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自1979年HBV基因组测序完成后，学者们逐步发现其基因组变异程度较大。近年来发现，慢性乙型肝炎（CHB）重症化的原因、NAs的耐药等事件与HBV的异质性（heterogeneity）和变异（mutation）有很大关系。目前根据HBV感染之后抗体应答性质的差别，将HBV分成不同的血清型（serotype）；根据HBV DNA基因序列的差异程度，将HBV分成不同的基因型（genotype）。这些分型的基础是由HBV病毒株变异程度决定的，本节重点讨论某些特殊变异或群组变异（准种）对CHB重症化的影响。
（一）HBV变异与准种的概念
基因变异是HBV生活史复制的常态，1979年研究者采用分段测序-重叠读码方式首次报告了完整的环状HBV基因组序列，但之后越来越多的HBV DNA基因组或基因片段序列分析发现，不同HBV病毒株DNA序列存在相当多发的基因位点异质性，这些异质性并不影响病毒的整体存活。测定的HBV基因组自然变异率达（1.4~3.2）×10 -5 替换突变/（核苷酸·年），是普通DNA病毒的10倍。学者们在分析原因时发现，HBV较一般的DNA病毒的突变率明显更高，这是由HBV编码的多聚酶缺乏3′—5′校对机制，生活史还包括逆转录过程共同造成的。
HBV变异的形式多样，包括无意义的核苷酸替换突变、错义的替换突变、导致终止编码的替换突变、缺失突变、插入突变等。在自然复制的过程中，产生自发性淘汰，部分致死性突变的病毒株很快就消失，存活下来的HBV更适合在宿主体内生存。从群组角度来看，初始感染患者的病毒株产生一系列微小变异的变异株，这些变异株整体变异率不大，通过抗原微变异方式逃避宿主适应性免疫。在核苷（酸）治疗时代，适合存活的微小变异的病毒株逐步成为新的流行病毒株。以变异为基本机制，以适应宿主为“目的”，HBV以群组变异适应宿主的方式保持病毒存活可能性的最大化（图3-1），在这个过程中可能形成一些疾病特异性变异，如HBeAg阴性CHB相关的G1896A变异。总之，变异和适应性选择是HBV的重要生活模式。
图3-1 HBV变异及准种示意图
准种的概念是从噬菌体研究开始出现的，如人免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）在患者体内所具有的准种群。1993年以来，对HBV基因变异的研究，得出了类似的结论，HBV的准种就是指由病毒基因组在遗传学上高度相关，但每个克隆/病毒株之间又有微小差别的HBV组成种群的现象，即来源于同一个患者的不同HBV基因克隆彼此之间存在微小的差异，差异度为0.5%~3%。准种的概念强调的是遗传学的同源异质性，即病毒同时在自身和外界因素的影响下复制时既保持高度同源性也具有基因多样性。准种概念并不是对HBV存在状态的一种简单的描述，它使学者重新认识了HBV的存在状态和存在方式。准种概念强调的是同一患者血清中不同HBV病毒株之间的遗传相似性、微小差异性、病毒群组状态和动态变化四个要素，尤其强调了HBV存在状态的动态变化。准种/变异的缘由为患者宿主免疫压力的变化，但近年来随着核苷（酸）类似物（NAs）被广泛应用于临床抗HBV治疗，HBV除了出现自然进化过程中的累积变异外也出现了许多医源因素导致的变异，NAs可能具有准种群筛检的效果。
总之，HBV变异是病毒存活的重要形式，通过这种模式逃避对HBV有害的压力。通过变异可能产生了某些疾病状态下特殊的变异形式，下文主要讨论HBV变异和准种对乙型肝炎重症化的影响。
（二）HBV 变异/准种的检测方法
随着近年来技术的发展，高通量准种群变化的检测方式有了长足进步，虽然深度测序方法尚无法广泛应用，但以研究单位为依托的检测使得临床医师对病毒变异及其准种群的变化有了较为可靠的理解。
1.PCR扩增-克隆-DNA测序法
该方法首先应用PCR技术对靶片段进行体外扩增，克隆入载体后对单个阳性克隆进行DNA测序，之后将测序的结果通过软件进行生物信息学比较，以确定各克隆序列的异质性，同时评价目的基因不同病毒株的准种比例。由于该方法挑选的克隆具有随机性，其代表性难以评估，对准种群的反应有限。
2.PCR-单链构象多态性分析法（SSCP）
此法先以PCR法获得靶基因片段的扩增产物，变性后通过中性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）显色，进行单链构象多态性分析，该手段是展示基因多态性的一种经典方法。通过该方法可判断体内准种的复杂程度及区分不同的克隆型，但无法定义野毒株和突变株，只可以展示准种的存在状况。
