠肝细胞某些炎性趋化因子表达的差异，扩增获得了多种炎性趋化因子启动子片段，发现调控MIG的病毒基因，HBx蛋白能在转录水平激活炎性趋化因子MIG的表达，而且HBx蛋白对炎性趋化因子MIG的转录激活作用随HBx蛋白浓度的增加而增强。同时发现过表达NF-κB的亚基p65和p50蛋白可以诱导炎性趋化因子MIG的表达；趋化实验结果显示，HBx蛋白诱导产生的MIG能增强细胞对体外培养的PBMC的趋化作用，而且HBx蛋白可能通过激活NF-κB而激活其他炎性趋化因子表达，从而在炎性细胞的聚集过程中起着一定的作用。

（2）HBx对炎性趋化因子IP-10启动子的激活作用机制。研究发现HBV编码的病毒蛋白HBx能够呈剂量依赖性地增加IP-10的表达水平。HBx蛋白能够激活NF-κB活性，使其亚单位p65发生核转位，活化的NF-κB能够直接结合在IP-10启动子的NF-κB1（-122~-113）位点上，激活IP-10的转录。使用NF-κB的抑制剂能够阻断HBx诱导的IP-10活性。NF-κB亚单位p65与p50也能够上调HepG2细胞IP-10的表达。诱导上调的IP-10能够通过NF-κB依赖途径趋化外周血淋巴细胞。在上述研究基础上进一步研究证明，HBx通过TRAF2/TAK1/NF-κB信号途径诱导IP-10 的表达，参与炎症反应（图3-5）。TRAFs、TAK1等信号分子作为Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号途径的下游分子，参与TLRs信号途径引起的炎症反应，并且与肿瘤抗凋亡有关，提示HBx可通过TLRs介导炎症因子的表达。该研究提出了HBV感染通过TLRs信号途径上调IP-10表达的新机制，即HBV编码的蛋白HBx通过NF-κB途径激活IP-10启动子转录，对HBV感染后募集大量白细胞造成肝脏损伤提供了新的理论基础。

TRAF2，肿瘤坏死因子受体相关因子2；IP-10，γ干扰素诱导蛋白10；TKA1，转录生长因子β激活激酶1；NF-κB，核因子κB；M，巨噬细胞；NK细胞，自然杀伤细胞。

（3）HBx对细胞因子IL-32启动子的激活作用机制。HBx能够呈剂量依赖性地增加IL-32的RNA水平和蛋白的表达，且荧光素酶试验表明HBx可激活IL-32的启动子活性，转录因子NF-κB参与了该基因的转录激活。

（4）HBx蛋白通过上调miR-146a从而下调H因子复合物（CHF），导致肝炎发展的机制。HBx通过NF-κB介导miR-146a启动子活性增强从而上调miR-146a的表达水平，上调的miR-146a在肝细胞内通过与CHF mRNA的3′非编码区结合而下调CHF表达水平。该研究显示HBx蛋白通过基因调控下调H因子复合物而促进肝脏炎症。

以上研究表明，病毒蛋白对宿主炎性基因具有转录调控作用，从而导致炎性基因的高度表达及炎症反应的暴发。HBx可激活IP-10及MIG的产生，使中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞募集到肝脏；病毒蛋白HBx激活并促进细胞因子IL-6、IL-32在肝细胞的高度表达，促进了炎症反应的发生；病毒蛋白HBc和HBx通过激活转录因子c-Ets-2和MAPK信号途径诱导巨噬细胞高度表达fgl2凝血酶原酶，激活凝血级联途径，导致纤维蛋白沉积在肝脏，最终导致肝脏微循环障碍、肝细胞损伤和坏死的发生。该类研究从病毒与宿主相互作用的环节揭示了乙型重型肝炎肝细胞坏死发生的分子机制（图3-6）。

NK细胞，自然杀伤细胞；N，中性粒细胞；MIG，γ干扰素诱生的单核因子；IP-10，γ干扰素诱导蛋白10；IL-6，白细胞介素6；IL-32，白细胞介素32；fgl2，fgl2凝血酶原酶。

2.HBx与肝细胞凋亡

HBx基因是最小的开放阅读框，其编码产物为145～154个氨基酸的多肽。以前认为HBx能通过增强细胞生长而激活细胞内原癌基因。现在研究认为，HBx能促进肝细胞凋亡。如HBx蛋白能促进抑癌基因p53介导的程序性细胞死亡。HBx蛋白能使感染HBV的肝细胞对凋亡敏感从而促使炎症进一步发展。通过转基因鼠模型和转染细胞实验证实，HBx蛋白能促进细胞凋亡。HBV感染细胞的HBx能定位于细胞线粒体，并通过改变线粒体膜电位而激活线粒体介导的凋亡途径。Yoo等不仅证实了HBx蛋白能激活FasL基因在HBV感染相关肝癌细胞中的表达，并且研究了在HBx蛋白作用下，引起FasL基因表达所需的顺式作用元件和反式作用因子，并证实FasL基因的表达是由反式作用因子Egr-2和Egr-3活性的增加所致。这说明HBx基因的表达能促进肝细胞凋亡的发生，并可能成为重型肝炎肝细胞凋亡的机制之一。

