第17章
CRISPR-Cas9

大获成功

杜德纳回到伯克利时，她和吉尼克使用了Skype与身在于默奥的沙尔庞捷和身在维也纳的奇林斯基进行视频通话，制定策略，弄清CRISPR-Cas9的机制。几人的合作如同联合国：一位来自夏威夷的伯克利教授及其来自捷克共和国的博士后，在瑞典工作的巴黎教授及其生于波兰、在维也纳工作的博士后。

吉尼克回忆道：“我们之间的合作成为一场24小时不间断行动。在一天的最后，我会进行一项实验，向维也纳发送一封邮件；克日什托夫早上一起床，便会阅读邮件。”随后，他们会进行一次Skype通话，决定下一步的行动。“克日什托夫会在白天做该项实验，在我还在梦乡时把结果发送给我。我醒来后打开收件箱，便会看到最新情况。” ¹

起初，沙尔庞捷和杜德纳每月只会加入一两次Skype通话。但是，2011年7月，沙尔庞捷和奇林斯基飞往伯克利，参加迅速扩大的CRISPR年会时，工作节奏随之加快。即使吉尼克和奇林斯基通过Skype建立了工作关系，两人在年会上也才首次面对面相见。奇林斯基是一位身形瘦长的研究人员，平易近人，友善可亲，渴望参加将基础研究转化为工具的工作。 ²

两人亲临现场，彼此相见，能产生电话会议和Zoom会议中无法生成的想法。在波多黎各时，这种情况就曾出现。四名研究人员在伯克利首次相聚时，便梅开二度，再结硕果。在伯克利，四人能集思广益，制定策略，弄清在CRISPR系统中，究竟是哪些分子对剪切DNA不可或缺。项目在早期阶段时，需要到场参加的会议尤为有效。杜德纳说：“与人们坐在同一个房间，看见彼此的反应，面对面你来我往地探讨问题。没有什么能与之相提并论。这种讨论是我们每一次合作的基石，甚至我们通过电子通信开展大量工作时亦是如此。”

起初，吉尼克和奇林斯基无法在试管中使用CRISPR-Cas9剪切病毒的DNA。此前，两人一直仅使用两种成分——Cas9酶和crRNA，设法使其起效。理论上说，crRNA会把Cas9酶引至目标病毒处，随后Cas9酶会对病毒进行切割。但是这种方法并未奏效。两人忽略了某些东西。吉尼克回忆道：“我们对这一情况极度困惑不解。”

tracrRNA在此重新进入我们的故事。在2011年发表的论文中，沙尔庞捷表明，要产生crRNA向导，就需要tracrRNA。她后来说，尽管在自己的首轮实验中未做证实，但是自己怀疑，tracrRNA甚至会持续不断地发挥更为巨大的作用。实验失败后，奇林斯基决定将tracrRNA投入自己的试管中进行混合。

此举产生了效果：三种成分的混合物不负众望，切割了目标DNA。吉尼克立刻将这一消息告诉了杜德纳：“在缺少tracrRNA的情况下，crRNA向导无法与Cas9酶结合。”实现该项突破后，杜德纳和沙尔庞捷在日常工作中的合作更加密切。显而易见，两人正朝着一项重大发现稳步前行：确定CRISPR基因切割系统中的必要成分。

奇林斯基和吉尼克日复一日，彼此交换实验结果，每一次都为拼图增加了一小块。与此同时，沙尔庞捷和杜德纳越发频繁地加入策略讨论。他们成功发现了CRISPR-Cas9复合体所需三种成分各自确切的作用机制。crRNA包含一个有20个字母的序列，该序列起到一系列坐标作用，将复合体引至一段含有相似序列的DNA。tracrRNA此前推动了crRNA产生，现在发挥了类似脚手架的额外作用，在其他成分争先恐后奔向目标DNA时，把它们固定在正确位置。随后，Cas9酶开始切割DNA。

一天晚上，就在一项关键性实验产生可喜结果后，杜德纳在家烹制意大利面。沸腾的开水在锅里打转，杜德纳想起了在高中学习DNA时，通过显微镜研究的鲑鱼精子。想到这里，她笑了起来。杜德纳9岁的儿子安迪问她为什么笑。杜德纳解释说：“我们发现了一种蛋白，一种叫作Cas9的酶。通过编辑，这种酶能发现并切割病毒。这种酶厉害极了。”安迪一直追问这种酶的作用原理。杜德纳解释说，数十亿年来，细菌进化出一种不可思议、令人震惊的方式来保护自己，抗击病毒。细菌拥有自我适应能力。每当新病毒出现，细菌便学习如何识别新病毒，将其击退。安迪听得入了迷。杜德纳回忆道：“我获得了双重喜悦。当时的我既就某个十分重要的事物做出了基础性发现，又得以和我的儿子分享，用他可以理解的方法向他解释。”好奇心能以此种方式展现其魅力。 ³

基因编辑工具

没过多久，情况变得十分明朗，这一令人称奇的微小系统具有实实在在的巨大潜在应用价值：人们可以修改crRNA的导向，锁定任何你想要切割的DNA序列。这一切可以通过编辑实现。该系统可以变成一个编辑工具。

