第二节
艾叶黄酮成分和分析方法

一 艾叶黄酮的成分分析方法

黄酮类化合物是指以2-苯基色原酮为基本母核的化合物，存在于植物的花、叶、果等器官当中，一般多以苷的形式存在。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗炎、镇痛和免疫调节、抗氧化、抗衰老等作用。

根据黄酮不同的理化特点，提取植物黄酮的方法有多种，应用较多的主要是：①超滤法，利用植物黄酮分子量小于1KDa的性质，通过超滤去除多糖和蛋白质大分子等杂质；②酶解法，加入酶破坏植物细胞壁，提高黄酮的释放量；③大孔树脂吸附法，原理是有些大孔树脂如D101、XDA-1 等，能够有效地吸附黄酮，提高提取量和纯度；④超临界CO ₂ 萃取法；⑤超声波提取法；⑥微波提取法等。

刘志成采用微波提取法提取艾叶黄酮，得出最佳提取条件是乙醇浓度60％，固液比1∶35，回流时间2小时，回流温度90℃，按这种方法提取艾叶中的总黄酮含量2.02％。

总黄酮的定量分析方法是用60％乙醇溶解的芦丁溶液作为标准溶液，在标准溶液和样品液中加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液、氢氧化钠溶液，摇匀静置后于510nm处检测吸光值，根据标准曲线回归方程计算总黄酮含量。

当不经过总黄酮提取，直接进行成分分析时，可以将艾叶粉碎，利用甲醇或乙醇溶液进行回流提取，减压蒸发去除溶剂，将所得滤液依次经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等进行萃取。各个提取部位经过色谱硅胶粗分后继续使用硅胶小柱、Sephadex LH-20 凝胶柱（氯仿∶甲醇为1∶1）对各组分进行分离纯化和重结晶，对得到的组分进行1H-NMR和13C-NMR的波谱分析，得到所得化合物的结构，从而根据文献确定化合物的名称。

对于已知的目标黄酮化合物，只需用甲醇提取艾叶组分，经过HPLC，在对应标准品的对照下，即可比较和分析目标黄酮化合物的含量。

二 艾叶黄酮的成分

1985年，我国学者吴崇明和屠呦呦首次分离得到了艾叶的两种黄酮类物质：5，7-二羟基-6，3’，4’-三甲氧基黄酮（eupatilin，异泽兰黄素）和5-羟基-6，7，3’，4’-四甲氧基黄酮（5-hydroxy-6，7，3’，4’ _{-tetramethoxyfla} vone）。Tan等于1992 年报道了艾叶中含有柚皮素（naringenin）、槲皮素（ _quercet in）这两种黄酮类成分。2003 年，Jeong从艾叶的甲醇提取物中分离得到6种黄酮类物质，包括5-羟基-3’，4’，6，7-四甲氧基黄酮、5，6-二羟基-7，3’，4’-三甲氧基黄酮、5，7，3’-三羟基-6，4’，5’-三甲氧基黄酮、5，6，4’-三羟基-7，3’-二甲氧基黄酮、高车前素、5，6-二羟基-7，4’-二甲氧基黄酮，均能抑制蛋白转移酶的活性。

王锦军等发现艾叶总黄酮存在于乙酸乙酯提取部分，对乙酸乙酯提取部分进行纯化和重结晶得到6种化合物，其中4个属于黄酮类化合物：芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素。进一步利用反相高效液相色谱法检测槲皮素、山奈酚、木犀草素、芹菜素在艾叶中的含量分别为0.754mg/ _g 、0.841mg/ _g 、1.629mg/ _g 、0.79mg/ _g 。吉双等在两次实验中，以不同的溶剂萃取艾叶提取液，得到异泽兰黄素、棕矢车菊素、圣草酚、鼠李素、高车前素5 种黄酮类物质。唐生安等从艾叶乙酸乙酯萃取物中分离得到5，7，3’-三羟基-3，6，4’-三甲氧基黄酮醇（矢车菊黄素）、5，3’-二羟基-3，6，7，4’-四甲氧基黄酮醇（紫花牡荆素）、5，7-二羟基-6，3’，4’-三甲氧基黄酮（异泽兰黄素）、5，7，4’-三羟基-6，3’-二甲氧基黄酮（棕矢车菊素）4种黄酮类化合物。

2010年之后，艾草黄酮类物质的分离和结构鉴定逐渐增多。学者王晓琴、马麟、魏海胜等在各自的研究中利用不同的方法，新发现了芹菜素、异鼠李素、苜蓿素、芒柄花素、金圣草黄素等存在于艾草中。