3.异源双链泳动分析法（HDA）
该方法的原理与SSCP相似，研究以异源双链（也称杂合双链）电泳后的差异性进行群组展示。异源双链是指经过加温退火后突变型和野生型DNA形成的杂合双链DNA分子，它在错配处形成一个凸起，在非变性凝胶电泳时出现与同源双链DNA不同的电泳速度，因而可将野生型和突变型双链DNA分开。HDA对200～300bp大小DNA的突变检测效果较好，且对SSCP不敏感的DNA片段检出率很高，因此二者联合应用可大大提高突变的检出率。HDA操作相对简单、省时，但无法区别野毒株和突变株。
4.构象敏感凝胶电泳法（CSGE）
CSGE通过把SSCP 和HMA两种方法集成在一张PAGE 胶上，兼具二者的优点，同时在聚丙烯酰胺凝胶中加入微变性剂以放大异源双链由碱基错配导致的DNA 双链的空间构象改变，而使有不同错配碱基对的异源双链在PAGE 胶上出现显著不同的迁移率来检测变异。CSGE对200～400bp的DNA 片段中碱基错配的检出具有良好的敏感性和特异性。CSGE能将病毒的优势种群和劣势种群进行初步分类，之后结合DNA测序法展示优势/劣势种群的基因变异特点。该方法是目前较好的一种准种群展示模式。
5.深度测序法
下一代测序技术，又称深度测序法（UDPS），目前被广泛应用于基因异质性检测，是准种群漂变动力学的重要检测方式。UDPS主要分析感兴趣区域的300～400bp长度的DNA片段，这对抗原位点、耐药位点分析具有较强的针对性，可以展示关键感兴趣位点的多种变异类型，但不适合对整个基因或基因组给予综合评估。国内张欣欣研究组以这种方法进行了HBV准种研究，开启了一种新的评估模式。
总之，目前有多种以DNA测序为核心技术的HBV基因变异的研究，这些研究从机制上使得医师对CHB进展、抗病毒药物应用等具有一定的了解。变异强调特定位点的变化，准种强调群族整体的微变异。目前的检测手段存在如下缺点：①能展示变异的技术方法无法展示整个基因的准种情况，要理解变异群组概念，变异云（cloud）概念，在此基础上理解HBV的演化；②深度测序法可展示局部位点多种变异模式，但缺乏对整个基因的分析；③目前检测出的HBV基因变异反映外周血循环池的变化情况，并不完全代表肝内或外周血单个核细胞内HBV储存池的变异主流情况，这导致临床观察情况与病毒变异的真实情况存在一定的脱节；④无论哪种方法，准种研究仅限于实验室，虽然目前有不少较为可靠的特定位点变异的检测方法，但技术及其结果解读具有相当复杂性，不可简单将CHB患者病情变化/剧变与检测结果生硬联系起来。变异与病情的因果关系仍旧是研究的热点，仍旧需要新的手段来研究。
前章已述HBV基因组含有4个开放阅读框（ORF）编码病毒功能/非功能蛋白，除此之外还有多个基因表达调控序列。C区启动子（CP）是临床医师耳熟能详的区域之一，其位置在1643~1849nt，与前C区起始氨基酸编码ATG相重叠。由于HBV基因的兼并性，CP还与直接重复序列（DR Ⅱ和DR Ⅰ）、X基因下游、增强子Ⅱ（Enh Ⅱ）等基因/调控序列重叠。以往研究认为前C/C区突变是导致HBeAg表达不能、病情进展、肝细胞癌（HCC）发生等情况的一种重要突变；随着NAs的应用，逆转录区（RT）变异改变了HBsAg的表达，这些突变也可能导致除耐药以外的病情变化，部分可导致病情进展乃至突变。下文将近年来的一些研究结果进行整理，以理清病毒变异与病情进展的关系。
（一）导致乙型肝炎重症化的前C/C区变异
HBeAg作为HBV 感染的一种负性免疫调节因子，可抑制宿主的免疫反应，通过下调宿主T淋巴细胞的细胞毒活性使得HBV感染者处于对HBV免疫耐受的状态。而HBeAg 阴性变异株感染者，一方面失去了HBeAg 的免疫调节作用，另一方面前C区变异改变了HBcAg 在肝细胞内的分布，使胞核型转化为胞质型，诱导了特异性T淋巴细胞的免疫攻击，从而可能导致急性肝衰竭的发生。目前研究认为，导致HBeAg不能表达的原因主要有如下两种病毒变异假说：①前C区G1896A突变导致前C区在第28位氨基酸残基处发生终止突变，HBeAg表达被终止；②C区启动子区（CP区）替换变异，最常见的变异是CP区内A1762T和G1764A的单/双替换突变。目前调查认为30%以上的CHB患者为HBeAg阴性CHB，表现为ALT反复波动或持续异常，对α干扰素治疗的反应差，病情呈持续发展，易进展成为肝硬化和（或）原发性肝癌。
