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利用色谱柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱色谱。与薄层色谱类似，柱色谱是色谱技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱色谱、分配柱色谱和离子交换柱色谱等。其中以吸附柱色谱应用最广。
实验室常用的是吸附柱色谱。其原理是利用混合物中各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解吸能力不同，让混合物随流动相流过固定相，发生多次吸附和解吸过程，从而使混合物分离成两种或多种单一的组分。吸附柱色谱常用氧化铝或硅胶作固定相。柱色谱也有分配色谱，分配色谱中以硅胶、硅藻土或纤维素作为支持剂，以吸附较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。
吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大的多孔性或粉末状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，因而以不同的速度沿柱向下流动形成不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小形成若干色带，如图3-5所示。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集，或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
图3-5 色谱柱分离示意图
1.色谱柱
实验室常用的色谱柱是下部带有活塞的玻璃管（见图3-6）。活塞的芯最好用聚四氟乙烯制作，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则要用真空油脂小心地涂薄涂匀。
图3-6 柱色谱装置图
色谱柱的尺寸可根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8~1∶50。柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子；如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。最常使用的色谱，直径与长度之比在1∶8~1∶15。
2.吸附剂
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等，实验室常用氧化铝、硅胶作吸附剂。吸附剂的选择一般要根据待分离化合物的类型而定。例如，硅胶的性能比较温和，属无定形多孔物质，略带酸性，同时硅胶极性相对较小，适合于分离极性较大的化合物，如羧酸、醇、酯、酮、胺等。而氧化铝极性较强，对于弱极性物质具有较弱的吸附作用，适合于分离极性较弱的化合物。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，再用蒸馏水洗至氧化铝悬浮液的pH值为4，用于分离酸性物质；中性氧化铝，其悬浮液的pH值为7.5，用于分离中性物质；碱性氧化铝，其悬浮液的pH值为10，用于胺或其他碱性物质的分离。
大多数吸附剂都能强烈地吸水，致使吸附剂的活性降低，通常用加热方法使吸附剂活化。氧化铝可根据表面含水量的不同，分成各种活性等级，最常使用的活性级别是Ⅱ～Ⅲ级。活性等级的测定一般采用勃劳克曼（Brockmann）标准测定法。吸附剂颗粒大小应当均匀，柱色谱用的硅胶颗粒大小一般为200～300目，氧化铝颗粒大小一般为100～150目。粉末太粗，洗脱剂流速太快，分离效果不好；粉末太细，流速太慢，分离时耗时太长。
吸附剂的用量一般为被分离样品的30～50倍。对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。
3.洗脱剂
