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如本章第一节 概述所讲，乙型肝炎重症化研究的主要方向在于乙型肝炎重症化过程中HBV的病毒生物学特性的改变、HBV与宿主免疫系统互相作用的动态改变、患者的遗传学和表观遗传学特点，以及患者的肠道微生态特性。因为本书有专门章节介绍患者的遗传学、表观遗传学检测和肠道微生态特性，本节主要介绍乙型肝炎、乙型肝炎重症化实验研究中常用的技术和方法，包括HBV的检测技术、HBV与细胞相互作用的研究方法和技术、免疫细胞的增殖和杀伤功能的检测，简略介绍乙型肝炎重症化肠道微生态学研究的常用技术。
20世纪50年代，由于电子显微镜的应用，乙型肝炎相关研究从细胞水平进入亚细胞水平。20世纪60—70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将形态观察由亚细胞结构水平推进到蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性蛋白质分子得以进行细胞或亚细胞水平的检测。20世纪70年代，随着荧光原位杂交技术（fluorescence in situhybridization，FISH）的应用，组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被定位，形态观察由蛋白质水平又提高到基因水平。20世纪80年代，分子生物学领域中的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行检测。
HBV的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要意义。HBV病原学的检测技术主要有显微镜技术、免疫学技术和分子生物学技术。
1.显微镜技术
1）电子显微镜技术
电子显微术（electron microscopy，EM）：从乙型肝炎患者血清或者肝组织获得的病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒。可见三种不同形态的颗粒：①大球形颗粒，亦称Dane颗粒，即完整的乙型肝炎病毒，其直径为42nm，分外壳和核心两个部分。外壳厚7～8nm，有乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。核心直径27nm，含有部分双链或部分单链的环状DNA、DNA聚合酶、HBcAg和HBeAg。大球形颗粒即病毒颗粒，有实心与空心两种，空心颗粒缺乏核酸。②管形颗粒，直径22nm，长100～700nm。③小球形颗粒，直径也是22nm，数量最多。小球形颗粒及管形颗粒均为过剩的病毒外壳，含表面抗原。电子显微术的优点是标本用量小，观察比较直观，但制样需时较久，观察灵敏度较低。
免疫电镜技术（immune electron microscopy，IEM）：在电子显微术基础上，将免疫化学技术与电镜技术相结合，形成了免疫电镜技术，其是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即在抗原与抗体发生凝集反应后，再经负染直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术，该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标记物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜技术的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入亚细胞水平。免疫电镜技术的敏感性较电子显微术高，可增加HBV的检出率，但该方法的样本制备过程较复杂。
2）激光扫描共聚焦显微镜技术
激光扫描共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技产品，它在荧光显微镜基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%～40%，使用紫外光或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察如Ca 2+ 、pH、膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子生物学、药理学、遗传学等领域中强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，能够进行活体细胞中离子和pH变化研究（RATIO）、神经递质研究、FISH研究、细胞骨架研究、基因定位研究、原位实时PCR产物分析、荧光漂白恢复研究（FRAP）、胞间通讯研究、蛋白质间研究、膜电位与膜流动性研究等，完成图像分析和三维重建等。
2.免疫学技术
免疫学检测方法主要检测HBV感染过程中产生的抗原或抗体免疫标志物。免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原-抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如多肽、酶、病原体以及受体等）。常规血清学检查的HBV免疫标志物为HBsAg、HBsAb（抗-HBs）、HBeAg、HBeAb（抗-HBe）、HBcAb（抗-HBc）。免疫学检测方法主要有酶免疫测定法、免疫荧光技术、化学发光免疫分析法、放射免疫分析法、免疫印迹法、免疫金标记技术等。
1）酶免疫测定法
酶免疫测定法（enzyme immunoassay，EIA）是检测HBV抗原和相应抗体最常用的检测技术，其简便、价廉，其中酶联免疫吸附试验（ELISA）在目前应用最为广泛。此方法特异性高，有效测定范围可达20～500ng/mL，且酶标试剂稳定性好、无放射性危害。根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上。用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。但ELISA易受外界环境和酶纯度的影响。在乙型肝炎重症化的实验研究中，ELISA主要用于检测患者血清中细胞因子的水平。
微粒子酶免疫法是近年来发展起来的一种新的抗原或抗体检测技术，其原理是以玻璃纤维为载体，微粒子作为抗体或抗原的附着表面，极大地增加了反应面积，从而提高了检测的灵敏度。由于微粒子酶免疫法采用最新的荧光技术，通过测定荧光强度来检测被测物的浓度，极微弱的荧光就能被特别的感光结构感应到，从而大大提高了该方法的检测灵敏度，可达到0.2ng/mL。
2）免疫荧光技术
免疫荧光技术是将荧光素（如异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC））与相应抗体（或抗原）以化学的方法结合，再将荧光标记抗体（或抗原）与标本中相应的抗原（或抗体）结合形成荧光标记的抗原-抗体复合物，用荧光显微镜观察的技术。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原-抗体复合物的存在，根据已知的抗体（或抗原）即可推知另一个未知抗原（或抗体）的存在。此项技术分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。直接免疫荧光法是利用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以鉴定未知抗原的方法。本法具有操作简单、耗时短、特异性高的优点，但也存在缺点，如不能检查抗体，敏感性较差。间接免疫荧光法将荧光素标记在第二抗体上，抗体与相应抗原结合后，荧光素标记的第二抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗原或抗体的存在。间接免疫荧光法可以用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体检测未知抗原。