最早被关注的肝炎重症化相关的HBV变异位点是前C区G1896A导致的终止变异。1994年，研究者收集了40例美国各地的HBV感染导致的散发性暴发性肝炎（fulminanthepatitis，FH）和16例急性自限性乙型肝炎（HB）患者的血清，检测变异位点G1896A。研究者借助当时新出现的PCR技术结合半定量杂交技术对病毒变异在FH中的分布做了一个横断面研究，并以急性自限性HB为对照。研究发现大部分患者体内病毒是一种混合群，即变异株和非变异株共存情况，这个符合准种理论。1995年有研究发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性母亲所生育的婴儿似乎在出生后3~4个月内更容易发生暴发性肝炎。研究者收集了9例因HBV垂直传播而发生暴发性肝炎的患儿样本，其中1名患儿母亲HBeAg阳性，7名患儿母亲HBeAg阴性/抗-HBe阳性，研究者通过PCR-DNA直接测序法分析DNA序列的变异。结果提示，所有母亲均可检出含有G1896A位点变异的病毒株，在存活的患儿体内只检出野毒株，即未发生G1896A变异的病毒株。他们的研究认为母亲可能携带野毒株，也同时携带G1896A变异株，在垂直传播过程中产生某种筛检反应，而这个过程可能是诱导乙型肝炎重症化的机制之一。
日本学者报道前C区G1896A变异能在88%~100%的急性肝衰竭患者中检测到，以色列报道为83%，中国台湾地区报道为36%，法国报道为10%，美国报道仅为5%。G1896A变异差异可能与基因型的分布有关，美国是以基因型A HBV为优势流行株，而亚洲国家是以基因型B和C HBV为优势流行株。基因型A的基因结构限制了G1896A变异的形成，基因型B和C没有这种限制，因此，有更高的前C区G1896A变异率。有研究报道，在美国仅有7%的急性肝衰竭患者感染的G1896A变异株HBV为优势株，而53%的急性肝衰竭患者为前C区终止变异株和野毒株混合感染，符合HBV准种理论。日本学者应用敏感而简单的突变点特异性分析（MSSA）方法评估了10例暴发性肝炎、15例急性自限性肝炎和4例急性重型肝炎患者，结果提示G1896A变异可在所有暴发性肝炎患者体内检出，可在11例急性自限性肝炎和3例急性重型肝炎患者体内检出，研究认为G1896A变异在暴发性肝炎中可有较高的检出率，但这种关系并非特异性的。
也有研究认为G1896A变异与病情无关，有研究曾分析18例肝衰竭和亚急性肝衰竭患者，发现前C 区G1896A变异检出率与急性肝炎患者相似。因为目前关于病毒基因变异与病情关系的研究缺少动物模型的验证，现在大部分结果属于相关性结果，而非因果关系结果。
（二）导致乙型肝炎重症化的C区启动子区变异
CP可分为两个部分，即上游调节区（URR）和基本核心启动子（BCP）；BCP长108 bp，含前C和前基因组RNA转录起始点。HBV中并无经典的TATA盒（TATAAA），但BCP内含有4个TATA样盒（TATA-like box），分别为TA1（AGATTA）、TA2（TTAAA）、TA3（TATTA）、TA4（CATAATT）。BCP内有T1753A/C、T1754C/G、A1762T、G1764A、C1766T 和T1768A等，其中以A1762T/G1764A 联合双替换突变较常见。Okamoto等于1994年最早发现并报道A1762T和G1764A双替换突变在日本HBV感染患者中是一种主要变异模式。A1762T和G1764A的单/双替换突变位于BCP区，该位点的突变既影响下游病毒蛋白（HBeAg/HBcAg）的表达，更影响HBV基因组的复制。日本学者报道，BCP区A1762T和G1764A双替换突变在急性肝衰竭患者中检出率为68%~72%，德国学者报道检出率为30%~78%，美国为10%。Wai等对美国急性暴发性肝炎组34例患者进行队列研究，调查患者感染的HBV分子生物学特征，包括HBV基因型G1896A突变、A1762T和G1764A双替换突变；检测发现44%患者检出G1896A突变合并A1762T和G1764A双替换突变。日本40例暴发性肝炎和261例急性自限性乙型肝炎患者的分析表明，自限性乙型肝炎患者G1896A与A1762T和G1764A双替换突变的检出率分别为9%和17%，肝衰竭患者分别是53%和50%（p<0.001）。
