实验十三
总糖和还原糖的测定（3,5 二硝基水杨酸法）

一、实验目的

1.掌握还原糖和总糖的测定原理。

2.学习用3,5二硝基水杨酸法（DNS）测定还原糖的方法。

二、实验原理

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，具有还原性。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后，被还原为棕红色的3氨基5硝基水杨酸。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅呈线性关系。在540nm波长处有最大吸收，利用分光光度计测定光密度值，利用比色法便可测定样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验器材与试剂

1.仪器、用具：紫外可见分光光度计、电子分析天平、离心机、恒温水浴锅、沸水浴锅、电磁炉、试管、吸管、容量瓶、白瓷板、pH试纸（1~14）、量筒、研钵、三角烧瓶、玻璃漏斗。

2.材料：藕粉、山芋粉或其他植物材料。

3.试剂：

（1）标准葡萄糖溶液（1.0mg/mL）：准确称取干燥恒重的无水葡萄糖100mg,溶于蒸馏水并定容至100mL,混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g DNS和262mL2mol/L NaOH溶液加到500mL石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1 000mL,贮于棕色瓶中备用。

（3）6mol/L HCl：取250mL浓HCl（35%~38%），用蒸馏水稀释到500mL。

（4）6mol/L NaOH：称取24g NaOH溶于蒸馏水并稀释至100mL。

（5）碘-碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。

四、实验步骤

1.葡萄糖标准曲线的制作

取干净试管6支，按表3-1进行操作。以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标作图的标准曲线。

2.样品中还原糖的提取和测定

准确称取0.5g藕粉，加蒸馏水约3mL,在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30mL的蒸馏水冲洗研钵2~3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温0.5小时，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到100mL离心管中，于4 000r/min离心5min,沉淀用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100mL混匀，作为还原糖待测液。取1mL进行还原糖的测定。

3.样品中总糖的水解、提取和测定

准确称取0.5g藕粉，加蒸馏水约3mL,在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12mL的蒸馏水冲洗研钵2~3次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10mL,搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5小时，取出1~2滴置于白瓷板上，加1滴I ₂ -KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。水解完毕，冷却至室温后用6mol/L NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100mL,过滤，取滤液10mL,用蒸馏水定容至100mL,即成稀释1 000倍的总糖水解液。取1mL总糖水解液，测定其还原糖的含量。

五、实验注意事项

1.使用离心机时一定要注意相对两个离心管的平衡。

2.样品中总糖的水解，要保证水解完全，沸水浴时试管封口，避免体积误差。

3.可根据具体情况决定稀释液倍数，有时候可超过标示倍数。

六、作业

按照式3-1,式3-2分别计算藕粉中还原糖和总糖的百分含量。

式中： ω （还原糖）——还原糖的质量分数（%）；

ω （总糖）——总糖的质量分数（%）；

C ₁ ——还原糖的质量浓度（mg/mL）；

C ₂ ——水解后还原糖的质量浓度（mg/mL）；

V ₁ ——样品中还原糖提取液的体积（mL）；

V ₂ ——样品中总糖提取液的体积（mL）；

m ——样品的质量（mg）。 1rah8Bw9D1cEcB4kwX5arMKCCHBe4Qg0yXbEfn9yMjBNHPzC0hPIIXx7DZ3n/Yrj