3）化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于抗原、抗体检测的分析技术。CLIA用化学发光剂直接标记抗原或抗体，常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物（acridinium ester，AE），它是有效的发光标记物，通过启动发光试剂作用而发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析时，化学反应简单、快速、无需催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，检测大分子抗原采用夹心法，非特异性结合少；与大分子的结合不会减少产生的光量，从而增加灵敏度。随着对化学发光免疫分析法的不断改进，现在应用较多的是化学发光微粒免疫检测法，它利用磁微粒作为固相载体，应用电磁场分离，进一步提高分离效果，加快反应周期，使得最大发光信号峰值时间缩短，灵敏度更高。
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），它们有各自的发光底物。HRP标记的CLEIA常用的底物为鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼），或其衍生物如异鲁米诺，是一类重要的发光试剂。ALP标记的CLEIA所用底物为1，2-二氧环乙烷衍生物。在发光系统中加入增强发光剂，如对碘苯酚等，可增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。
电化学免疫检测法在原理上与化学发光免疫分析法基本相同，只是将探针固定在电极上，将化学信号转化成电信号后检测，在进行HBV DNA分析时，通常是将HBV DNA探针通过自组装单分子层或亲和素的方法固定在生物传感器上，补偿DNA与之杂交，并选用适当的指示剂检测杂交反应程度。
4）固相放射免疫分析法
固相放射免疫分析法（solid-phase radio-immunoassay，SPRIA）利用放射性同位素标记已知的抗原或抗体，使其与待测的相应抗体或抗原结合，洗去未结合部分，最后用γ计数器测定放射性强度，从而推算出受检的抗原或抗体含量。SPRIA灵敏度高，检测生物活性物质可达皮克（pg）水平，比ELISA的灵敏度高20倍。但由于同位素稳定性差以及对环境造成污染等原因，SPRIA现已很少用于乙型肝炎标志物的检测。
5）免疫印迹法
免疫印迹法（immunoblotting）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，其先对目标组分进行电泳分离，而后将蛋白质转移到固相支持物（硝酸纤维膜）上，再利用特异抗体作为探针，对靶物质进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测；对新基因的表达产物，可利用融合部分的抗体进行检测。免疫印迹法具有分析容量大、灵敏度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种较常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等，可检测到1～5ng中等大小的靶蛋白。免疫印迹法亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法（Southern blotting）相类似，亦被称为Western blotting。Western blotting可用于检测乙型肝炎重症化过程中蛋白质分子包括信号通路蛋白的动态变化。
6）免疫金标记技术
免疫金标记技术（immunogold labelling techique）主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，显微镜下在金标蛋白结合处可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点。该技术用于定性或半定量的快速免疫检测，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称为免疫金银染色。常用的免疫金标记技术如下。
（1）免疫胶体金显微镜染色法：细胞悬液涂片或组织切片可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染，用于病毒形态的观察和病毒检测。
（2）斑点免疫金渗滤法：应用微孔滤膜作为载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。
（3）胶体金免疫层析法：将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上。当待检样本被加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂并且发生相互反应，再移动至固定抗原或抗体的区域时，待检物与胶体金标记试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已被用于制作诊断试纸条，使用十分方便。
3.分子生物学技术
1）聚合酶链反应
聚合酶链反应（PCR）是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环扩增DNA的技术，所扩增的DNA可作为下一轮扩增反应的模板，重复上述循环过程，经过30～40个周期后，扩增的靶序列（一般能扩增106倍）在琼脂糖凝胶电泳后可观察到特异的扩增条带。PCR技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强的优势，可检测出低至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物的检测。PCR检测HBV DNA的敏感性明显高于传统的血清学方法，且能显示HBV在体内复制的情况，直接反映乙型肝炎患者血液的感染性，有助于明确诊断。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。
2）逆转录PCR
逆转录PCR（RT-PCR）是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，以RNA为模板经逆转录（reverse transcription，RT）反应产生cDNA第一链，再以cDNA为模板进行PCR扩增以检测目的基因表达情况的技术。目前已有多种方法被用来研究相关细胞和组织中基因表达产物，这些方法主要有Northern印迹、RNase保护分析法、FISH、斑点印迹及逆转录与PCR扩增串联的RT-PCR技术等。在这些方法中，RT-PCR技术具有灵敏度高和应用范围广的特点，使研究人员能有效地进行测定转录产物存在与否、评估基因表达水平等方面的工作，并在不需要构建和筛选cDNA文库的前提下，完成对cDNA片段的克隆。利用RT-PCR技术分离目的基因是目前基因操作中最有效的途径，RT-PCR扩增产物经纯化、回收与载体重组克隆，即可实现基因的分离。
3）实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。运用该项技术，我们可以对疑似肝炎病毒感染患者的DNA、RNA样本进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析，前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度，后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外，我们还可以对PCR产物或样本进行定性分析，如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异性扩增，利用特异性探针进行基因型分析及单核苷酸多态性（SNP）检测等。
实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，后者则简便易行。