体外实验结果显示，G1896A突变株和BCP区A1762T和G1764A双替换突变病毒株较野毒株的复制活性增高，这两种突变株可能加强HBV前基因组mRNA的生成，同时增加病毒包装。A1762T和G1764A双替换突变使HBeAg的表达减少，进一步弱化了宿主的免疫应答，提高了HBV的生存率。有研究试图揭示A1762T和G1764A双替换突变病毒株的复制率，研究者收集了7例暴发性肝炎患者和1例肝移植后暴发性复发性肝炎样本，提取病毒并转染人肝细胞系。结果证实G1896A突变病毒株的复制率低于野毒株，A1762T和G1764A双替换突变病毒株复制率略低于野毒株。但另有研究者将诱导出A1762T和G1764A双替换突变的HBV基因组转染人肝细胞系，结果发现BCP突变株不能与肝脏内转录因子结合，导致HBeAg表达量下降，但会导致病毒复制增加。关于突变病毒株在细胞内的复制问题尚待进一步研究。
实际临床工作中经常发现HBV BCP区突变是与前C区突变同时存在的。日本学者收集了57例HBeAg阴性/抗-HBe阳性样本，对BCP区和前C区进行了克隆化和测序，97.9%（328/335）的克隆可检出BCP区、前C区，或BCP区/前C区双突变，其中5例仅有BCP区突变，20例仅有G1896A突变，32例患者为BCP区/前C区双突变。Hayashi等对越南中部的3例暴发性肝炎患者进行序列分析，其中2例同时有A1762T和G1764A双替换突变和G1896A突变。
除上述热点突变外，有研究认为多位点突变的影响高于单纯的双联突变。例如，在A1762T和G1764A双替换突变时，病毒复制力是HBV野毒株的2倍，HBeAg 表达能力为野毒株的80%，而BCP区1753/1762/1764位三联突变病毒复制力是HBV野毒株的4倍，HBeAg的表达能力是HBV野毒株的70%，而BCP区1753/1762/1764/1766位四联突变则达到了8倍和20%。然而，也有研究认为BCP区突变与肝衰竭的发生关系并不密切。
上述研究在证据层面具有较多的不确定性，如患者的诊断、病期、采样时间等。因此，Hu等收集了符合研究标准的31个病例-对照研究进行了Meta分析，病例组为1995例HBV诱导的慢加急性肝衰竭（ACLF）患者，对照组为3822例CHB患者。研究发现HBeAg阴性ACLF发生率是阳性的2.813倍（OR = 2.813，95%CI为2.240~3.533，p<0.001）。在此基础上与ACLF相关的变异位点分别为T1753V（OR=1.889，95%CI为1.357~2.631）、A1762T（OR=2.696，95%CI为2.265~3.207）、G1764A（OR=3.005，95%CI为2.077~4.347）、A1762T/G1764A（OR=2.379，95%CI为1.519~3.727）、C1766T（OR=1.849，95%CI为1.403~2.437）、T1768A（OR=2.440，95%CI为1.405~3.494）、A1846T（OR=3.163，95%CI为2.157~4.639）、G1896A（OR=2.181，95%CI为1.800~2.642）、G1899A（OR=3.569，95%CI为2.906~4.385）和G1896A/A1762T/G1764A三联突变（OR=1.575，95% CI为1.172~2.116）。Nian等的另一个Meta分析认为T1753V、A1762T/G1764A、A1846T、G1896A和G1899A与ACLF密切相关。总之，前C区变异与CHB患者的病情巨变可能有较为密切的关系，但这些尚不足以达成因果关系，只是CHB发病过程中病毒部分的一些特征。
（三）导致乙型肝炎重症化的C基因变异
C基因位于HBV基因组1901~2450nt，翻译合成HBcAg（含183位氨基酸），小部分被包装成核心颗粒，内部含有T淋巴细胞和B淋巴细胞识别的表位。由于与HBcAg在T淋巴细胞水平上有相同的表位，HBeAg的存在可以缓解CTL对细胞膜上HBcAg的攻击，是产生HBV感染免疫耐受的机制之一。
