实验5
薄层色谱

薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）也叫薄层层析，属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点，适用于小量样品（几微克到几十微克，甚至0.01μg）的分离。同时薄层色谱是一种非常有用的跟踪反应的手段，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。薄层色谱也常用作柱色谱的先导，可用于柱色谱分离中展开剂的选择，也可监视柱色谱分离状况和效果。

一、实验原理

薄层色谱主要是利用吸附剂对样品中各组分吸附能力的不同，以及展开剂对各组分的溶解能力的差异，使各组分被分离。被分离的样品制成溶液并用毛细管点在靠近层析薄板的一端处，作为流动相的溶剂（称为展开剂），靠毛细作用从点有样品的层析薄板的一端向另一端运动并带着样品中的各组分一起移动，各组分既被吸附剂不断地吸附，又被流动相不断地溶解——解吸。由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，在吸附竞争中那些极性较小的、吸附力较弱的分子易被其他分子从吸附剂表面“顶替”下来而进入流动相，进入流动相的分子随流动相一起移动，并在前进途中经历新的吸附和解吸及溶解竞争。在溶解竞争中，溶解度大的分子易进入流动相；反之，溶解度小的、极性较强的分子则易被吸附，较难进入流动相。这样经过反复多次的吸附和溶解竞争后，受吸附力较弱而溶解度较大的组分将行进较长的路程；反之，吸附较强或溶解度较小的组分则行程较短，从而使各组分间拉开距离，形成互相分离的斑点。

二、薄层色谱实验的一般步骤

1.薄层色谱常用的吸附剂及辅助材料的选择

薄层吸附色谱最常用的吸附剂为硅胶和氧化铝，薄层分配色谱的支持剂为硅藻土和纤维素。

硅胶是无定形多孔性物质，略显酸性，适用于酸性物质的分离分析。薄层色谱用的硅胶分为“硅胶H”（不含黏合剂和其他添加剂的色谱用硅胶）、“硅胶G”（包含煅石膏黏合剂，G代表石膏（gypsum））、“硅胶HF254”（含荧光物质，可于波长254nm紫外灯下观察荧光）、“硅胶GF254”（既含煅石膏又含荧光剂）等类型。

与硅胶相似，氧化铝也因含黏合剂或荧光剂而分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254等。

黏合剂除了上述的石膏外，还可以用淀粉、羧甲基纤维素钠。薄层色谱板通常按加黏合剂和不加黏合剂分为两种，加黏合剂的称为硬板，不加黏合剂的称为软板。

吸附剂颗粒大小一般为260目左右。颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。

化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强。一般地，化合物极性大小顺序为：酸和碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃。

2.薄层板制备

薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度固定，否则在展开时溶剂前沿不齐，色谱结果不易重复。薄层板分为干板和湿板，大多为湿板。

（1）湿板的一般制备方法。

载片准备：薄层载片一般为玻璃板或者硬质塑料板，以玻璃板常见。如果是新的玻璃板或载玻片，水洗，干燥即可；如果是重新使用的载片，要用洗衣粉和水洗涤，用水淋洗，再用50%甲醇溶液淋洗，让载玻片完全干燥。取用时应注意手指只能接触载玻片的边缘，如果指印污染载玻片，吸附剂将难以铺在载玻片上。

浆料制备：浆料要求均匀，不带团块，黏稠适当。一般先将吸附剂与浆料混合均匀，调成糊状；如果混合时出现团块，混完后，需剧烈搅拌或者碾磨，保证充分混合。一般1g硅胶G需要0.5%CMC（羧甲基纤维素钠）清液3～4mL或约3mL氯仿，1g氧化铝G需要0.5%CMC清液约2mL。不同吸附剂可酌情使用溶剂量。

薄层板的铺制：薄层板铺制有平铺法、倾斜法和浸涂法，薄层厚度一般为0.25～1mm。

平铺法：可用涂布器（见图3-1）涂布，将洗净的玻璃板在涂布器中间摆好，上下两边各夹一块比前者厚0.25mm的玻璃板，将浆料倒入涂布器槽中，推动浆料可将其平铺板上。若无涂布器，可用浆料倒在玻璃板上，用玻片或者不锈钢尺子刮平，也可制得。