CRISPR研究成为生动案例，证明了基础科学和转化医学之间你呼我应的二重奏效应。最初，该项研究的动力源自“微生物猎人”纯粹的好奇心。他们在为另类细菌的DNA测序时，遇到了怪事，想做出解释。随后，CRISPR研究的目的变为保护酸奶中的细菌，使其免受病毒攻击。这一阶段的研究促成了一项基础发现，帮助人们认识生物学的基本作用原理。现在，生物化学分析为发明一项具有潜在实用价值的工具指明了道路。杜德纳说：“一旦我们搞清楚CRISPR-Cas9复合体的成分，我们便发现，我们可以对其进行编辑，使之为我们所用。换言之，我们增加一个不同的crRNA，就能使CRISPR-Cas9切割我们所选的任何不同的DNA序列。”

在科学史中，虽然鲜有真正成功获得发现的重大时刻，但是这一次，成功近在咫尺。杜德纳说：“这并不仅仅是某种循序渐进接近成功的过程，而是一个令人惊喜的时刻。”吉尼克向杜德纳展示数据，证明可用不同向导RNA编辑Cas9，切割DNA的任何部分。当时，两人实际上激动得说不出话，望着彼此。然后杜德纳高声说道：“我的天，这可以成为一个强大的基因编辑工具。”简而言之，两人意识到，他们已开发出重写生命密码的方法。 ⁴

单链向导RNA

下一步是弄清能否进一步简化CRISPR系统。如果可以，该系统不仅可能成为一种基因编辑工具，而且比现有方法更易使用，价格更为低廉。

一天，吉尼克从实验室穿过走廊，走进杜德纳的办公室。吉尼克一直在进行实验，以确定作为向导的crRNA和将其固定在靶标DNA上的tracrRNA的最低要求。杜德纳的办公桌前立着一块白板。两人站在白板前，吉尼克绘制了两种小型RNA的结构图示。吉尼克问，在crRNA和tracrRNA中，哪些是在试管中切割DNA必不可少的部分？吉尼克说：“在确定两种RNA长度的问题上，该系统似乎存在一定弹性。”在两种小型RNA中，每一种都可以缩短，却依然会发挥功效。杜德纳对RNA结构形成了深刻理解，在弄清RNA结构作用原理的过程中，产生了一种近乎获得童趣的快乐。随着两人齐心协力，共同探讨解决方法，他们逐渐发现，可以将两种RNA相连，将其中一种RNA的尾部与另一种RNA的前部结合，确保结合后的分子能正常发挥作用。

两人的目标是制成一种单一RNA分子，使其既包含向导信息，也具有绑定功能。如此一来，两人将创造出“单链向导”RNA（sgRNA）。当时，两人沉默了片刻，彼此相望，随后杜德纳说：“哇！”她回忆道：“那是我在科学界感受到的妙不可言的时刻之一。我浑身发冷，脖子后的汗毛都竖了起来。在那一刻，我们意识到，此项受好奇心驱动、乐趣无穷的项目意义重大，可以从根本上改变项目发展的方向。”这一场景不难想象：一个小小分子的活动令杜德纳脖子后的汗毛竖了起来。

杜德纳力劝吉尼克马上开始工作，研究如何融合两种RNA分子，使之成为Cas9的单一向导，发挥自身作用。吉尼克赶忙离开杜德纳的办公室，穿过走廊，向一家公司订购必要的RNA分子。吉尼克也就这一想法同奇林斯基做了讨论。两人迅速设计出一系列实验，确定了可删除两种RNA中的哪些部分，两种RNA如何融合，仅用了三周，便制成有效的单链向导RNA。

没过多久，这一单链向导将CRISPR-Cas9变成功能更多、更易使用、可以改编的基因编辑工具。其效果显而易见。从科学和知识产权的立场看，单链向导系统之所以意义尤为重大，是因为该系统是一项真真正正的人类发明，而不仅仅是对一种自然现象的发现。

到目前为止，杜德纳与沙尔庞捷的合作已产生了两项重大进步。第一项进步是发现了tracrRNA的根本性作用。其作用不仅影响crRNA导向的产生，更为重要的是，还保障了crRNA与Cas9酶的结合，将其与目标DNA绑定，完成切割进程。第二项进步是发明了一种方法，将两种RNA融合为单链向导RNA。通过研究细菌内部经十亿年左右进化而完善的现象，杜德纳和沙尔庞捷将自然奇迹转化为一种工具，为人类所用。

一天，杜德纳与吉尼克共同讨论了如何创制一种单链向导RNA。在吃晚饭时，杜德纳向自己的丈夫解释了这一想法。杰米·凯特意识到，这一想法可能会变为一项基因编辑技术专利。于是，他告诉杜德纳，她需要在旁人的见证下，将其完完整整地写在实验室记录本上。因此，吉尼克当晚回到实验室，将关于这一概念的细致描述写了下来。虽然当时临近晚上9点，但是山姆·斯腾伯格和雷切尔·赫尔维茨依然没有离开。在实验室记录本每一页的底部，均有证人签字行，用于记录重大进展。吉尼克要求斯腾伯格和赫尔维茨两人在记录本页面上签字。此前，从没有人向斯腾伯格提出过这一要求。因此，他意识到，这是一个具有历史意义的夜晚。 ⁵ 4h8Ih18J9eCtuPYi0dH4oYlLFPPOLlPZ2h+QUG5Eb0BgVNyvpO0iK+nxOHCAVHf2