HBV C基因突变相对集中于48~60位氨基酸、84~101位氨基酸、147~155位氨基酸和172位氨基酸，T淋巴细胞和B淋巴细胞表位突变较常见，这种突变与病毒在机体内长期存在及肝病进展有密切的关系。有研究发现从肝衰竭患者体内分离的病毒株存在A2339G和G2345A突变，日本研究者认为A2339G突变可提高病毒复制效率，他们自1例暴发性肝炎患者中克隆出含有上述A2339G/G2345A突变的病毒基因组，为基因型B，同时伴有G1896A突变。研究组将1.24倍长度的含A2339G突变的HBV基因组转染入Huh-7细胞系中，结果提示突变株可使HBcAg积累量增加，证明这种突变提高了病毒的生产效率。但也有研究发现基因型D A2339G变异在暴发性肝炎中扮演的角色并不重要，这提示病毒变异具有一定的基因型特异性。
（四）导致乙型肝炎重症化的S区变异
HBV的S区包含编码区和启动子区，编码区又分为前S1区、前S2区和S区，也可能存在一个前前S编码区。这个区域变异可因疫苗诱导、再激活、NAs治疗等因素造成。
前S2区编码多肽不含有体液免疫所需的保护性抗原位点，但其30~55位氨基酸为T淋巴细胞识别位点，44~53位氨基酸是CTL识别位点，是重要的免疫反应区域。此外，前S2区起始密码子（ATG）可发生替换突变导致中蛋白不能表达，前S2区也可能发生缺失突变导致T淋巴细胞、B淋巴细胞识别表位丧失，或使得大蛋白、中蛋白和主蛋白比例失调，大蛋白在肝细胞内过度产生并积聚，从而导致严重的肝细胞坏死，这可能是引起肝衰竭的机制之一。
Pollicino等报道1名外科医师感染HBV后15天出现肝衰竭，随后其母亲也感染HBV出现肝衰竭。通过对这2例患者体内的HBV基因组进行序列分析发现：前S2区的起始密码子出现2处点突变，使密码子由ATG变为ACA，从而使中蛋白不能表达。进一步对另外5例肝衰竭患者进行序列分析发现，有3例也存在前S2区起始密码子的变异：其中2例出现1处变异，即ATG突变为ATA；另1例出现2处变异，ATG变为ACA。而13例作为对照的急性肝炎患者，均无前S2区起始密码子变异，这一研究提示前S2区起始密码子变异在急性肝衰竭的发病中可能起重要作用。国内学者Wu等对慢性肝衰竭、CHB患者和无症状HBV携带者的前S2基因进行了序列分析，结果表明该区域内基因替换突变的检出率分别是60.0%（15/25）、16.7%（5/30）和12.0%（3/25），肝衰竭患者与其他患者相比有更高的变异率。除替换突变外，前S2区内部的替换突变也可能引发CHB重症化。中国台湾地区学者Chen等收集了46例HBV慢性携带者、38例CHB患者、18例乙型肝炎相关肝硬化（也可称为HBV相关肝硬化）患者和50例乙型肝炎相关肝癌（也可称为HBV相关HCC）患者，检测前S区缺失突变情况，结果发现进展期肝病患者体内HBV病毒株表现出较高的前S区缺失突变发生率，缺失部分多位于前S1区3′端和前S2区5′端，提示病情进展可能与T淋巴细胞或B淋巴细胞表位缺失有关。
HBV主蛋白根据其基因组编码序列进行3级结构分析，推断存在4个跨膜序列（TMD），分别如下：TMD-Ⅰ，4~24位氨基酸；TMD-Ⅱ，80~100位氨基酸；TMD-Ⅲ，173~193位氨基酸；TMD-Ⅳ，202~222位氨基酸。其间有2个胞质环（CYL）：CYL-Ⅰ，24~80位氨基酸；CYL-Ⅱ，194~201位氨基酸。CYL位于内质网（ER）的内侧。CYL-Ⅰ可与HBcAg相结合，尤其是29~59位氨基酸区，是病毒粒子组装的重要接点。主要亲水区（MHR）位于99~169位氨基酸，内含一系列构象型抗原决定簇，又被进一步细分如下：MHR 1，99~119位氨基酸；MHR 2，120~123位氨基酸；MHR 3，124~137位氨基酸；MHR 4，138~147位氨基酸；MHR 5，148~169位氨基酸。抗原决定簇由独特的抗原环（antigenic loop，AGL）构成，AGL位于101~172位氨基酸，涵盖了MHR，其序列中的半胱氨酸残基对抗原结构具有重要意义，同时也是影响病毒感染性的重要因子。AGL是病毒黏附、侵入肝细胞及肝细胞内病毒解体的重要功能部位，AGL的构象不仅决定HBsAg的抗原性，也决定了HBV的感染力，因此AGL在HBV各个基因型之间非常保守。目前发现较多的HBsAg变异发生在124~147位氨基酸区域，例如，G145R变异，导致了HBsAg的抗原性和免疫原性发生改变。
