实验四
植物细胞微丝束的光学显微镜观察

一、实验目的

1.掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。

2.了解植物细胞骨架的结构特征。

二、实验原理

细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系，广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。细胞骨架对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。

微丝、微管和中间纤维都是直径很小的结构，最大的单根微管直径25nm左右，只能在电镜下观察到。光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）处理细胞，细胞骨架在一些情况下不稳定：如高压、低温、锇酸处理等。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，细胞膜溶解，质膜结构中及细胞内许多蛋白质也会溶解，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏而保存下来，这样经TritonX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。M缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，再用考马斯亮蓝R250染色，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。

三、实验器材与试剂

1.仪器、用具：光学显微镜、镊子、剪刀、试管、表面皿、滴管、载玻片、盖玻片。

2.材料：新鲜洋葱鳞茎。

3.试剂：

（1）M缓冲液（pH7.2）各成分终浓度为：

50mmol/L咪唑；　50mmol/L KCl;

0.5mmol/L MgCl ₂ ·6H ₂ O;　1mmol/L EGTA;

0.1mmol/L EDTA-2Na;　1mmol/L DTT

（2）6mmol/L PBS磷酸缓冲液（pH6.5）（KH ₂ PO ₄ ∶Na ₂ HPO ₄ ·2H ₂ O=7∶3）

（3）0.7% NaCl生理盐水

（4）1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）溶于M缓冲液

（5）3%戊二醛100mL（25%戊二醛12mL,PBS 88mL）

（6）0.2%考马斯亮蓝R250染液200mL（考马斯亮蓝R250 0.2g;甲醇46.5mL;冰乙酸7mL;蒸馏水46.5mL）

附：各种主要试剂的作用

①聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）作用：非离子去垢剂；适当浓度的Triton X 100可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。

② M缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压。

③ EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca ²⁺ ，主要是高浓度的Ca ²⁺ 可使微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca ²⁺ 的浓度。

④戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持原有状态。

⑤考马斯亮蓝作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。

四、实验步骤

1.撕取洋葱鳞茎内表皮约1cm ² ,放入盛有5mLpH为6.8的磷酸盐缓冲液的小培养皿中，浸泡5min。

2.吸去磷酸盐缓冲液，用3mL1%TritonX-100室温处理洋葱表皮120min。

3.除去TritonX-100,用3mLM缓冲液充分洗3次，每次约3min。

4.加5mL3%戊二醛固定20min。

5.用3mL磷酸缓冲液洗3次，每次10min。

6.取3mL0.2%考马斯亮蓝R250染色20~30min。

7.用蒸馏水洗数遍，降低背景。

8.将样品置于载玻片上，加盖玻片压片，在光学显微镜下观察。

五、实验注意事项

1.撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉，样本要展开铺平，去垢处理要掌握好时间和温度。

2.染色时间需掌握好，必要时可不同时间分别染色，观察时选择染色适中的平展部位观察。

3.染色时统一到水槽旁边染色，不要污染桌面，滴加染液时要小心，不要使手被染色。

六、作业

1.光镜下观察到的细胞骨架有何形态特征？

2.画出所观察到的微丝图像。 8cS2o8A0lFnkhGPiMXXDMLJbf5+a94zkmqLIvCN0uXkMOML75VJgChfPN9KhGWid