洗脱剂，也称为淋洗剂或溶剂，是将被分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重要。如果洗脱剂的极性远大于被分离物的极性，则洗脱剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将原来被吸附的待分离物“顶替”下来，随多余的淋洗剂冲下而起不到分离作用；如果洗脱剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下移动，也不能达到分离的目的。如果洗脱剂对于被分离物各组分溶解度太大，被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离；如果溶解度太小，则会造成谱带分散，甚至完全不能分开。实际操作时，一般采用前面薄层色谱法提到的展开剂选择方法先用薄层色谱反复对比，然后选择柱色谱的洗脱剂。能在薄层色谱上将样品中各组分完全分开的展开剂，即可用作柱色谱的洗脱剂。在有多种洗脱剂可供选择时，一般选择目标组分Rf值较大的洗脱剂。
洗脱剂的用量往往较大，故最好使用单一溶剂以利回收。若选不出合适的单一溶剂时，可使用混合溶剂。混合溶剂由强极性溶剂和弱极性溶剂复配而成，一般由两种可以无限混溶的溶剂组成，先以不同的配比在薄层板上试验，选出最佳配比，再按该比例配制好，像单一溶剂一样使用。
硅胶和氧化铝作吸附剂的柱色谱，洗脱剂的洗脱能力有如下顺序：
正己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
选择洗脱剂除了考虑分离效果外，还需要考虑以下因素：
（1）在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长期共存而不发生任何化学反应，也不被吸附剂或被分离物催化而发生自身的化学反应；
（2）沸点较低，容易回收；
（3）毒性较小，操作安全；
（4）价廉易得。
1.装柱
柱色谱装柱的方法有湿法和干法两种。
（1）湿法装柱。湿法装柱时，将玻璃色谱柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞，加入选定的洗脱剂至柱容积的1/4，用一支干净的玻璃棒将少量玻璃丝（或脱脂棉）轻轻推入柱底狭窄部位，小心挤出其中的气泡，但不要压得太紧密，否则洗脱剂将流出太慢或根本流不出来。将准备好的石英砂加入柱中，使其在玻璃丝上均匀沉积成约5mm厚的石英砂层。将所需量的吸附剂置烧杯中，加洗脱剂浸润，溶胀并调成糊状。打开色谱柱下部活塞调节流出速度为1滴/秒，将调好的吸附剂在搅拌下自柱顶缓缓注入柱中，同时用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使吸附剂在洗脱剂中均匀沉降，形成均匀紧密的吸附剂柱。吸附剂最好一次加完。若分数次加，则会沉积为数层，各层交接处的吸附剂颗粒很细，在分离时易被误认为是一个色层。全部吸附剂加完后，再在吸附剂沉积层面上盖一层5mm厚的石英砂，关闭活塞。在全部装柱过程及装完柱后，都需始终保持吸附剂上面有一段液柱，否则将会有空气进入吸附剂，在其中形成气泡而影响分离效果。如果发现柱中已经形成气泡，则应设法排除。若不能排除，则应倒出重装。装好的吸附柱各层材料的分布如图3-6所示。
（2）干法装柱。干法装柱时，也是先将玻璃色谱柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞。先在柱子的底部塞一小团脱脂棉或玻璃丝，然后用玻璃棒轻轻压紧，注意松紧要适度。然后在棉花上铺一层0.5cm厚的石英砂层加一块比柱内径略小的滤纸片，这样可以防止洗脱过程中吸附剂泄漏。然后加入洗脱剂至柱容积的3/4，打开活塞控制洗脱剂流速为1滴/秒，再将所需量的吸附剂通过一支短颈玻璃漏斗慢慢加入柱中，同时，轻轻敲柱身排除气泡使其填充紧密，最后再在吸附剂上面加一层约5mm厚的石英砂。
干法装柱的缺点是容易使柱中混有气泡。特别是使用硅胶为吸附剂时，最好不用干法装柱，因为硅胶在溶剂中有一溶胀过程。若采用干法装柱，硅胶会在柱中溶胀，往往留下缝隙和气泡，影响分离效果，甚至需要重新装柱。
2.加样
加样也有湿法和干法两种。
（1）湿法加样。湿法加样是将待分离物溶于尽可能少的溶剂中，如有不溶性杂质，应当滤去。打开色谱柱下部活塞小心放出柱中液体至液面下降到石英砂上表面处，关闭活塞，将配好的溶液沿着柱内壁缓缓加入，切记勿冲动石英砂和吸附剂，否则将造成吸附剂表面不平而影响分离效果。溶液加完后，小心开启柱下活塞，放出液体至溶液液面降至石英砂上表面时，关闭活塞，用少许溶剂冲洗色谱柱内壁（同样不可冲动吸附剂），再放出液体至液面降到石英砂上表面处，再次冲洗色谱柱内壁，直至柱壁和柱顶溶剂没有颜色。加样操作的关键是要避免样品溶液被冲稀。在技术熟练的情况下，也可以不关下部活塞，在每秒钟l滴的恒定流速下连贯地完成上述操作。