（1）非探针类：如SYBR Green Ⅰ。SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域中的具有绿色激发波长的染料，游离情况下仅发出微弱荧光，与双链DNA结合后，其荧光信号强度大大增强（图2-1（a））。SYBR Green Ⅰ荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号强度检测出PCR体系存在的双链DNA数量，这一性质使其适用于扩增产物的检测。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green Ⅰ荧光染料，SYBR Green Ⅰ荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入DNA双链中的SYBR Green Ⅰ染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号强度的增加与PCR产物的增加完全同步。
图2-1 实时荧光定量PCR工作原理
（a）SYBR Green Ⅰ工作原理：SYBR Green Ⅰ荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入DNA双链中的SYBR Green Ⅰ荧光染料分子不发射荧光信号。（b）TaqMan荧光探针工作原理：TaqMan荧光探针的荧光基团发射的荧光因与淬灭剂接近而被淬灭，在进行延伸反应时，DNA聚合酶将TaqMan探针5′端荧光基团切去，使之与3′端淬灭基团分离，而产生荧光信号。（c）分子信标工作原理：在分子信标发夹结构中，荧光基团靠近淬灭基团，荧光基团被激发后将能量传递给淬灭剂，不释放光子。分子信标与DNA模板配对时，荧光基团与淬灭剂分开，此时激发荧光基团，荧光基团发出光子。（d）LUX引物工作原理：LUX引物自身配对，形成发夹结构，3′端标记的荧光报告基团荧光淬灭。在有目标片段的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
SYBR Green Ⅰ在核酸的实时检测方面有诸多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对低廉。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔解曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，进而区分非特异性扩增，还可实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green Ⅰ的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green Ⅰ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异性产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green Ⅰ得到的定量结果。
（2）探针类。
①TaqMan探针：一种寡核苷酸探针，与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5′末端，而淬灭剂则在3′末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3′端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，利用热稳定DNA聚合酶5′→3′外切酶活性，将TaqMan探针5′端荧光基团切去，使之与3′端荧光基团分离，荧光淬灭作用消失，在特定波长下检测5′端荧光基团即可表征PCR产物的量（图2-1（b））。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量成正比。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶。
②分子信标（molecular beacon）：一种在靶DNA不存在时形成茎-环结构的双标记寡核苷酸探针。分子信标在复性温度下、模板不存在时形成茎-环结构，环一般为15～30个核苷酸长，与目标序列互补，茎一般为5～7个核苷酸长，相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）。由于淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外光而不是可见光形式释放出来。模板存在时分子信标则与模板配对，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图2-1（c））。
③LUX引物：LUX引物技术是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术，引物3′端用荧光报告基团标记，在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片段的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（图2-1（d））。与TaqMan探针和分子信标相比，LUX引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。LUX引物技术是一种相对较新的技术，其应用还有待实践的检验。
④HBV cccDNA的检测：HBV cccDNA是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的合成模板，是HBV持续感染机体的关键。20世纪90年代，Kock等建立了选择性PCR扩增cccDNA检测技术。Addison等在此技术基础上引入竞争PCR，初步实现了cccDNA的定量检测。21世纪初，香港学者He等建立了选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA的技术，实现了真正的定量检测。此后，Shao等建立了基于嵌合引物和实时荧光PCR的cccDNA检测技术，Wong等建立了cccDNA的侵入分析法。当前cccDNA检测技术面临的主要问题是检测的特异性和敏感性问题。
4）原位PCR
原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。原位PCR技术成功地保持了PCR和原位杂交这两项技术的优势，又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分如引物、DNA聚合酶、核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，在原位进行扩增。扩增的产物分子一般较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在细胞膜内、外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位呈指数级扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检测。
根据在扩增反应中所用的核苷三磷酸原料或引物是否有标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有逆转录原位PCR技术等。
直接法原位PCR技术：使扩增的产物直接携带标记分子，即采用标记的三磷酸腺苷或引物片段，当标本进行PCR扩增时，标记分子就掺入扩增的产物中，显示标记物，就能将特定DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。常用的标记物有放射性同位素35S、生物素和地高辛，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。
5）印迹法
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。