三 艾叶黄酮的主要活性成分——异泽兰黄素和棕矢车菊素

异泽兰黄素（见图2-2）是艾草的主要亲脂性黄酮，在抑制巴豆油导致的耳肿胀实验中，异泽兰黄素的IC ₅₀ 值（0.28μmol/cm ² ）与吲哚美欣IC ₅₀ 值（0.26μmol/cm ² ）相当，仅比氢化可的松的IC ₅₀ 值（0.03μmol/cm ² ）低1个数量级。多项研究证实异泽兰黄素具有多种生物活性，异泽兰黄素能降低破骨细胞的数量，降低小鼠关节炎评分以及TNF-α刺激条件下滑膜细胞所产生的IL-6和IL-1β。一方面，它也被发现可以抑制RANK配体引起的骨质疏松症，伴随着Akt，GSK3β，ERK，IκB磷酸化水平的下降以及c-Fos、NFATc1 在蛋白水平的下降，说明异泽兰黄素可能发挥着一种转录抑制作用。另一方面，通过作用在actin上使破骨细胞的细胞骨架重组，抑制多核细胞的细胞骨架重组，发挥着抗骨质疏松的作用。

韩国嘉川大学Sapkota Arjun等的研究表明异泽兰黄素通过抑制LPS刺激条件下小胶质细胞的IL-6、TNF-α和PGE2 的释放，在小鼠短暂性大脑局部缺血模型中发挥神经保护作用。在信号通路方面，异泽兰黄素可以抑制局部缺血大脑中NF-κB信号通路活性，降低IKKα/β磷酸化水平，进而降低IκBα磷酸化水平和降解。

棕矢车菊素（见图2-3）是艾草另外一种生物活性较高的黄酮类成分。研究显示，棕矢车菊素抑制环氧化酶-2活性的能力强，IC ₅₀ 值为2.8μmol/L，与来自菊科植物的30种黄酮的抗炎活性比较，棕矢车菊素的活性最高。韩国庆北国立大学的Nam Youngpyo等发现，棕矢车菊素能缓解小鼠实验性过敏性脑脊髓炎，减弱胶质细胞在胶质细胞-神经母细胞瘤共培养体系中的神经毒性，减少炎性激活状态下胶质细胞的NO释放量以及促炎因子的表达量。

由于异泽兰黄素和棕矢车菊素的药理活性非常突出，逐步得到研究者的重视，已经有学者提出将艾草中这两种成分的含量作为艾草质量控制的指标。周倩等利用高效液相色谱法和反相高效液相色谱法建立了醋艾叶的指纹图谱，以异泽兰黄素和棕矢车菊素作为艾叶质量控制的指标性成分，可用于区别野生艾叶和药用艾叶。任伟光等采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术（UPLC-Q-TOF/MS），发现艾叶乙酸乙酯提取物中的主要成分为棕矢车菊素、异泽兰黄素、β-谷甾醇，并且3 种成分都具有抑制EGFR激酶活性的作用。在湖北、湖南和河南产地的艾叶UPLC-Q-TOF/MS分析图谱中，棕矢车菊素和异泽兰黄素是艾叶中的主要化学成分，可以作为艾叶的质量控制指标。进一步采用RP-HPLC（反相高效液相色谱）检测浙江宁波、湖北蕲春、河南南阳、河南汤阴、河北安国、山东临沂等地的艾叶，结果表明，不同产地棕矢车菊素含量差异较小，但不同产地艾叶中异泽兰黄素含量差异较大。以淮河为分界线，淮河以南的浙江宁波、湖北蕲春、湖北襄阳、河南南阳的艾叶中异泽兰黄素含量差别较小；淮河以北地区的汤阴艾叶（北艾）和安国艾叶（祁艾）异泽兰黄素含量相对较高，其他地区艾叶（山东临沂、河北博野）异泽兰黄素含量较低。

综上所述，艾叶黄酮类成分是艾叶的主要成分，并且具有多种有益于健康的生物活性，艾叶黄酮的分离提取以及检测技术正在快速发展。艾叶黄酮类成分棕矢车菊素和异泽兰黄素是功效显著的主要成分，有望逐步发展为艾叶质量鉴定的指标性成分。 lNsvBVlucRIAVE6G0gQgdBONd+1Su6T3RS5zFuIv7ccQ7dmLMSvH9dX2XMwZ+5Bx