第四节
细菌的生化特性

一、糖类代谢试验

1.糖（醇、苷）类分解试验

（1）原理：细菌对于糖（醇、苷）类的代谢，可分为需氧和厌氧两种。需氧代谢过程可将糖（醇、苷）类完全氧化，分解生成CO ₂ 和水；厌氧代谢过程对糖（醇、苷）类进行不完全分解（发酵），生成多种产物（如酸类等）。根据细菌对糖（醇、苷）类不同的分解能力进行细菌种类的鉴定，可用指示剂和发酵管检验。

（2）试验方法：取少许待检菌接种后培养，每天观察并记录结果，根据需要可培养观察10天以上。

（3）结果判断：若待检菌分解糖（醇、苷）类产酸、产气则培养液变为粉红色，且在倒置的发酵管内有气泡形成，记产酸产气、反应阳性（⊕）；若仅产酸则培养液变粉红色，发酵管内无气泡，记产酸、反应阳性（+）；若不产酸则培养液不变色，发酵管内无气泡，记反应阴性（-）（图1-4-1）。

（4）注意事项

① 进行细菌种类的一般鉴定时，仅选用最有鉴别意义的糖（醇、苷）类。

② 对生长苛刻、营养要求较高的细菌需加入所需营养成分，如猪链球菌需在培养基中加入5%～10%的动物血清，副猪嗜血杆菌需在培养基中加入V因子和5%～10%的动物血清等。

③ 培养基中蛋白胨的用量宜少，以免细菌利用蛋白胨产生过多碱而中和分解糖（醇、苷）类所产的酸，导致假阴性结果。

④ 用接种针或环取细菌纯培养物少许逐管进行接种时，注意使细菌充分乳化分散于培养液中；或用无菌的微量滴管吸取待检菌后，滴加1滴（约20µl）即可。

⑤ 试验中如无特殊需要，对多种糖（醇、苷）类进行试验时，仅在葡萄糖管中加入发酵管，以观察分解葡萄糖是否产气，其他糖（醇、苷）类管均可不加。也可在液体培养基中加入0.3%～0.5%的琼脂使其成为半固体培养基，然后再进行穿刺接种。

2.葡萄糖氧化-发酵试验（O-F试验）

（1）原理：不同细菌在有氧或无氧条件下对葡萄糖的分解能力及代谢产物不同，有氧条件下称为氧化（氧化型，O），无氧条件下称为发酵（发酵型，F），不分解葡萄糖称产碱型（NR）。葡萄球菌和肠杆菌科的细菌均为发酵型。

（2）试验方法：取纯培养的细菌同时穿刺接种2管，接种后1管滴加0.5～1cm灭菌液体石蜡于培养基液面以隔绝空气，另一管不加，2管同时在36℃恒温箱培养24～48h，观察结果。

（3）结果判断：两管均产酸变色为发酵型；两管均不变色为产碱型，仅开放管产酸变色而滴加液体石蜡管不变色为氧化型（图1-4-2）。

（4）注意事项

① 对于制备后保存时间较长的培养基，临用前需置沸水10min，以驱逐培养基中可能存在的氧气，迅速冷却后进行接种。

② 常用于培养基表面封口的试剂有以下两种。一是液体石蜡，在100ml液体石蜡中加1ml水，高压灭菌备用；二是凡士林与液体石蜡等量混合，高压灭菌后置110℃干热箱中烤干水分备用。

③ 对于阴性反应结果，需延长培养时间做最终判定。在记录结果时，一般用O（氧化）、F（发酵）和NR（产碱）符号表示，不用阳性或阴性表示，以免误解。

④ 质控菌株，建议氧化型细菌用铜绿假单胞菌ATCC27853、发酵型细菌用大肠埃希菌ATCC25922、产碱型细菌用粪产碱杆菌。

3.β半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

（1）原理：细菌分解乳糖需两种酶，一是β半乳糖苷渗透酶，可以使乳糖分子向细菌内渗透；二是半乳糖苷酶，能将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖。同时含有上述两种酶的细菌能快速分解乳糖；具有半乳糖苷酶的细菌，只能在24～48h内迟缓发酵乳糖；缺乏这两种酶的细菌不能分解乳糖。所有快速发酵或迟缓发酵乳糖的细菌均可分解邻硝基β半乳糖苷（ONPG），生成黄色的邻硝基酚。本试验用于测定不发酵或迟缓发酵乳糖的细菌是否产生半乳糖苷酶，可快速鉴定迟发酵乳糖的细菌，如亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。

（2）试验方法：挑取纯培养的细菌菌落混悬于无菌生理盐水中制备成浓厚菌悬液，加入甲苯1滴，充分振摇，将试管置于37℃水浴中5min，加入ONPG溶液0.25ml，混匀，置于37℃水浴，于30min、1h、3h和24h观察结果。