倾斜法：若没有涂布器，则可将调好的糊状物倒在载玻片上，用药匙摊开后，用手摇晃并轻轻敲击玻板背面，使其糊状物均匀铺开且表面均匀光滑。

浸涂法：把两块干净的、大小一致的载玻片背靠背贴紧，浸入调好的吸附剂中，取出后分开，晾干，即可。

薄层板的活化：把涂好的薄层板置于室温晾干，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105～110℃活化30min。氧化铝板在200℃烘4h可得活性Ⅱ级的薄层板，150～160℃烘4h可得Ⅲ～Ⅳ级薄层板。薄层板活性与含水量有关，活性随含水量增加而下降。

（2）干板的制备方法。

干板就是不加黏合剂或其他物质，将固体吸附剂干粉直接铺在载片上制得的薄层色谱板（层析板）。干板的制作方法不止一种，下面是一种比较简单的方法。

干板载片采用3cm×20cm的玻璃片，用前按湿板载片的清洗方法清洗干净，干燥。将载片放在一个干净的搪瓷盘子或不锈钢盘子里，将吸附剂干粉（如氧化铝等）铺展在载片上，使其有一定厚度，然后用一块相同大小的载片盖到上面，用两只手捏住两端，轻轻捻动，使两载片间所夹的干粉下落，直到两载片之间所夹干粉的厚度约为1mm时停止捻动，将载片平放在台面上，轻轻拿去上面的载片，注意保持所铺干粉的上表面光滑，没有皱纹，一块干板就制成了。干板制作过程还要注意干粉的厚度要均匀，不能一边薄另一边厚，这样会导致样品跑偏。

3.点样

先用米尺测量距薄层板一端1cm处作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。若样品溶液太稀，则可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，从而影响分离效果。若在同一起始线上点几个样，样点间距离应为1cm。点样要轻，不可刺破薄层。

4.展开

在薄层色谱中用作流动相的溶剂称为展开剂（柱色谱中称为淋洗剂或洗脱剂），其选择原则是由被分离物质的极性决定的。被分离物极性小，选用极性较小的展开剂；被分离物极性大，选用极性较大的展开剂。环己烷和石油醚是最常使用的非极性展开剂，适合于非极性或弱极性试样；乙酸乙酯、丙酮或甲醇适合于分离极性较强的试祥，氯仿和苯是中等极性的展开剂，可用作多官能团化合物的分离和鉴定。

展开剂的一条快捷的途径是在同一块薄层板上点上被分离样品的几个样点，各样点间至少相距1cm，再用滴管分别汲取不同的溶剂，各自点在一个样点上，溶剂将从样点向外扩展，形成一些同心的圆环。若样点基本上不随溶剂移动（见图3-2（a）），或一直随溶剂移动到前沿（见图3-2（d）），则这样的溶剂不适用。若样点随溶剂移动适当距离，形成较宽的环带（见图3-2（b）），或形成几个不同的环带（见图3-2（c）），则该溶剂一般可作为展开剂使用。

若单一展开剂不能很好分离，也可采用不同比例的混合溶剂展开。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物。若展开不好，则用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合适的混合展开剂常需多次细心选择才能确定。

一些常见溶剂和它们的相对极性：

甲醇>乙醇>异丙醇>乙氰>乙酸乙酯>氯仿>二氯甲烷>乙醚>甲苯>正己烷、石油醚

薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。可使用特制的展开槽或层析缸（见图3-3，左边为展开槽，右边为层析缸，层析缸也可用广口瓶代替）。将配好的展开剂倒入展开槽或层析缸（液层厚度约0.5cm）。将点好样品的薄层板放入展开槽或层析缸内，点样一端在下（注意样品点必须在展开剂液面之上）。盖好盖子，此时展开剂即沿薄层上升。当展开剂前沿上升到距薄层板顶端约1cm时，取出薄层板平放，尽快标出前沿位置，然后置于通风处晾干，或用电吹风吹干。