Southern杂交：基本原理是DNA分子经限制性核酸内切酶酶切后，由琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按相对分子质量大小分离，然后将DNA片段变性，并使凝胶中的单链DNA片段转移到尼龙膜、硝酸纤维素膜或其他固相支持物上，此法中DNA片段由液流携带通过虹吸作用由下向上抽吸，从凝胶转移印至滤膜表面。然后与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应，用放射性自显影或酶反应显色来鉴定待测DNA分子。DNA印迹技术主要用于对基因组DNA的定性和定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析等。Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。
Northern杂交：继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含Poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而命名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。
与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将相对分子质量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维素膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影或化学显影，以目标RNA所在位置表示其相对分子质量的大小，而其显影强度则提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Southern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即以各个RNA分子的形式存在，可直接用于电泳，此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern杂交也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。Northern印迹法主要用于组织细胞靶基因表达水平的研究以及对同一组织细胞的不同基因间的表达水平进行比较，或者对不同组织细胞间相同基因的表达水平进行比较。
6）HBV基因变异的检测
（1）DNA测序（DNA sequencing）：对DNA分子一级结构的分析。其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3′→5′的方向移动，dNTP按照碱基互补配对原则，逐个连接在引物的3′-OH末端。然而，如果在DNA合成体系中加入双脱氧核苷三磷酸（2′，3′-ddNTP），后者与dNTP的区别在于脱氧核糖的C3位置缺少—OH，一旦2′，3′-ddNTP掺入DNA链中，由于没有3′-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的引物链在此终止。DNA自动测序技术也采用了这一基本原理，即在反应体系中除了加入正常反应所必需的4种dNTP外，还加入了一定比例的4种荧光染料基团标记的2′，3′-ddNTP，链合成过程中，dNTP和荧光染料基团标记的2′，3′-ddNTP处于一种竞争状态，结果是DNA合成反应的产物是一系列长度不等的具有荧光信号的多核苷酸片段，借助计算机自动数据处理最终得到DNA碱基的排列顺序。
（2）PCR序列特异性引物（sequence specific primer，SSP）分析法：使用能够特异性识别特定等位基因的引物，通过PCR扩增检测序列多态性的方法，也称作等位基因特异性引物PCR法。
（3）限制性片段长度多态性：限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析技术是分子生物学的重要分析方法之一，用于检测DNA序列多态性。PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用的方法，其先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。DNA限制性内切酶具有识别特定的DNA序列并在特定的部位切断DNA双链的功能，DNA分子由于突变（核苷酸的置换、插入或缺失）改变（或形成）了限制性内切酶识别序列，使DNA限制性内切酶不能（或可以）将靶DNA片段切断，电泳检测时，存在相应DNA限制性内切酶识别序列者原DNA片段变成短片段的现象，不存在相应DNA限制性内切酶识别序列者原DNA片段长度不发生变化的现象。
（4）PCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP）：PCR单链构象多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）是一种简单、高效地检测DNA或RNA序列中点突变的技术。检测原理：单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分开。由于实验成本较低，PCR-SSCP是一种目前较为常用的方法。
7）生物芯片
生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的，由微电子学、物理学、化学、计算机科学与生命科学交叉综合的一项高新技术。生物芯片可分为基因芯片、蛋白质芯片和microRNA芯片等几种。芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。
基因芯片技术将大量特定的寡核苷酸（cDNA）片段或基因片段作为探针，有规律地排列、固定于支持物（无机或有机支持物）上，然后与待测的标记样品分子按碱基互补配对原则进行杂交，通过检测探针分子的杂交信号强度获取样品分子的表达数量和序列信息。具体地说，将靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等载体上的生物芯片称为基因芯片。基因芯片的分类较多，根据储存的生物信息类型，基因芯片可分为寡核苷酸芯片和cDNA微阵列。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核苷酸探针杂交进行核苷酸序列测定的方法，在一块基因芯片表面固定序列已知的核苷酸探针，当溶液中带有荧光标记的核苷酸序列与基因芯片上对应位置的核苷酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核苷酸的序列。
蛋白质芯片是将大量蛋白质分子按预先设置的排列顺序固定于一种载体表面形成微阵列的生物芯片，其利用蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。蛋白质芯片反应结果的检测要依据标记的报告分子种类来选择不同的检测设备。荧光标记是信息采集中使用最多也是最成功的报告标记。杂交反应后芯片上的各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过扫描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信号转换成数据，即可以获得相关生物信息。
microRNA芯片：在微RNA（microRNA，miRNA）公共数据库miRBase（http：//www.mirbase.org）中已经有5万多条成熟体miRNA。要了解miRNA在基因调控中扮演的角色，关键要迅速地检测miRNA基因的表达。因此，miRNA表达水平的检测也成了科学家们研究的热点。microRNA芯片技术是一种较快地研究miRNA表达的方法。