（2）干法加样。干法加样是将待分离样品加少量低沸点溶剂溶解，再加入约5倍量吸附剂，拌和均匀后在通风橱中蒸发至干。将吸附了样品的吸附剂平摊在柱内吸附剂的顶端，再在上面加盖一层石英砂。干法加样易于掌握，不会造成样品溶液的冲稀，但不适合对热敏感的化合物。
3.洗脱和接收
样品加入后即可用大量洗脱剂洗脱。随着流动相向下移动，混合物逐渐分成若干个不同的色带，继续洗脱，各色带间距离拉开，最终被一个个洗脱下来。当第一色带开始流出时，更换接收瓶，接收完毕再更换接收瓶，接收两色带间的空白带，并依此法分别接收各个色带。若后面的色带下行太慢，则可依次使用几种极性逐渐增大的洗脱剂来洗脱。
要注意在洗脱过程中改变洗脱剂的极性，不能把一种洗脱剂迅速换成另一种洗脱剂。而应当将极性稍大的洗脱剂按一定的百分率逐渐加到正在使用的洗脱剂中去，逐步提高其比例，直至所需要的配比。一条经验规律称为“幂指数增加”。例如，原洗脱剂为环己烷，如欲加入二氯甲烷以增加其极性，则不应立即换为二氯甲烷，而应使用这两种洗脱剂的混合液，其中二氯甲烷的比例依次为5%、15%、45%，最后再换为纯净的二氯甲烷。每次加大比例后，必须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是一般方法，其目的在于避免后面的色带行进过快，追上前面的色带，造成交叉带。但如果两包带间有很宽阔的空白带，不会造成交叉，则可直接换成后一种洗脱剂，所以应根据具体情况灵活运用。
4.显色
分离无色物质时需要显色。如果使用带荧光的吸附剂，则可在黑暗的环境中用紫外光照射以显出各色带的位置，以便按色带分别接收。但柱上显色远不如在薄层板上显色方便。所以常用的办法是等分接收，即事先制备十几个甚至几十个接收瓶（如几十个试管），依次编出号码，各自接收相同体积的流出液，并各自在薄层板上点样展开，然后在薄层板上显色（相关的显色操作见薄层色谱部分）。具有相同Rf值的为同一组分，可以合并处理。也可能出现交叉带。若交叉带很少，则可以弃之；若交叉带较多，或样品很贵重，则可以将交叉部分再次作柱色谱分离，直至完全分开。例如，某一样品经等分接收和薄层色谱并显色处理后如图3-7所示。
由图3-7可知，1、7、8号接收液都是空白，没有任何组分，可以合并处理。2～6号为第一组分，可以合并处理，9～13号为第二组分，14～16号为第三组分，17～20号为第四组分。其中第14号实际是一个交叉带，以第三组分为主，也含有少量第二组分。如果对第三组分的纯度要求不高，可以并入第三组分；如果对第三组分的纯度要求甚高，可将第14号接收液浓缩后再做一次柱色谱分离。
图3-7 一个四组分样品经柱色谱分离后再经薄层色谱检测的情况
（1）选择一合适的色谱柱，以活性中性氧化铝（160～200目，于300～400℃下活化3～4h，10g）为吸附剂，95%乙醇为洗脱剂，参照前述步骤采用湿法或干法装填一支色谱柱。
（2）打开色谱柱下端活塞，使柱内乙醇流出到柱顶快干时，立即沿柱壁小心加入1mL 0.5%的甲基橙和亚甲基蓝的乙醇混合溶液，当此溶液流至接近石英砂层面时，再用少量的洗脱剂将壁上的样品洗下来，如此重复2～3次，直至洗净为止。
（3）用95%的乙醇洗脱，控制流出速度为5～10滴/分钟。整个过程应保持始终有洗脱剂覆盖吸附剂。
由于亚甲基蓝与氧化铝的作用力较小首先向下移动，吸附作用较大的甲基橙则留在柱子的上端，从而形成不同的色带（蓝色的亚甲基蓝和黄色的甲基橙）。当最先下行的色带快流出时，更换接收瓶，继续洗脱，直至滴出液无色为止。之后，将洗脱液改为水，洗脱甲基橙，并接收黄色的流出液，直至滴出液无色为止。两种组分被分离后，停止洗脱。
（1）预习实验原理和操作步骤。
（2）请利用互联网查出下列主要药品的物理常数，并写到预习报告中。
（3）为了保持柱子的均一性，整个洗脱过程中，洗脱剂应浸没吸附剂，否则柱子会干裂，从而影响分离效果。
（4）最好用移液管将待分离溶液转移至柱中。
（5）尽量避免待分离液黏附在色谱柱的内壁上。
（6）分离结束后，应先让洗脱剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞口向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里，切勿倒入水槽，以免堵塞水槽。