实验六
叶绿体的分离与荧光观察

一、实验目的

1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

2.熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。

二、实验原理

叶绿体是植物细胞的能量转换站，光合作用在叶绿体中进行。叶绿体是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。在等渗溶液中进行组织匀浆，叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体损伤。将匀浆液在1 000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3 000r/min的条件下离心5min,即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，荧光的观察受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。本实验就是利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。

三、实验器材与试剂

1.仪器、用具：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、滴管、离心管、试管架，纱布若干、无荧光载玻片和盖玻片等。

2.材料：新鲜菠菜。

3.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液、0.01%吖啶橙（acridine orange）。

四、实验步骤

1.叶绿体的分离与观察

（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗和叶脉，称10g于50mL0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机，低速（5 000r/min）匀浆3~5min。

（2）将匀浆用2层纱布过滤于10mL烧杯中。

（3）将滤液装入离心管中，在1 000r/min下离心2min,弃去沉淀。

（4）将上清液在3 000r/min下离心5min,弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

（5）将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。

（6）取上述叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察：

①在普通光镜下观察。

②在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。

③在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光，取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察。

2.菠菜叶手切片观察

用剃须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖玻片后轻压，置显微镜下观察。

（1）在普通光镜下观察。

（2）在荧光显微镜下观察其直接荧光。

（3）观察其间接荧光：向所制手切片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min,洗去余液，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光。

五、实验注意事项

1.差速离心时要控制离心速度和时间，否则会影响叶绿体的观察，甚至可能无法分离出叶绿体。

2.差速离心分离出叶绿体时，其中含有部分细胞核碎片，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度梯度离心法。

3.要注意使用荧光显微镜的方法和操作，切勿弄错步骤，否则会损坏仪器。

六、作业

1.在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？

2.游离叶绿体和细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，其颜色和强度（光强）有无差异？为什么？ r3rI/4pCW8Cm9UZqSwJxXjyfxVjs2vSY6X57cSgJChyE7cwsE8XMMQ8dTrdsetSW