（3）结果判断：出现黄色判为阳性反应，通常在20 ～ 30min显色；不出现黄色可继续培养24h作最终判定，无色为阴性（图1-4-3）。

（4）注意事项

① 本试验结果是以出现黄色判为阳性，不适合对产黄色素细菌的检验。

② ONPG溶液不稳定，培养基呈黄色即不可使用。

③ 质控菌株，建议大肠埃希菌ATCC25922作为阳性对照，奇异变形杆菌ATCC49005作为阴性对照。

4.三糖铁琼脂试验（TSI试验）

（1）原理：三糖铁琼脂含有乳糖、蔗糖和葡萄糖（比例为10 ∶ 10 ∶ 1）。因培养基中葡萄糖的含量低，分解葡萄糖的细菌生成少量的酸，因接触空气而被氧化，使斜面逐渐变成红色；底部厌氧环境中的酸不被氧化，仍保持黄色。发酵乳糖和蔗糖的细菌则产生大量的酸，使培养基底部和斜面均呈现黄色。某些细菌能生成硫化氢（H ₂ S），硫化氢和培养基中的铁离子反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。本培养基用于鉴别肠道菌发酵蔗糖、乳糖、葡萄糖及产生硫化氢的生化反应。

（2）试验方法：用接种环挑取待检菌的新鲜纯培养物，穿刺接种至培养基2/3深度，并涂布斜面，置培养箱36℃±1℃培养18～24h。

（3）结果判断：若底部变黄，则分解葡萄糖产酸（acid，A）；若底部、斜面均变黄，表明分解乳糖和（或）蔗糖产酸（A）；若培养基变为红色，表明不分解葡萄糖、乳糖和（或）蔗糖，并有产碱（K）反应。需氧菌底部不生长，斜面变色；兼性厌氧菌底部、斜面均变黄；有的细菌对糖不分解，无产碱反应，在三糖铁琼脂培养基内生长，不变色（NC）。记录结果的顺序：斜面反应/底部反应/产气现象/H ₂ S产生。一般具体记录方式为：①酸/酸（A/ ）；②碱/酸（K/A）；③酸/酸，产气（A/ ）；④碱/碱（K/K）；⑤酸/酸，产H ₂ S（A/A，H ₂ S）；⑥无变化/无变化（-/-，或NC/NC）；⑦碱/无变化（K/-，或K/NC）；可疑反应用V表示（结果不定）（图1-4-4）。

（4）注意事项

① 本试验普遍适用对肠杆菌科细菌的初步鉴定。但有些肠杆菌如变形杆菌、沙门菌、志贺菌之间有相似反应，应与尿素酶试验同时进行。

② 本试验可采用克氏双糖铁琼脂（KI），不含蔗糖，制备与TSI相同，接种、培养、结果判定等与TSI基本一致，但KI常应用于大肠埃希菌的初步鉴定。KI虽可代替TSI，但两者的反应有所不同，因不发酵乳糖而发酵蔗糖的细菌在斜面上有不同的反应结果，如沙门菌在KI上为K/ （图1-4-5），在TSI上为A/ 。

③ 培养基最好现配现用，或在临用前融化并重新凝固后使用。

④ 应使用接种针进行细菌接种，避免使用接种环。因后者可能会造成培养基琼脂破裂，影响结果观察。结果观察判定一般在培养18～24h进行，时间过短可能会因糖发酵还未产生足够量的酸使指示剂改变颜色，时间过长则有可能因细菌利用蛋白胨产碱后改变pH，从而改变培养基颜色。

（5）质控菌株及结果判断见表1-4-1。

5.甲基红试验（MR试验）

（1）原理：某些细菌分解葡萄糖形成丙酮酸，丙酮酸进一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH下降至4.5以下。因甲基红指示剂变色范围pH4.4（红色）～6.2（黄色），加入甲基红指示剂即变为红色；一些细菌虽能分解葡萄糖，但产酸量少或将酸进一步分解为醇、酮、醛等中性产物，使培养基pH＞6.2，加入甲基红指示剂变为黄色。该试验大肠埃希菌阳性、溶液呈红色，产气肠杆菌阴性、溶液呈黄色，可用于两者的鉴别。

（2）试验方法：将待检细菌的纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，36℃±1℃或30℃培养2～5天。滴加1～2滴甲基红试剂后立即观察结果。

（3）结果判断：呈红色为MR试验阳性，呈橘红色为弱阳性，记为MR+；呈橘黄色或黄色为阴性，记为MR-。培养至第5天仍为阴性，即可判定结果（图1-4-6）。

（4）注意事项

① 接种细菌的量应一致，菌液浓度不能超过10 ⁹ ，否则抑制细菌生长。一般对阴性结果观察5天以上。

② 试验表明，大肠埃希菌葡萄糖发酵产酸的能力比产气肠杆菌高6倍以上，实际试验中可用于这两种细菌的鉴别。

③ 质控菌株，建议大肠埃希菌作为MR阳性对照，产气肠杆菌作为MR阴性对照。

6.维-培试验（V-P试验）

（1）原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被空气氧化后与培养基中的精氨酸等所含的胍基发生反应，生成红色化合物，为V-P试验阳性。产气肠杆菌能生成乙酰甲基甲醇，V-P试验阳性；大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，V-P试验阴性。

