实验二
植物制片的染色及显微化学鉴定方法

一、实验目的

1.掌握植物临时装片的制备方法、植物细胞的基本结构及其特点。

2.学习植物制片的一般染色方法。

3.掌握常用显微化学鉴定法，即细胞壁化学组成及细胞主要内含物性质的鉴定方法。

二、实验原理

标本制备技术是成功进行显微观察的关键，植物制片技术，将植物材料制成适合显微镜观察的薄片是植物显微技术的重要组成部分，一般是为了观察植物内部细微结构。根据保存时间，可分为临时制片和永久制片。为了使植物制片的不同细胞或组织表现出明显的区别，更好地弄清楚细微结构，一般会对制片进行染色。根据来源不同，染色剂可分为天然染料和合成染料。天然染料，从动植物体中提取纯化而成，如苏木精从苏木中提取，可对细胞核染色，用苏木精染色时需要媒染剂，通常的媒染剂是硫酸铝铵、硫酸铁铵、铜盐等溶剂，染色效果与媒染剂的性质和染色后处理方法有关，遇酸呈红色，遇碱呈蓝色。合成染料常用的有番红、固绿，番红为碱性红色染料，适用于木质化、角质化、栓质化的细胞壁以及细胞核中的染色质、染色体和花粉外壁的染色。

显微化学鉴定法是指将材料处理后，在显微镜下观察、判定细胞壁的化学组成及细胞内含物性质的方法，广泛应用于对植物器官、组织和细胞内含物的研究工作中，也应用于分辨细胞结构的观察中。化学鉴定法适用于徒手切片法切成的薄片材料的观察，但切片不能太薄，否则材料中内含物太少，化学反应效果不明显，材料的厚度在20~40μm较为适宜。

三、实验器材与试剂

1.仪器、用具：显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、染色缸、剃刀或双面刀片等。

2.材料：菠菜、洋葱鳞茎、芹菜叶柄、土豆块茎、花生种子等。

3.试剂：酒精、碘-氯化锌、盐酸-间苯三酚、苏丹Ⅲ、碘-碘化钾、10%氯化铁、盐酸、蒸馏水等。

四、实验步骤

1.制作临时装片

用镊子将洋葱鳞叶表皮或新鲜菠菜叶下表皮撕下剪成3~5 mm的小片。在载玻片上滴一滴水，将剪好的表皮浸入水滴内（注意表皮的外面应朝上），并用解剖针挑平，再加盖玻片。加盖玻片的方法是先从一边接触水滴，另一边用解剖针顶住缓缓放下，以免产生气泡。如盖玻片内的水未充满，可用滴管吸水从盖玻片的一侧滴入；如果水太多浸出盖玻片外，可用吸水纸吸去多余的水，这样装好的片子就可以进行镜检。

2.徒手切片法

做徒手切片时，先进行切片的准备工作，用左手的拇指和食指夹住实验材料，注意松紧适度，大拇指应低于食指2~3 mm,以免被刀片割破。使材料伸出食指外2~3 mm,并以无名指顶住材料，右手平稳地拿住刀片并与材料垂直。切片时为了避免材料干枯，在材料上端和刀刃上均匀地滴上清水，并使材料呈直立方向，刀片呈水平方向，再用右手的臂力，不要用腕力及指力，由左前方向右后方拉切，切成极薄的薄片（愈薄愈好），拉切的速度宜较快，不要中途停顿。连续地切下数片后，将刀片放在培养皿的清水中稍一晃动，切片即漂浮于水中。好的切片应该是薄且透明、组织结构完整，否则要重新进行切片。初切时必须反复练习，从中选取最好的薄片进行装片观察。

对于过于柔软的器官如叶片，很难直接拿在手中进行切片，这时就要夹在维持物中，一般选用莴苣茎、胡萝卜根或者泡沫塑料将要切的材料夹在其中，然后进行切片。

对经检查符合要求的切片，如果只作临时观察，可封藏在水中进行观察。若要更清楚地显示其组织和细胞结构，也可简易染色，以使结构更便于观察，也可选择一些切片进一步通过固定、染色、脱水、透明及封藏等步骤，做成永久玻片标本。

3.常用显微化学鉴定法

（1）细胞壁化学组成显微化学鉴定法

细胞壁的化学成分主要是纤维素和木质素，还有一定量的栓质、角质和果胶等。本实验主要学习纤维素和木质素的鉴定方法。

纤维素化学鉴定法：纤维素是植物细胞壁的最主要成分，常用鉴定方法有三种：

①碘-碘酸法：将切片材料置于载玻片上，滴1%碘液，随后再加一滴66.5%的硫酸使纤维素水解。处理后，纤维素细胞壁呈蓝色反应。由于硫酸可将纤维素水解成胶态纤维素，遇碘后呈现蓝色反应。纤维素的成分越多，则蓝色愈明显。

②氯化锌-碘法：一般应用此法测定纤维素，效果比碘-碘酸法更佳。纤维素细胞壁在碘-氯化锌溶液的作用下呈现紫蓝色。

③碘-磷酸法：

试剂的配置方法如下：

配制时要微加热，使其溶解。将此液滴在切片材料上，如细胞壁含有纤维素，则呈现深紫色的反应。

在大多数情况下，应用“氯化锌-碘法”比用“碘-硫酸法”更为方便。但由于组成此种试剂的各种成分的浓度不同以及材料性质不同，反应也常常不同，在有些情况下不一定有良好的效果。

木质素化学鉴定法：某些植物的细胞壁含有木质素，特别是输导组织中的导管和管胞以及机械组织中的纤维和石细胞等细胞木质化程度更甚。木质素鉴定最常用的方法是盐酸间苯三酚反应法，步骤如下：将切片材料置于载玻片上，滴一滴盐酸间苯三酚于材料上，在酸化作用下，木质化细胞壁经盐酸间苯三酚试剂处理后呈现紫红色或樱红色。木质化程度越强，颜色则愈深。

（2）细胞内含物的化学鉴定法

①淀粉的鉴定：淀粉是植物中最主要的储藏物质，在不同植物细胞中呈现不同形状。用碘液处理时，淀粉与碘反应形成碘化淀粉，呈现蓝色，是唯一的淀粉颜色显微化学反应剂。

②蛋白质的鉴定：植物细胞内储存的蛋白质常以糊粉状固体颗粒存在。常用的鉴定方法有碘试剂法和曙红-酒精苦味酸法。本实验采用碘试剂法，此法简单且可与鉴定淀粉同时进行。在切片材料上滴上碘试剂后，蛋白质被染成黄色，而淀粉则染成蓝紫色。另外，除蛋白质以外，有些其他物质也可以染成黄色，但是这些物质经水洗后均可除掉。

③鉴定脂肪和油常用的方法是用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ酒精溶液染色，脂肪和油遇苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ酒精溶液被染成橘红色，染色时微微加热可以加速染色。

五、实验注意事项

1.徒手切片时，重要的是要切下一小片平而薄的组织，而不是切下一个完整的切片。

2.显微鉴定时所用材料的切片宜较厚，过薄的切片反而得不到良好的结果，但鉴定某些酶的切片，则须切得很薄。

六、作业

1.简述角质与栓质的测定方法与原理。

2.植物显微化学鉴定的特点和意义。 afZcuXNwV0W4YTEBf+Czhsh/0kbqDr4l8LECP84uSVLUPMP8Yioocdo4Fzd08qzD