第9章
成簇重复序列

弗朗西斯科·莫伊卡

石野良纯（Yoshizumi Ishino）在日本大阪大学就读期间，其博士研究就包括为大肠杆菌的一种基因测序。当时是1986年，基因测序虽然费时费力，但是石野良纯最终成功地测定了该基因的1 038个碱基对。次年，石野良纯就该基因发表了一份长篇论文。他在论文的最后一段提到一件怪事，但他认为这件事无关痛痒，所以未在论文摘要中提及。他写道：“我发现了一种非同寻常的结构。5段高度同源的29个核苷酸组成的片段重复相连。”换言之，石野良纯发现了5个一模一样的DNA片段。这些重复序列中的每一个都含有29个碱基对，分布在他命名为“间隔序列”的看起来正常的DNA序列之间。他并不知道这些成簇的重复序列有何意义。在论文的最后一行，石野良纯写道：“这些序列对生物学的意义尚不清楚。”他并未就这一话题展开探讨。 ¹

阿利坎特大学坐落于西班牙靠地中海的海岸。弗朗西斯科·莫伊卡是该大学的一位研究生，同时是首位尝试弄清重复序列功能的研究人员。1990年，莫伊卡开始撰写一篇关于古菌的博士论文。古菌与细菌一样，是没有细胞核的单细胞生物体。莫伊卡研究的古菌在盐池中大量繁殖，此类盐池的盐度是海洋盐度的11倍。他希望通过测定基因序列了解这类古菌嗜盐的原因。而他注意到了14个完全相同的DNA序列，它们每隔一定距离便会重复。它们看起来是回文结构，即顺读或反读的序列一致。 ²

最初，莫伊卡认为，自己的测序工作出错了。他面带笑容，充满活力地说道：“我当时以为我犯了个错误，因为测序并非易事。”但是到1992年，莫伊卡的数据不断表明，这些规律间隔的重复是存在的。他想知道，其他人是否也发现了类似的情况。那时，谷歌搜索引擎尚未问世，联机索引也并不存在。因此，莫伊卡在一套名为《现刊目录》（Current Contents）的印刷版学术论文索引中，通过查找“重复”一词的引用，人工对其进行分类。因为事情发生在20世纪，人们鲜能在网络上找到刊物，所以每当找到一份看上去会有所收获的列表，莫伊卡就一定会前往图书馆，找到相关期刊。最终，他找到了石野的文章。

与莫伊卡研究的古菌相比，石野研究的大肠杆菌是一种截然不同的微生物。因此，两人均发现了重复序列和存有间隔的片段便令人颇感惊讶。1995年，石野发表了一篇论文。在论文中，石野和他的导师将其命名为“串联重复序列”（tandem repeats）。两人错误地推测，此类重复可能与细胞复制相关。 ³

1997年，在盐湖城和牛津迅速完成两段博士后工作后，莫伊卡回到距离自己出生地仅数千米远的阿利坎特大学，在那里成立了研究小组，研究这些神秘的重复序列。但研究资金的获取并非易事。莫伊卡说：“有人告诉我，不要再对这些重复执迷不悟，因为微生物体内存在许许多多此类现象，我研究的微生物可能并没有什么特别之处。”

但是莫伊卡知道，细菌和古菌所含的基因组很小，没有必要将基因组序列浪费在没有重要功能的序列上。因此莫伊卡坚守使命，想努力弄清此类成簇重复序列。也许，此类序列能帮助塑造DNA的结构，或形成无规则的环状结构，使蛋白质能够依附。最终的情况证明，两种猜测同样不正确。

“CRISPR”之名

当时，研究人员已经在20种不同的细菌和古菌中发现此类重复序列，随后为之起了许许多多不同的名字。莫伊卡对石野和他的导师所起的“串联重复序列”这一名字并不满意。因为此类序列中存在间隔，并未彼此直接串联。因此，莫伊卡起初将此类序列重新命名为“规律间隔短重复序列”，也叫SRSR（short regularly spaced repeats）。这一名称虽然解释性更强，但是难以记忆，其英文缩写无法组成可念出的词。