生物芯片技术的建立以已知资料数据库为基础，而在许多新领域，特别是数据库尚不完备的领域则明显力不从心。其荧光定量的特性导致部分种类的芯片实验结果假阳性率或假阴性率偏高，仍需辅助实验对实验结果进行确认。同时，如何从芯片中数以万计的数据结果中得出科学、合理的实验结论是摆在统计学、软件开发、生物学等多学科研究工作者面前一道尚未完全解决的难题。
8）RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA（dsRNA）导入细胞，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）范畴。RNAi现象广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物、真菌、无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，RNAi现象的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，由于其可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具。
小RNA是19～28nt的调控RNA分子，主要包括miRNA和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）两类。miRNA是长片段RNA序列的一部分，同siRNA一样是比较短小的单链RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由具有发夹结构的70～90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链），但是和siRNA密切相关，它通过与其目标mRNA分子的3′端非编码区域（3′-untranslated region，3′-UTR）互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。
RNAi技术是一种高效的、特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。其通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源性基因的表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。RNAi技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划（蛋白组学）的发展，还有可能设计出RNAi芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况并明确基因的功能，它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用RNAi技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。
要想知道HBV感染机体后如何发挥作用，需要对HBV基因组中包含的基因功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的相互作用密不可分，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息转导等重要的生物过程均涉及蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。
1.电泳迁移率变动分析
电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），又称为凝胶阻滞分析（gel mobility shift assay）、凝胶移位结合分析（gel shift binding assay）、探针阻滞分析（probe retardation assay），是利用凝胶进行的电泳迁移率变动分析。不同大小的分子在凝胶中电泳移动的速度不同，当某种分子与另一种分子特异性结合后，它在非变性凝胶电泳带中的位置就发生了变化，由此可以分析不同分子间的相互作用。如待检测DNA样品与核蛋白提取物孵育后进行电泳，如果核蛋白提取物中存在能与DNA特异性结合的蛋白质，由于大分子复合体的形成，电泳时就会出现迁移率降低、区带滞后的现象。
2.染色质免疫沉淀
染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。该方法能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法，是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。ChIP不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛应用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
EMSA是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。
3.免疫共沉淀
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）是用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术，是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，是证明蛋白质-蛋白质相互作用的最直接、最经典和最有效的方法。Co-IP是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理：在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白抗体，孵育后再加入与抗体特异性结合的位于琼脂糖珠上的Protein A/G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成“目的蛋白-兴趣蛋白-抗兴趣蛋白抗体-Protein A/G”复合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开，然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的蛋白质，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用分子。
4.酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的研究活细胞内蛋白质相互作用的方法，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测到，是一种具有高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量研究表明，酵母双杂交系统可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，因此，它被广泛应用于多个研究领域。