HBsAg的α决定簇的某些变异与肝炎重症化相关。Carman等曾报道1例印度尼西亚患者治疗淋巴瘤时出现HBsAg阴性但HBV DNA阳性的重型肝炎，经过测序发现存在G145R变异，同时伴有122~123位氨基酸两个氨基酸残基的插入突变。Kalinina等从1例肝移植后发生暴发性肝炎的患者体内分离出HBV变异株，经测序发现S蛋白有包括G145A在内的多个氨基酸替换突变，此外还包括位于第一亲水区的T45K、L49I突变和第二亲水区的M125T、T127P及G145R突变，以及羧基端S204R和L205V突变。为了解这些突变的意义，将该变异株转染到人肝细胞系，结果表明该变异株具有较强的复制能力，但却有严重的分泌缺陷，其囊膜蛋白滞留在转染细胞的内质网中而不是在细胞质内。HBsAg分泌障碍，可能与肝衰竭的发生有关。Anastasiou等研究认为急性肝衰竭（ALF）可能与HBsAg的L216*终止突变有关。该研究组另一篇文章提出ALF与前S2区内的缺失突变（16~22位氨基酸和20~22位氨基酸）有关，且L49R在ALF患者中检出率较高。Chen对S区变异的总结认为变异导致非正常病毒蛋白在宿主肝细胞内质网内堆积，进而诱发疾病进展。
总之，由于HBsAg是HBV中和抗原编码位点区域，该区域的替换突变、缺失突变可造成以下后果：①隐匿性感染，病情持续进展；②HBsAg阴性/抗-HBc阳性患者在免疫力低下时的再激活；③CHB患者发生ACLF。目前仍未将坚实的实验室证据与突变和病情剧变联系在一起，有假说认为变异是病情发生变化的一个背景因素，需要进一步研究在多因素多步骤事件中病毒变异导致的病毒-宿主免疫系统相互作用方式。
（五）导致乙型肝炎重症化的X 区变异
X区位于C区上游，不同亚型的HBV X基因的大小可有差异，其编码含145~154个氨基酸的蛋白质HBxAg，该蛋白质具有反式激活作用。曾有研究认为可能存在一个前X区，但未得到广泛认同。X基因区与BCP、核心上游调节序列（CURS）、负性调节元件（NRE）和增强子Ⅱ（Enh Ⅱ）等重要调节基因区域重叠，因此该区域是HBV 复制和表达的关键区域。
Kaneko等通过比较重型肝炎患者和急性肝炎患者的HBV X基因序列，发现存在C1655T、A1764T 和G1766A 突变，这些突变可能会改变X蛋白的功能。Cho等于2011年报道了X基因变异与HBV感染者病情状态的关系，他们收集了194例基因型C HBV感染者的样本，这些样本来自60例CHB患者、65例HBV相关肝硬化患者、69例HBV相关肝癌患者，将X基因均予以DNA测序。DNA测序发现G1386M、C1485T、C1653T、T1753V、A1762T和G1764A变异可能与患者病情的严重程度有关，G1386M、C1653T和A1762T/G1764A双突变在肝硬化和肝癌患者中的发生率明显高于CHB患者（p<0.005）。研究认为这些突变可能影响HBx、HBcAg/HBeAg的表达，从而影响宿主的免疫反应，进而影响了患者的预后。但这些突变是否与CHB重症化有关尚待进一步研究。
（六）可导致乙型肝炎重症化的多聚酶基因变异
HBV基因组中编码多聚酶的P基因最长，占基因组的2/3，与其他3个基因重叠或部分重叠，其他基因的变异可导致P基因发生突变，反之亦然。导致HBV感染重症化的研究大致来自两个方面，一个是以NA筛检的rtYMDD位点变异，另一个是上文提到的HBsAg的G145R变异导致的rtR/W143Q变异，这两种变异均有导致病情重症化的报道。
拉米夫定（LAM）应用过程中可导致多聚酶逆转录区YMDD基序出现变异，该位点是RNA依赖性DNA多聚酶结合位点，发生YVDD/YIDD突变的病毒株可出现肝脏酶学指标的升高，甚至出现病情重症化。Ayres等报道了1例LAM耐药病毒株引起的病毒学突破和炎症复发（flare）。当时他们观察了一个HBeAg阳性的38岁华裔女性，初始联合应用LAM和泛昔洛韦（FCV）治疗，之后应用LAM维持，治疗过程中出现HBV DNA载量下降，但HBeAg未转阴/血清学转换，随着病毒学突破，患者肝功能逐渐恶化，最终因亚急性暴发性肝炎而死亡。研究者们将患者治疗过程中一系列血清样本中的HBV基因组进行DNA测序并分析其结果，发现该患者为基因型B感染，治疗前存在的HBV准种群在BCP区、X基因、C基因、S基因和P基因有多种突变模式，与病情变化有关的变异有多聚酶区的rtL180M、rtM204V、rtA222T和rtL336V，HBcAg的cP5T、cS26A、cV85I和cP135A，HBsAg的sI195M和sM213I，以及HBx的xK95Q、xN118T、xK130M和xV131I。一份来自日本的病例报告中，1例应用LAM治疗9个月发生病毒突变进而演变为致死性肝衰竭的患者体内可检出rtM204I/V和rtL80I/V突变株；另有报道显示，1例HBV DNA水平显著升高的暴发性肝衰竭患者具有rtL180M、rtL80I及rtM204I的三重变异毒株。耐药变异导致乙型肝炎重症化的研究多为病例报道，未见大规模的多中心临床数据，而在临床工作中，应用LAM等NAs患者出现rtM204I/V突变株并不少见，出现病毒耐药性变异后发生CHB重症化的病例毕竟为少数，难以将变异与重症化之间划为因果关系。
