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实验五
植物染色体标本的制备与观察

一、实验目的

1.掌握常规压片法制备染色体标本的基本原理和方法。

2.了解细胞周期过程中染色体的动态变化。

二、实验原理

染色体是遗传物质的载体。植物染色体标本的制备,常用分生组织如根尖、茎尖或幼嫩的叶片做实验材料。常规压片法是观察植物染色体的常用方法,其程序包括取材、预处理、固定、解离、染色和压片等步骤。但常规压片法也有不足,染色体常不能完全散开,容易重叠、变形、断裂,影响显带结果,核型分析较困难。对植物细胞去壁低渗处理,可以弥补以上不足,方法也较为简单,无需特殊设备,能取得很好的效果。借助纤维素酶和果胶酶将细胞间的果胶和纤维素溶解掉,使植物细胞只有质膜,再进行染色并压片制备植物染色体标本,可显著提高染色体的分散程度,分散良好的标本片可用于染色体计数、组型分析、显带、显微操作、原位杂交等分子细胞遗传学研究领域。

三、实验器材与试剂

1.仪器、用具:光学显微镜、恒温培养箱、剪刀、镊子、刀片、培养皿、吸水纸、滴管、载玻片、盖玻片。

2.材料:小麦根尖。

3.试剂:0.1%秋水仙素溶液、Carnoy固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)、1mol/L HCl、亚硫酸水溶液(漂洗液)、纤维素酶、果胶酶、改良苯酚品红染色液(Carbor fuchsin)。

四、实验步骤

1.取材:将小麦培养在培养皿中,25℃温箱发芽,待胚根长达1~2cm时,剪取0.5cm长的根尖部分。

2.预处理:剪下根尖浸入0.1%的秋水仙素溶液中,室温下处理3~4小时。也可将剪下的根尖放置冰箱,在0~3℃条件下处理24小时,使分裂的细胞尽可能集中于分裂中期。秋水仙素处理能使大量细胞分裂停留在中期,有助于观察染色体。

3.固定:将经过处理的根尖材料用水洗净,放入Carnoy固定液固定2h,换入70%的酒精,使细胞的分裂活动处于停滞状态,冰箱中保存备用,保存时间最好不超过两个月。

4.解离:将固定好的根尖用水漂洗5次,每次3min,取出根尖放入1mol/LHCl(58~60℃解离对比)解离14~15min,软化去除细胞壁及果胶物质,使细胞易于分散。自来水冲洗,再加入1%纤维素酶和果胶酶混合酶液1mL,在28℃温箱中酶解30min。

5.洗涤:吸取酶液,加蒸馏水慢慢冲洗3~5次,最后置于蒸馏水中,低渗30min。低渗处理使细胞体积增大,染色体分散,容易观察计数。

6.染色:将根尖置于载玻片中央,用刀片将根管和伸长区去掉,只留乳白色的分生区,用改良苯酚品红染色液染色5~10min,盖上盖玻片。

7.压片:在盖玻片上面覆以吸水纸,用拇指垂直压片,然后用铅笔的橡皮头轻轻均匀地在同一个方向敲打盖玻片,使细胞和染色体分散,直至材料呈雾状。

五、实验注意事项

1.植物根尖生长点与茎生长点,不存在G0期,不断分裂,所以一般取根尖实验。

2.秋水仙素处理,能使大量细胞分裂停留在中期,有助于观察染色体。

3.低渗溶液使细胞体积增大,染色体分散,容易观察计数。

六、作业

1.简述前处理过程中加入秋水仙素的作用,以及酸解的时间和温度对染色体标本制片质量的影响。

2.绘制1张有丝分裂中期细胞染色体图像,简要说明其染色体特征。 BGyseIm3/3NtyY9w24KbTM2tgDvoBxQSaVIf9QjWYUwB89TBWXEK5AZ7XKKybYWq

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