（三）病毒蛋白HBs与重型肝炎

1.未变异的病毒蛋白HBs与重型肝炎

HBV的表面蛋白HBs能形成长分支丝状颗粒，聚集在内质网内，使肝细胞对IFN-γ高度敏感，而IFN-γ是对病毒感染细胞具有明显清除作用的细胞因子。HBs刺激可使肝细胞对TNF-α的敏感性增强，而且HBV感染对内毒素激活的单核-巨噬细胞释放TNF-α有明显促进作用。

2.变异的病毒蛋白HBs与重型肝炎

与RT区YMDD变异相关的HBs变异被称作YMDD相关性HBs变异。目前发现，该种变异与重型肝炎的发生有关。YMDD相关性HBs变异可激活宿主hfgl2基因，促进肝细胞坏死及微循环障碍的发生，从而诱导重型肝炎的发生。尽管绝大多数患者会由于YMDD突变而发生肝炎重症化，但是对已有肝硬化以及HBeAg血清学反弹的患者来说，应该考虑尽早进行肝移植手术。

核苷（酸）类似物（NAs）抗病毒治疗可有效抑制病毒复制，而长期应用NAs或使用不当则易出现病毒耐药，进而导致病毒抑制减弱和疾病进展，有时甚至导致重型肝炎的发生。笔者发现野生型HBs不能促进凝血酶原酶hfgl2的产生，而YMDD变异相关性HBs变异则可通过激活转录因子Ets特异性地与其顺式作用元件结合而激活hfgl2基因的转录，这揭示HBs突变蛋白在乙型肝炎重症化发展中发挥作用（图3-7）。

HBs突变蛋白作用于Ets反式作用元件，使其核移位至细胞核内，结合至其对应的顺式作用元件，激活hfgl2基因启动子，进而激活hfgl2基因转录。HBs Mut：乙型肝炎病毒表面抗原突变子。

（引自：Weina li，et al.Biochemistry（Mosc），2011，76（9）：1043-1050.）

随着医学分子生物学、免疫学等相关学科的发展，病毒蛋白在疾病病理生理过程中的作用将越来越引起人们的关注。通过探讨其中的分子生物学机制，可找到有效的分子治疗靶点，为开辟新的分子水平治疗重型肝炎提供理论和实验依据。

参考文献

［1］骆抗先.乙型肝炎基础和临床［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2006.

［2］成军.现代肝炎病毒分子免疫学［M］.北京：科学出版社，2011.

［3］成军.现代肝炎病毒分子生物学［M］.2版.北京：科学出版社，2009.

［4］范红梅，杨林.乙型肝炎病毒X蛋白的生物学功能研究进展［J］.国际流行病学传染病学杂志，2006，33（2）：100-103.

［5］李进，刘妍，张玲霞.乙型肝炎病毒X蛋白的功能研究进展［J］.人民军医，2006，49（4）：226-228.

［6］陈国凤，成军，王琳，等.乙型肝炎病DNA多聚酶P结构域研究进展［J］.世界华人消化杂志，2004，12（2）：393-397.

［7］Henkler F F，Koshy R.Hepatitis B virus transcriptional activators：mechanisms and possible role in oncogenesis［J］.J Viral Hepat，1996，3（3）：109-121.

［8］Pan X，Cao H，Lu J，et al.Interleukin-32 expression induced byhepatitis B virus protein X is mediated through activation of NF-κB［J］.Mol Immunol，2011，48（12-13）：1573-1577.

［9］Zhou Y，Wang S，Ma J W，et al.Hepatitis B virus protein X-induced expression of the CXC chemokine IP-10 is mediated through activation of NF-κB and increases migration of leukocytes［J］.J Biol Chem，2010，285（16）：12159-12168.

［10］Xia L M，Huang W J，Wu J G，et al.HBx protein induces expression of MIG and increases migration of leukocytes through activation of NF-κB［J］.Virology，2009，385（2）：335-342.

［11］Xiang W Q，Feng W F，Ke W，et al.Hepatitis B virus X protein stimulates IL-6 expression inhepatocytes via a MyD88-dependent pathway［J］.J Hepatol，2011，54（1）：26-33.

［12］Han M，Yan W，Guo W，et al.Hepatitis B virus-inducedhFGL2 transcription is dependent on c-Ets-2 and MAPK signal pathway［J］.J Biol Chem，2008，283（47）：32715-32729.