酵母双杂交系统以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控的影响。酵母转录因子GAL4在结构上由两个或两个以上可以分开、在功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和DNA转录激活结构域（DNA-AD）。这两个结构域分开后仍分别具有功能，但不能激活转录（图2-2（a）），只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录（图2-2（b））。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质（称为诱饵蛋白，bait protein）的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上（称为“猎物”蛋白或靶蛋白，prey or target protein）。同时上述两种载体转化改造后的酵母细胞的基因组既不能产生GAL4，也不能合成报告分子，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取、分离出来，对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作（图2-2（c）、图2-2（d）、图2-2（e））。酵母双杂交系统的应用：鉴定新的蛋白质与蛋白质相互作用，鉴定蛋白质级联底物，鉴定突变对蛋白质与蛋白质结合的影响等。酵母双杂交系统最重要的应用是快速、直接分析已知蛋白质的相互作用及分析新的与已知蛋白质作用的配体及其编码基因。在酵母双杂交的基础上，又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术，它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白质之间的相互作用研究和在已知的蛋白质相互作用中鉴定干扰蛋白质。在细胞的信号转导中，分子与分子间的相互作用是一种主要的信号转导形式。专门研究分子间（蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与小分子配体等）相互作用的酵母双杂交系统正好符合信号转导的研究需要，对细胞的信号转导研究起重要的促进作用。
图2-2 酵母双杂交系统原理
（a）分开的DNA-AD、DNA-BD结构域不能激活转录；（b）DNA-AD、DNA-BD结构域接近时呈现GAL4转录因子活性，激活转录；（c）“诱饵”蛋白与DNA-BD结构域的融合蛋白不能激活转录；（d）“猎物”蛋白与DNA-AD结构域的融合蛋白不能激活转录；（e）两种融合蛋白相互作用，呈现转录因子活性，激活转录。
同以往研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验手段相比，酵母双杂交系统具有其独特优势。首先，融合蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行的，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似于其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此相比于后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于其在体内的真实水平。其次，酵母双杂交系统的灵敏度高，可以检测到蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报告基因表达过程中的多级放大效应反映出来，因为融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。最后，在筛选cDNA文库时，酵母双杂交系统能够便捷地得到编码相互作用蛋白质的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白质，省略了其他体外检测蛋白质之间相互作用方法所必需的蛋白质抽提、纯化等烦琐步骤。
融合蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对胞外配体-受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其他无关蛋白质也可能有类似作用，因此酵母双杂交系统检测的结果必须通过其他蛋白质间相互作用的实验来进一步验证。
5.细胞凋亡的检测
细胞凋亡（apoptosis）是细胞的生命现象之一，其发生诱因及形态学特征均有别于坏死，是机体的胚胎发育、组织修复及免疫应答过程中免疫细胞的杀伤机制之一。凋亡细胞具有典型的形态学、生物化学及分子生物学变化，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等，基于这些特点发展起来的检测方法有形态学鉴定、电泳法、免疫学方法、流式细胞术、原位末端转移酶标记技术、靶细胞DNA片段的定量等。
1）DNA片段化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50～300kb的DNA大片段，或180～200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
2）脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法
细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的黏性3′-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3′-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
3）半胱天冬酶-3（Caspase-3）活性的检测
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号转导的许多途径中发挥作用。Caspase-3在正常情况下以酶原（32kD）的形式存在于细胞质中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17kD）和两个小亚基（12kD）组成，裂解相应的细胞质或细胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡晚期和死亡细胞中，Caspase-3的活性明显下降。可用Western blotting、荧光分光光度计法、流式细胞术分析Caspase-3的活性。
4）膜联蛋白V和PI双染法
早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞膜外，PS可特异性结合标记有异硫氰酸荧光素（FITC）的膜联蛋白V（annexin V），但细胞仍然保持其细胞膜的完整性，使荧光染料PI不能进入细胞（因为PI只能进入细胞膜已经破损的细胞中）；然而，坏死或凋亡晚期的继发性坏死细胞可同时被annexin与PI标记，用流式细胞术（FCM）可定量分析受标记的凋亡与坏死的细胞数。结果分析：正常活细胞为annexin-/PI-，凋亡细胞为annexin+/PI-，继发性坏死细胞为annexin+/PI+，而机械性损伤细胞为annexin-/PI+。
细胞坏死是细胞在受到强烈理化或生物因素作用后出现无序变化的死亡过程，表现为细胞胀大，细胞膜破裂，细胞内容物外溢，细胞核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。一般的检测试剂是台盼蓝（trypan blue），原理如下：健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡细胞的膜完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。在显微镜下可以观察细胞是否被染色。
细胞自噬是细胞内的一种“自食（self-eating）”的现象，是指细胞膜包裹部分细胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），并与内涵体（endosome）形成所谓的自噬内涵体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。细胞自噬的检测金标准是通过电镜看到膜状结构的自噬体以及其他相关亚细胞结构。另外，可以通过蛋白印迹检测自噬标志物LC3的转换（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ），通过荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。
6.体内光学成像技术