5.显色

薄层展开后，如果样品本身带颜色，则可直接看到斑点的位置。如果样品是无色的，则可采用紫外灯照射、碘薰或喷显色剂等方法显色。

（1）碘蒸气显色法。由于碘能与很多有机化合物（烷烃和氯代烃除外）可逆地结合形成有颜色的络合物，所以先将几粒碘的晶体置于广口的密闭容器中，碘蒸气很快地充满容器，再将展开后的薄板（溶剂已挥发干净）放入其中并密闭起来，有机化合物即与碘作用而呈现出棕色的斑点。取出薄层板后立即标记斑点的位置和形状（因碘易挥发，斑点的棕色在空气中很快就会消失）。

（2）紫外光显色法。如果被分离（或分析）的样品本身是荧光物质，则样品板可在暗处的紫外灯下观察到它的光亮的斑点；用加过荧光剂的薄层板展开非荧光有机化合物样品，在暗处紫外灯下可观察到其在光亮背景上呈现的深色斑点。

（3）试剂显色法。除了上述显色法之外，还可以根据被分离（分析）化合物的性质，采用不同的试剂进行显色。例如，浓硫酸能使大多数有机物在加热后显黑色斑点（以CMC为黏合剂的硬板不宜用硫酸显色，因为硫酸也会使CMC碳化，整板黑色而显不出斑点位置），蛋白质或氨基酸用茚三酮显色等。

6.计算比移值

分别测量展开后各样品点中心距起始线的距离（记为a）、展开剂前沿距起始线的距离（记为b）（见图3-4），比移值R _f 按下式计算：

R _f =化合物样品点移动的距离a/展开剂前沿移动的距离b

如果样品中各组分的比移值都较小，则应该换用极性大一点的展开剂；反之，如果各组分的比移值都较大，则应换用极性小一点的展开剂，直至找到一个分离效果好的展开剂。

好的展开剂应沸点适中，对样品有良好的溶解性。并能使样品中各组分分开，展开后组分斑点圆且集中。

三、苏丹红、苏丹黄、偶氮苯比移值R _f 的测定

（1）按上面介绍的方法制备（湿板或干板）色谱板（最好选用3cm×20cm的玻璃载片）。

（2）参照图3-4，分别用内径小于1mm端口平整毛细管吸取苏丹红、苏丹黄及偶氮苯的三氯甲烷溶液并分别点于距层析板一端约1cm处的一条直线上，三个样品点相互之间的距离约为1cm，样品斑点的直径不超过2mm。

（3）在图3-3所示的展开槽底部的一端放置一干净的聚乙烯试剂瓶盖作为样品板高端的支撑，然后将点好的样品板放入其中，使样品板的倾斜度约为15°，点样的一端在下。按环己烷和乙酸乙酯体积比为9∶1的比例配置展开剂，配好后从样品板高端缓慢加入展开槽至样品板低端浸入展开剂约5mm，盖好展开槽透明盖子，观察样品展开。

（4）观察到展开剂高度距样品板高端约1cm时，迅速取出样品板并平放，标记出展开剂前沿的位置，如图3-4所示，分别测量展开剂和样品移动的距离，计算R _f 值。

四、预习及操作过程指导

（1）预习实验原理和操作步骤。

（2）请利用互联网查出下列主要药品的物理常数，并写到预习报告中。

（3）偶氮苯为顺式结构和反式结构的混合物，展开后为两个样点。

（4）点样的量不要太多，太多会导致样点展开后严重拖尾。

（5）样品板放入展开槽时，一定要使下端边缘与展开槽底完全接触，不能翘起，否则会导致样点跑偏。

（6）实验应重复测三次，取平均值。 VvpMoxmzu99X8IDgxIGt73w0RDpO5jgCHcL4S+MtJVXSbgya2igGk8PoBNa5EGmb