［13］Li W，Han M，Li Y，et al.Antiviral resistance mutations potentiate HBV surface antigen-induced transcription ofhfgl2 prothrombinase gene［J］.Biochemistry（Mosc），2011，76（9）：1043-1050.

［14］Wu Z，Han M，Chen T，et al.Acute liver failure：mechanisms of immune-mediated liver injury［J］.Liver Int，2010，30（6）：782-794.

［15］Bar-Yishay I，Shaul Y，Shlomai A.Hepatocyte metabolic signalling pathways and regulation ofhepatitis B virus expression［J］.Liver Int，2011，31（3）：282-290.

［16］Kew M C.Hepatitis B virus x protein in the pathogenesis ofhepatitis B virus-inducedhepatocellular carcinoma［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26（Suppl 1）：144-152.

［17］Locarnini S，Zoulim F.Molecular genetics of HBV infection［J］.Antivir Ther，2010，15（Suppl 3）：3-14.

［18］Kao J H，Chen P J，Chen D S.Recent advances in the research ofhepatitis B virus-relatedhepatocellular carcinoma：epidemiologic and molecular biological aspects［J］.Adv Cancer Res，2010，108：21-72.

［19］Nguyen D H，Ludgate L，Hu J.Hepatitis B virus-cell interactions and pathogenesis［J］.J Cell Physiol，2008，216（2）：289-294.

［20］Lupberger J，Hildt E.Hepatitis B virus-induced oncogenesis［J］.World J Gastroenterol，2007，13（1）：74-81.

［21］Chen Z，Li Y X,Fu H J,et al.Hepatitis B virus core antigen stimulates IL-6 expression via p38，ERK and NF-κB pathways inhepatocytes［J］.Cell Physiol Biochem，2017,41（1）：91-100.

［22］Testoni B，Lebossé F,Scholtes C,et al.Serumhepatitis B core-related antigen（HBcrAg）correlates with covalently-closed circular DNA transcriptional activity in chronichepatitis B patients［J］.J Hepatol，2019,70（4）:615-625.

［23］Wang Y，Cui L,Yang G,et al.Hepatitis B e antigen inhibits NF-κB Activity by Interrupting K63-Linked ubiquitination of NEMO［J］.J Virol，2019,93（2）:e00667-18.

［24］Seto W K，Wong D K,Chan T S,et al.Association ofhepatitis B core-related antigen withhepatitis B virus reactivation in occult viral carriers undergoinghigh-risk immunosuppressive therapy［J］.Am J Gastroenterol,2016,111（12）：1788-1795.

［25］Kouwaki T，Okamoto T,Ito A,et al.Hepatocyte factor JMJD5 regulateshepatitis B virus replication through interaction with HBx［J］.J Virol，2016,90（7）：3530-3542.

［26］Feng G X，Li J,Yang Z,et al.Hepatitis B virus X protein promotes the development of liver fibrosis andhepatoma through downregulation of miR-30e targeting P4HA2 mRNA［J］.Oncogene，2017,36（50）：6895-6905.

［27］Li J F，Dai X P,Zhang W,et al.Upregulation of microRNA-146a byhepatitis B virus X protein contributes tohepatitis development by downregulating complement factor H［J］.MBio，2015,6（2）:e02459-14.

［28］Yuen M F，Kato T,Mizokami M,et al.Clinical outcome and virologic profiles of severehepatitis B exacerbation due to YMDD mutations［J］.J Hepatol，2003,39（5）：850-855.

［29］Kimura T，Rokuhara A，Sakamoto Y，et al.Sensitive enzyme immunoassay forhepatitis B virus core-related antigens and their correlation to virus load［J］.J Clin Microbiol,2002,40（2）：439-445.

［30］Wong D K，Tanaka Y，Lai C L，et al.Hepatitis B virus corerelated antigens as markers for monitoring chronichepatitis B infection［J］.J Clin Microbiol,2007,45（12）：3942-3947.

［31］Suzuki F，Miyakoshi H，Kobayashi M，et al.Correlation between serumhepatitis B virus core-related antigen and intrahepatic covalently closed circular DNA in chronichepatitis B patients［J］.J Med Virol,2009,81（1）：27-33.

［32］Maasoumy B，Wiegand S B，Jaroszewicz J，et al.Hepatitis B core-related antigen（HBcrAg）levels in the naturalhistory ofhepatitis B virus infection in a large European cohort predominantly infected with genotypes A and D［J］.Clin Microbiol Infect,2015,21（6）：606.

［33］Testoni B，Lebossé F，Scholtes C，et al.Serumhepatitis B core-related antigen（HBcrAg）correlates with covalently closed circular DNA transcriptional activity in chronichepatitis B patients［J］.J Hepatol,2019,70（4）：615-625. srqqi6j8nsEv0vKCUCtRumARy9KdOI/Z+Gz7MR9wP8QU0+I76I2jU0HjM4FxQz1D