莫伊卡一直与吕德·詹森（Ruud Jansen）保持通信来往。詹森在荷兰的乌得勒支大学任职，当时正在研究结核菌中的此类序列。虽然詹森一直将这些序列称为“直接重复序列”（direct repeats），但是他也认为两人需要想出更好的名字。一天晚上，莫伊卡开车从实验室回家，他灵光乍现，想出了CRISPR这个名字。CRISPR是“规律间隔成簇短回文重复序列”的缩写。虽然人们几乎不可能记住其冗长的表达，但缩写的CRISPR的确简洁明快，朗朗上口，听上去不会令人紧张不安，而是感到亲切愉快。 莫伊卡到家后，问妻子觉得这个名字怎么样。他的妻子说：“它听起来非常适合作为狗的名字。Crispr，Crispr，到这儿来，小狗狗！”莫伊卡忍俊不禁，认定这个名字非常合适。

2001年11月21日，在一封回复莫伊卡建议的电子邮件中，詹森选定了CRISPR这个名字。詹森写道：“亲爱的弗朗西斯，CRISPR是很棒的缩写词。我认为，每换掉其中一个字母，这个词便会少散发一分活力。与SRSR和SPIDR相比，我更喜欢活力四射的CRISPR。” ⁴

在2002年4月发表的一篇论文中，詹森正式确定使用CRISPR作为该序列的名称。该篇论文介绍了由他发现的似乎与CRISPR相关的基因。在大多数含有CRISPR的生物体内，重复序列的邻近位置都存在一类基因，它为生成一种酶所需的指令进行编码。詹森将这些酶命名为“与CRISPR相关的”酶，亦叫Cas酶 。 ⁵

防病毒机制

1989年，莫伊卡开始对其嗜盐微生物的DNA测序时，基因测序过程非常漫长。彼时，最终催生出快速测序方法的人类基因组计划刚刚起步。而到2003年莫伊卡专注于研究CRISPR的作用时，近200种细菌（以及人类与老鼠）的基因组测序已经完成。

当年8月，在阿利坎特以南约20千米的圣波拉，莫伊卡正在沙滩上度假。度假期间，他住在岳父岳母的房子里。在他看来，那并不是一段美好时光。他以一种尽职尽责的科学家的口气说：“夏天的沙滩酷热难耐，人潮涌动。我不喜欢沙子，也不喜欢在夏天待在沙滩上。我的妻子会躺在沙滩上晒太阳，而我则掉头离开，然后开车前往我在阿利坎特的实验室，在那里度过一天。虽然她在沙滩上过得很开心，但是对我来说，分析大肠杆菌序列能让我得到更多快乐。” ⁶

“间隔序列”令莫伊卡颇为着迷。看似普通的DNA片段出现在间隔序列中，而间隔区位于重复的CRISPR片段之间。莫伊卡将大肠杆菌间隔序列置于数据库中进行比对。他发现了一个有趣的现象：大肠杆菌的间隔序列与攻击大肠杆菌的病毒的序列一致。莫伊卡立刻惊呼：“噢，我的老天！”

莫伊卡对自己的发现确信无疑。一天晚上，他回到海滨别墅后，向自己的妻子解释该项发现。莫伊卡说：“我刚刚发现了一件惊人的事情。细菌有一套免疫系统。它们能够记住以往攻击它们的病毒。”妻子笑了，告诉莫伊卡自己并不太理解。但是妻子说，她相信这件事情一定举足轻重，因为莫伊卡非常激动。莫伊卡回答说：“几年后，你将看到，我刚刚发现的这一情况会登上报刊，载入史册。”对于这段话，莫伊卡的妻子并不相信。

莫伊卡已站在地球历史上最为漫长、规模最大、最为残酷的战争前线，这是细菌与病毒之战。此类病毒名叫“噬菌体”，会向细菌发动攻击。噬菌体是自然界中数量最为庞大的病毒种类。到目前为止，噬菌体的确是地球上数量最多的生物体，总数达10 ³¹ 个。每粒沙子上就有1万亿个噬菌体，超过所有生物体（包括细菌）数量的总和。一毫升海水中就有多达9亿个该类病毒。 ⁷

随着我们人类努力抗击新型病毒株，我们发现细菌耗费约30亿年与病毒作战颇具实际意义。几乎自地球生命诞生起，细菌和不停进化的病毒间便持续进行着一场紧张激烈的军备竞赛。细菌进化出抵御病毒袭击的复杂而细致的手段，而病毒则千方百计地攻破细菌的防御。