由于S基因与P基因重叠，前文提到的HBsAg的α决定簇sG145R变异可导致多聚酶区rtR/W143Q替换突变，该区域位于RNA依赖性DNA多聚酶的B区。由于HBV疫苗和高效价HBV免疫球蛋白（HBIG）的应用，sG145R变异的报道逐步增加，Bock等曾报道1例患者出现sP120T和sG145R双突变病毒株，其复制能力未受到影响。目前尚缺少sG145R/rtR/W143Q变异在CHB重症化中意义的报道。
病毒的变异/演化可能具有2个目的：①使得病毒的复制效率适应宿主内部环境；②修饰中和抗原或CTL识别表位以避免宿主免疫系统的攻击。目前资料多收集重症化患者血清中的HBV进行分析，以当时的检出率来解释病情的变化，这种研究方法筛查出的病毒变异是重症化的结果还是原因值得商榷。HBV感染的重症化除了病毒本身的原因外，宿主的免疫压力也是重要的影响因素，就rtM204I/V或前C区G1896A变异而言，流行病学调查提示这样的病毒变异并不少见，但绝大部分患者未出现病情的急剧进展，因而仍需要分析宿主因素对病毒变异的影响，如人白细胞抗原（HLA）表型等因素，不可以刻板地将病毒变异与HBV感染重症化等同起来。此外，由于一直缺乏有效的HBV感染动物模型，上述变异或准种所导致的HBV感染重症化缺少了重要的检验步骤，这是重症化研究方面的硬伤。
由于CHB患者重症化的机制研究并无定论，上文提到某些研究认为特异性变异可能与之相关，如HBV BCP区A1762T和G1764A双重突变、前C 区G1896A突变等。近年来有部分资料指出HBV异质性，即HBV准种漂变（shift）可能是诱发CHB重症化的原因之一。
1993年，Bonino等首次提出HBV异质性可能影响到CHB的严重程度，认为HBV感染后病情的严重性更多取决于宿主免疫系统抗病毒反应的强烈与否，反应轻微而持续者即为无症状携带者或CHB患者，反应激烈者为重型肝炎患者。HBV准种群的数量与临床表现密切相关，严重慢性HBV 感染患者具有的准种群数量显著多于无症状感染者，其原因可能为临床表现严重的患者HBV 基因变异程度较多，使得准种数量相应增多，导致病毒结构及抗原成分更趋复杂，从而更严重地干扰患者的免疫系统，使病情加重。因而研究提出CHB患者临床表现重症化可能与其所携带的HBV变异程度更高和准种数量更多有关。
Cacciola等于2002年报道了关于患暴发性肝炎新生儿与其携带者母亲体内HBV基因组的异质性。研究者收集了9例患儿，明确其为母体垂直传播。其中2例为HBeAg阳性母亲所生，均发展为CHB；7例患儿来自6位HBeAg阴性/抗-HBe阳性母亲，这7例患儿均表现出急性肝炎过程，4例有暴发性肝炎临床表现，3例为自限性表现。研究组将患儿及其母亲体内的HBV基因组克隆后测序比对，结果发现HBeAg阳性母亲体内的HBV无特殊的突变存在。发生暴发性肝炎的2例患儿可检测出HBV C区启动子A1762T和G1764A双替换突变，而其中1例患儿的母亲体内并未检测出这种突变。研究认为导致肝炎重症化的原因并不能以热点变异来解释，更应该以HBV异质性来解释。刘映霞等于2002年选择HBV DNA阳性患者共112例，其中慢性重型肝炎（FHF）60例（有肝硬化背景者38例），CHB患者30例，病毒携带（ASC）者22例，采用SSCP结合DNA序列分析方法检测HBV S区准种。他们的研究发现不同病期SSCP条带数不同，准种复杂性随疾病进展而增加（p<0.01）；HBeAg阳性患者体内HBV的SSCP条带数少于HBeAg阴性患者（p<0.01）；当2例FHF患者病情好转时，其SSCP条带数明显减少；另1例ASC者随访1年，其SSCP仅为1条，维持原位置不变。通过针对不同病期患者HBV S区准种群的分析，研究者认为准种可能随着疾病病情加重而复杂性增加。另有学者利用溶解曲线方法分析了32例ASC者和28例严重肝病患者血清中的HBV准种，结果提示CHB患者中准种数量要比ASC者更多。