体内光学成像技术是运用生物发光剂和内源性荧光报告基因检测分子的技术。体内光学成像技术包括生物发光成像技术与荧光技术。生物发光成像技术是把荧光素酶基因（包括萤火虫荧光素酶或海参荧光素酶）插入细胞的基因组，活性细胞内产生荧光素酶，通过底物荧光素与荧光素酶发生酶促反应而发光的技术。发射光可以被高度敏感的CCD相机所检测。生物发光成像技术常被用于基因表达的显影，蛋白质与蛋白质相互作用的显示，在活体无创性示踪细胞。而荧光技术则采用荧光报告基因如EGFP进行标记，无需底物，但需要激发光使荧光基团达到较高的能量水平，然后发出发射光进行检测。
1.HBV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的实验研究
1）细胞增殖的检测
（1）胸腺嘧啶核苷掺入法：淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。
（2）乳酸脱氢酶染色液（四唑盐）检测法：包含四唑盐（MTT）以及MTT类似产品XTT、MTS、WST-1与CCK-8。MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便、准确的方法，其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成蓝紫色的甲臜（formazan），生成的甲臜量与细胞的数量和细胞的活力成正比。Cell Counting Kit-8（CCK-8）是使用了一种高水溶性的四唑盐WST-8，它在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性甲臜形式的染料。由脱氢酶产生的甲臜的量与活细胞的数量呈直接的线性关系。CCK-8的检测灵敏度高于其他方法，如MTT、XTT、MTS或WST-1等，为细胞数测定和细胞增殖/毒性检测提供了更方便和灵敏的方法。
（3）羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）检测法：CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺酯基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，能使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE进入细胞后不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈1/2递减，可利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道对其进行分析。
（4）5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）检测法：5-溴脱氧尿嘧啶核苷为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）掺入细胞新合成的DNA中。活体注射或细胞培养加入BrdU，而后利用抗BrdU单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，显示增殖细胞。同时结合其他细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类、增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
2）杀伤功能的检测
（1） 51 Cr（铬）释放法：将用Na 51 CrO 4 标记的靶细胞与HBV抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）共同培养，靶细胞被CTL破坏， 51 Cr从靶细胞内释出。以γ计数仪测定释出的 51 Cr放射活性，靶细胞溶解破坏越多， 51 Cr释放就越多，上清液的放射活性也就越高，应用公式可计算出待检效应细胞的杀伤活性。结果准确、重复性好，但存在以下不足：①使用放射性的 51 Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；② 51 Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③ 51 Cr半衰期为27.8天，本方法无法用于需多次测定的动物实验；④细胞共育时间短而实验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。因此多年来人们一直试图寻找可以替代 51 Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用流式细胞分析、报告基因转染法和比色测定法等灵敏可靠、简单易行的非同位素测定法。
（2）流式细胞标记法：PI/FITC-annexin V荧光标记法。正常细胞的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转、暴露于膜外侧，可与annexin V高亲和力结合。研究发现，PS外翻为细胞凋亡的早期事件，先于膜通透性增加，可导致 51 Cr或其他染料的释放。将效应细胞与靶细胞充分共育后，用与PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8-PI）标记效应细胞（不能与PI结合的细胞为靶细胞），再用FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞百分数。该法简单、快捷，无须预标记，可用荧光显微镜观察测定。
（3）报告基因转染法：应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶，如β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-GAL）或荧光素酶（luciferase，LUC）基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定CTL的细胞毒性。通过测定释放入培养液中的酶活性（代表靶细胞死亡数目），可以计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。其中β-GAL半衰期较LUC长，应用较为方便。灵敏度高，自发释放背景低。主要不足是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力，报告基因在有些靶细胞难以转染或表达。
（4）比色测定法：四甲基偶氮唑盐（MTT）或四唑单钠盐（MTS）还原法是根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞死亡的情况。氧化型MTT进入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色甲臜颗粒，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数相关，与靶细胞对照孔比较可计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。本法简便易行，无须预标靶细胞，与 51 Cr释放法比较，相关性好。MTT类似物MTS在细胞内还原的甲臜产物具有水溶性，性质较稳定，其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假阳性结果。
（5）乳酸脱氢酶释放法：乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）在细胞质内含量丰富，正常时不能透过细胞膜，当细胞受到损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。本法操作简便、快捷，自然释放率低，可用于检测CTL的细胞毒性。应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。
3）四聚体/五聚体技术