莫伊卡发现，面对含相同序列的病毒，含有CRISPR间隔序列的细菌具有免疫性，可以免受该病毒感染。但是，没有间隔序列的细菌的确会感染病毒。这是一套设计精巧的防御系统，但是它还有更加令人拍案叫绝的能力：该套系统能够适应新威胁。病毒入侵时，幸存的细菌能够合并该病毒的部分DNA，进而在子代细菌中形成针对该病毒的获得性免疫力。莫伊卡回忆道，自己发现这一现象后，激动得热泪盈眶。 ⁸ 有时，自然之美的确会令你情不自禁。

如此巧妙绝伦的发现的确令人震惊，它将产生巨大反响。但是莫伊卡在发表此项发现的相关论文的过程中，度过了极为艰难的时光。2003年10月，他向《自然》杂志递交了一篇论文，标题为《原核重复序列与免疫系统相关》。换言之，CRISPR系统是细菌获得对某些病毒的免疫力的一种方式。杂志编辑甚至未将该篇论文送审。编辑们错误地认为，该篇论文不存在以往CRISPR相关论文中未包含的内容。编辑们还宣称，莫伊卡并未提供实验室的相关实验结果，以证明CRISPR系统的有效性。该说法在一定程度上言之有理。

另外两家刊物也拒绝发表莫伊卡的论文。最终，莫伊卡在《分子进化杂志》上发表了自己的论文。该杂志虽然未享有盛誉，但却是一份能获得同行评议的刊物。就算是这本杂志，莫伊卡也不得不对效率低下的编辑死缠烂打。他说：“我积极行动，几乎每周都努力与编辑联系。每一周都糟糕透顶，如同噩梦。因为我知道，我发现了至关重要的东西。我知道，在某个时刻，其他人会获得同样的发现。我无法让编辑们了解，该项发现有多么重要。” ⁹ 2004年2月，该杂志接收了莫伊卡的论文，但直到10月才有了定论。2005年2月，论文才得以发表。那时距离莫伊卡获得该发现已过去两年。 ¹⁰

莫伊卡说，自己对自然之美的热爱推动自己前进。他有幸在阿利坎特进行研究，无须展示如何将研究成果转变为具有实用价值的产物。莫伊卡从未设法为自己发现的CRISPR申请专利。他说：“当你像我一样研究奇奇怪怪、生活在诸如盐池等非常规环境中的生物体时，好奇心是你唯一的动力。我们的发现似乎不可能适用于其他正常生物体。但我们错了。”

正如在科学史上令人们习以为常的情况一样，科学发现可能具有意料之外的用途。莫伊卡说：“在好奇心的驱使下开展研究时，你永远不知道，在某一天，这种研究将把你引向何处。”某些基础发现可能在以后产生广泛影响。莫伊卡告诉妻子，自己预测，未来某一天自己的名字将载入史册。结果证明，他的确有先见之明。

莫伊卡的论文是一个开端，它掀起了一波发表论文的浪潮。此类论文均提供了证据：CRISPR的确是细菌遭受新型病毒袭击时所使用的一种免疫系统。尤金·库宁（Eugene Koonin）在美国国家生物技术信息中心（NCBI）任职。一年之内，库宁就证明了CRISPR相关酶的作用是：抓取入侵病毒的DNA片段，随后将其融入细菌自身的DNA。该过程类似复制粘贴危险病毒的面部照片。尤金·库宁以此发展了莫伊卡的理论。 ¹¹ 但是，库宁和其团队犯了一个错误。他们猜测，CRISPR防御系统是通过RNA干扰发挥作用的。换言之，他们认为，细菌使用病毒“嫌犯”照片，从而找到干扰信使RNA的方法，而信使RNA携带着DNA编码的指令。

其他人也持相同看法。正因所有人观点一致，作为加利福尼亚大学伯克利分校RNA干扰研究的权威专家的珍妮弗·杜德纳最终意外接到一位同事的电话，这位同事当时正设法研究清楚CRISPR。 ZXMA3yF+jchnjolOacqs3/aiChWG6TmGuHrMOrz2ngZz7+uGT4JXQmutuyQ2HOuf