实验十一
质粒DNA的提取及鉴定

一、实验目的

1.掌握碱裂解法少量制备质粒DNA的原理和方法。

2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

3.掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

二、实验原理

细菌质粒是一类存在于细胞质中双链、闭环的DNA,独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成分。目前有多种方法可用于质粒DNA提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离。当菌体在NaOH和十二烷基硫酸钠溶液（SDS）中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，共价闭环质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，而线性染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或构象有所不同的生物大分子，尤其是蛋白质和核酸。分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在pH高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。质粒有三种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA;开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA一条链断裂；线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA两条链发生断裂。这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此电泳后呈三条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。

三、实验器材与试剂

1.仪器、用具：恒温摇床、台式离心机、高压蒸汽灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪、电炉子。

2.材料：大肠杆菌。

3.试剂：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液（10mmol/L Tris HCl;1mmol/L EDTA,pH8.0）、胰RNA酶、酚、氯仿、Luria Bertani培养基（胰蛋白胨10g/L;酵母提取物5g/L;氯化钠10g/L,pH7.4）、氨苄霉素（Ampicillin）、凝胶加样缓冲液[30mmol乙二胺四乙酸（EDTA）;36%（ v / v ）甘油；0.05%（ w / v ）二甲苯腈蓝FF;0.05%（ w / v ）溴酚蓝]、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、1×Tris-硼酸（TBE）缓冲液（45mmol/L Tris-硼酸；1mmol/L EDTA,pH8.0）。

四、实验步骤

1.质粒的提取

（1）将2mL含氨苄霉素（100μg/mL）的Luria-Bertani液体培养基加入灭菌试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，放入恒温振荡培养箱，37℃振荡培养过夜。

（2）取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4 000r/min离心2min。吸取上清液，使细胞沉淀尽可能干燥。

（3）将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，剧烈振荡打散菌体，室温放置10min。

（4）加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖混匀，将离心管置于冰上5min,使液体由混浊变为透明黏稠。

（5）加入预冷的150μL溶液Ⅲ，盖紧管盖，温和颠倒离心管数次，冰上放置15min。

（6）向上清液中加入等体积酚：氯仿（1∶1）混合液，反复混匀，12 000r/min离心5min,将上清液转移到另一离心管中。

（7）向上清液中加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12 000r/min离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣，吸水纸上吸干液体。

（8）用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，室温静置15min干燥。

（9）加20μL TE缓冲液，使DNA完全溶解，用于定量分析、电泳检测等。

2.质粒的鉴定

（1）制备琼脂糖凝胶：称取100mg琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL1×TBE缓冲液，加热至完全融化，待温度降至60℃左右时，加入EB摇匀，则为1%琼脂糖凝胶。

（2）胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净晾干。将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面。待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内，加电泳缓冲液至电泳槽中。

（3）加样：用移液枪将已加入加样缓冲液的DNA样品加入加样孔。

（4）电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

（5）检测：在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出橘红色荧光条带。

五、实验注意事项

1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，如不小心沾到皮肤上，应立即用大量清水冲洗，随后用碱性溶液或肥皂水洗。

2.DNA电泳上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速按出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。

六、作业

1.质粒提取使用的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ分别有什么作用？

2.DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤？ npWCD2YzysaAI2T6E9pVB7jT9y2kShnKndA9qROIiJ9QQe5nwww69R2ykWgwHCAN