四聚体/五聚体技术是通过生物素-亲和素级联反应构建MHC-Ⅰ类分子四聚体/五聚体的技术。可溶性MHC单体分子与TCR的亲和力低，因此容易解离，而多价分子可与一个特异性T淋巴细胞上的多个TCR结合，使其解离速度明显降低。借助生物素-亲和素级联反应放大原理可以构建MHC-Ⅰ类分子四聚体。Altman等通过基因工程技术把长度为15个氨基酸残基的生物素酶底物肽（BSP）加在MHC-Ⅰ类分子重链的羧基端形成融合蛋白，在体外按一定比例与β微球蛋白及特异的抗原短肽共孵育，使其折叠成正确的构象，成为pMHC复合物。将生物素标记在底物肽的赖氨酸残基上，一个标记荧光素的链霉亲和素与四个生物素标记的pMHC复合物结合形成四聚体，MHC-抗原肽四聚体与抗原特异性CTL上的TCR结合，通过流式细胞仪可定量检出体内抗原特异性CTL，并能将其分选出来以供体外培养扩增和功能分析。四聚体技术使抗原特异性CTL活性检测特异、高效，且能进行定量。四聚体/五聚体技术可用于检测HBV特异性的CD8 + T淋巴细胞。
2.非特异性免疫细胞的功能检测
1）NK细胞活性测定
（1）乳酸脱氢酶法：YAC-1活细胞（小鼠淋巴瘤细胞）的细胞质内含有乳酸脱氢酶（LDH）。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤作用后，LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原成碘硝基氯化四氮唑蓝（INT），INT接受H+被还原成化合物甲臜。在酶标仪上在490nm处比色测定。
（2）同位素法：将用同位素3H-TdR标记的靶细胞YAC-1细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反映NK细胞的活性。
2）巨噬细胞吞噬功能检测
巨噬细胞具有对异物（如细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等）吞噬和消化的功能，在机体非特异性免疫中发挥重要作用。小鼠腹腔内注射硫代乙醇酸钠，可刺激巨噬细胞的聚集。4天后小鼠腹腔内注入绵羊红细胞悬液，1h后解剖收集腹腔巨噬细胞，染色、镜检可观察巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬现象。通过计算吞噬百分比或吞噬指数可测定巨噬细胞的吞噬功能。观察小鼠腹腔巨噬细胞和中性粒细胞对绵羊红细胞的吞噬现象，计算吞噬百分比。
高通量测序（high-throughput sequencing）是一次并行对几百万到数十亿条DNA分子进行序列测定，又称为下一代测序技术（next generation sequencing，NGS），可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序（deep sequencing）。在一次检测中，使用相对较低的费用，NGS可以快速、高通量测定大量的核酸序列。NGS最显著的优势在于能够从核酸文库中检测到一个DNA片段的序列，避免了之前需要进行分子克隆等烦琐操作。
NGS技术在乙型肝炎病毒诊断、乙型肝炎重症化研究中有许多潜在的应用，如HBV全长病毒基因组测序、病毒基因分型、准种的鉴定、超敏感监测抗病毒药物的耐药性包括检测罕见耐药变异、评估患者病毒组、肠道微生态失衡研究、探查病毒-宿主相互作用等。
NGS平台有多种，它们具有不同的生物化学基础，在测序方案、通量和序列长度上也不同。SOLiD系统具有通量极高但读取时间很短的特点，适合进行全基因组重测序或RNA测序，在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异。而其他NGS检测平台，如焦磷酸测序法（454测序，Roche Diagnostics）、Ion Torrent（Life Technologies）和Illumina测序系统，适合在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础。
肠道微生态失衡对乙型肝炎重症化的发生、发展起着重要的推动作用。微生态的研究主要有微生物多样性测序和宏基因组测序两大策略。
（1）微生物多样性测序（又称扩增子测序）：通过对细菌16Sr DNA的特定区段进行PCR扩增并利用 Illumina Miseq（2×300 bp）平台完成DNA测序，分析获得各个样品中菌群的结构组成及丰度信息。该技术突破了多数传统菌群不可培养的缺点，大大提升了测序通量，降低了测序成本。
（2）宏基因组测序：通过高通量测序平台对样品中菌群的基因组进行测序，分析特定环境中菌群的多样性与丰度、菌群基因组成及功能，进而分析菌群与环境、菌群与宿主代谢之间的关系，从而发现具有特定功能的基因。宏基因组测序无须分离培养微生物，扩展了微生物资源的利用空间，为菌群的研究提供了有效工具。宏基因组测序可以探索和估计样本中真实的物种多样性和遗传多样性，更全面地揭示微生物的物种组成、功能基因及代谢通路方面的信息。
随着生物医学实验技术的快速发展，乙型肝炎重症化研究的实验技术和方法也在不断地更新中。根据研究目的选择合适的方法，在实验研究中是必须考虑并需要做到的。
［1］Singh M，Dicaire A，Wakil A E，et al.Quantitation ofhepatitis B virus（HBV）covalently closed circular DNA（cccDNA）in the liver of HBV-infected patients by LightCycler real-time PCR［J］.J Virol Methods，2004，118（2）：159-167.
［2］赵克开，缪晓辉，徐文胜.HepG2.2.15细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测［J］.中华传染病杂志，2005，23（1）：6-9.
［3］Wong D K，Yuen M F，Yuan H J，et al.Quantitation of covalently closed circularhepatitis B virus DNA in chronichepatitis B patients［J］.Hepatology，2004，40（3）：727-737.
［4］Brindle K.New approaches for imaging tumor responses to treatment［J］.Nat Rev Cancer，2008，8：94-107.
［5］Gratton E.Applied physics.Deeper tissue imaging with total detection［J］.Science，2011，331（6020）：1016-1017.
［6］Meng Z，Xu Y，Wu J，et al.Inhibition ofhepatitis B virus gene expression and replication by endoribonuclease-prepared siRNA［J］.J Virol Methods，2008，150（1-2）：27-33.
［7］Uprichard S L，Boyd B，Althage A，et al.Clearance ofhepatitis B virus from the liver of transgenic mice by shorthairpin RNAs［J］.PNAS，2005，102（3）：773-778.
［8］Metzker M L.Sequencing technologies-the next generation［J］.Nat Rev Genet，2010,11（1）：31-46.
［9］Yozwiak N L，Skewes-Cox P，Stenglein M D，et al.Virus identification in unknown tropical febrile illness cases using deep sequencing［J］.PLoS Negl Trop Dis，2012,6（2）：e1485.
［10］Biesecker L G，Burke W，Kohane I，et al.Next-generation sequencing in the clinic：are we ready?［J］.Nat Rev Genet，2012,13（11）：818-824.