个案分析是准种与疾病相关关系的重要尝试方式。Mathet等从1例进展到肝硬化的抗-HBs阳性男性患者体内检测到HBV基因型为F型，SSCP示体内存在准种群。进一步的DNA测序显示S基因的α决定簇部分出现变异，同时也检出非α决定簇的变异。研究者认为，HBV基因准种的复杂性和某些特殊位点变异是病情进展的原因。国内学者刘霖等也在1例CHB重症化患者体内进行了血清HBV准种的动力学变化研究，其纵向收集患者初次发病时、好转时、发生重型肝炎时、重型肝炎好转后等多个时间点的血清，采用PCR扩增—T载体克隆—CSGE变异检测—核酸序列分析的实验流程分析BCP区和前C/C基因。研究组从每份样本的克隆产物中随机选出33个克隆进行CSGE检测，根据CSGE筛选出的不同克隆进行序列分析，展示了该CHB患者血清HBV准种群随肝病活动的动态变化。CSGE展示了患者血清HBV BCP区及前C/C基因存在准种群，且准种群随宿主肝病活动情况不同发生了动态变化。慢性肝炎急性发作及重型肝炎发病时准种复杂性降低，而肝病好转时准种表现为复杂性及异质性增高，这与Mathet等的研究正好相反。通过动态观察，刘霖等观察到准种的优势株群和弱势株群可表现为相互消长的现象，原有优势株即便被新的优势株取代后其并没有消失，而是以弱势株的形式继续存在，动力学研究显示，其优势株序列的同源性随病情的演变发生了改变。
2011年国内学者对血清HBV全长基因组的准种特性与CHB重症化的关系进行了探讨，研究者分别选择未接受过抗病毒治疗的CHB、慢性乙型重型肝炎（CSHB）各4例患者，PCR扩增血清中HBV全长基因组，经克隆、测序之后进行序列比对。研究发现CHB组和CSHB组均有G1896A突变、A1762T/G1764A双替换突变、T1753 C/G突变及前S2区、前S1区起始密码子缺失突变，CSHB组发生一个或多个突变的克隆数占100.0%（60/60），明显多于CHB组的76.7%（46/60）（p<0.01）。CSHB组的全长基因组、S基因、X基因、P基因和逆转录酶编码序列区的准种复杂度和平均遗传距离均比CHB组大。研究认为CHB重症化患者血清中HBV的各种突变率及准种异质性差异均大于未发生重症化的CHB患者，但由于该研究是极小样本的成组分析研究，这样的结果可靠度尚需要进一步确认。2015年张欣欣课题组收集了10例AHB、9例IT期HBV携带者，11例CHB患者，10例ACLF患者，以克隆-测序法探寻准种情况，引进突变频率指数（mutation frequency index，MFI）来展示变异程度。研究表明，ACLF患者较CHB和IT患者有更高的异质性，AHB患者的异质性相对最低。ACLF患者中基因型C较基因型B有更多的A1762T/G1764A/G1896A三联突变；C区和前S区缺失突变也较常见。Yamani等利用深度测序法报告了印度尼西亚CHB患者HBsAg内部主要亲水区（MHR）的准种情况，30例患者中11例为CHB患者，19例为病情进展期患者。结果显示，病情进展期组MHR区的变异度明显高于CHB组，而仅在进展期患者体内检测出以下位点变异：P120Q/T、T123A、P127T、Q129H/R、M133L/T和G145R。Gencay等进一步证明59.3%的1153例CHB患者在MHR区表现出多种变异模式，也证明S基因的准种差异可能具有临床意义，但仍需要进一步研究。
对循环池的HBV准种研究已经得到学界的认可，但由于采取技术难度和代表性的原因，很少能获得肝内样本来评估肝内存在的HBV池情况。Rybicka等针对HBV cccDNA和松弛环状DNA（rcDNA）这2种基因组模式进行变异性分析，研究组收集了67例CHB患者的血清和肝组织标本抽提DNA进行测序分析：首先证明了cccDNA和rcDNA之间存在区别，虽然没有将这种现象与病情简单关联起来，但证明了我们推断的循环池和储存池的区别；其次他们报道了肝脏rcDNA与外周血中HBV DNA的BCP/PC区和P区之间的差异分别高达39%和16%。这个研究提出了一个实质问题：cccDNA是否为变异储存库？若如此，如何纠正这个问题？
总之，目前有限资料表明CHB患者的重症化可能与HBV变异和准种的复杂度有关，但是由于上述研究手段不一致，研究方法的可信度尚有争议。未来需要：①标化研究手段，最好是商业化检测手段；②规范HBV准种的表达模式，探索模式与病情相关性；③系统性纵向变异、准种研究，突破横断面研究的局限性。
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