（2）试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，36℃±1℃培养1～2天，加入等量的V-P试剂，36℃孵育，4h内观察结果。

（3）结果判断：在培养基表面出现红色为V-P试验阳性，无红色出现为V-P试验阴性（图1-4-7）。

（4）注意事项

① V-P试验常与MR试验并列使用，一般两者呈相反结果，但并不绝对。

② 进行V-P试验时，培养基不能含有牛肉膏（浸液），因为其含有乙酰甲基甲醇、二乙酰等物质，会产生假阳性结果。

③ V-P试验一般用于肠杆菌属的鉴别。在用于葡萄球菌、芽孢杆菌等细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生。

④ 质控菌株，一般将产气肠杆菌作为V-P试验阳性对照，大肠埃希菌作为V-P试验阴性对照。

7.淀粉水解试验

（1）原理：有些分泌胞外淀粉酶的细菌能使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。本试验可用于检测细菌是否产生淀粉酶和利用淀粉的能力。

（2）试验方法：待检细菌纯培养物点接种于淀粉琼脂平板或试管中，36℃±1℃培养24～48h，滴加少量的Lugol氏碘液（革兰碘液也可以）于平板上或试管中，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板，2h之内观察结果。

（3）结果判断：淀粉琼脂平板呈深蓝色、菌落周围出现无色透明环为阳性反应，说明淀粉被水解，根据菌落周围透明圈的大小可以判断待检细菌水解淀粉能力的强弱；菌落周围无透明环或试管液体为蓝色为阴性反应（图1-4-8）。

（4）注意事项

① 本试验几乎适用于各类细菌的鉴定，但实践中常用于链球菌的分型鉴别。

② 淀粉琼脂平板应现配现用，不宜保存于冰箱。在冰箱中常会使培养基变得不透明。一般保存2周后淀粉琼脂平板上的淀粉发生变化，加入碘试剂会产生紫红色斑点。

③ 质控菌株，一般将枯草芽孢杆菌ATCC6633作为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照。

④ 枯草芽孢杆菌在36℃±1℃培养24～48h会长成一片，建议在25℃培养3～7天，滴加碘液后于2h之内观察结果。

8.七叶苷水解试验

（1）原理：有些细菌能水解七叶苷生成葡萄糖和七叶素。七叶素可与培养基中枸橼酸铁二价铁离子发生反应，形成一种黑色化合物，使培养基变黑。本试验主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。

（2）试验方法：将被检菌接种于七叶苷培养基中或胆汁七叶苷培养基，36℃培养18～24h观察结果。

（3）结果判定：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性（图1-4-9）。

（4）注意事项

① 本试验主要用于D群链球菌与其他链球菌的生化鉴别，前者阳性，后者阴性。

② 因高浓度的胆盐具有抑制除D群链球菌以外的多数链球菌生长，所以常选择胆汁七叶苷培养基，也可以选择胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基（添加50ml/L马血清），能抑制G-细菌生长，通常作为初步选择性的培养基使用。

③ 质控菌株，建议嗜水气单胞菌作为阳性对照，温和气单胞菌作为阴性对照。

二、蛋白质及氨基酸代谢试验

1.明胶液化试验

（1）原理：某些细菌可产生明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而使明胶失去凝固力而呈液化状态。

（2）试验方法：将待检细菌以较大量穿刺接种于明胶培养基约2/3高度，于20～22℃培养7～14天，每天观察明胶液化现象。

（3）结果判断：明胶部分或全部液化，明胶液化试验阳性（图1-4-10）。

（4）注意事项

① 明胶培养基接种细菌后，一般要求在20～22℃培养，因为明胶一般在≤ 20℃时为固体，28℃时由固体向液体转变，≥ 35℃时为液体；多数细菌的明胶酶在20℃条件下孵育比在37℃下孵育能保持更强的活性、产生更多。

② 不同细菌进行穿刺接种培养后，液化的明胶可出现不同的形状（限于20～22℃培养），如漏斗状、杉树状、圆柱状等，但其特异性不够稳定，一般不能作为对某种细菌的鉴定依据，仅供参考。

③ 对于液化明胶速度慢的菌株，可在培养基中按2ml/100ml的量加入甲苯，以增强细菌细胞壁的通透性，促使细胞内酶释放，以加快反应。因甲苯可能对某些菌株有抑制作用，所以同时设空白对照。

④ 试验中可根据待检菌的生长需要增加相应的营养成分，如动物血清，有些细菌（沙门菌属和葡萄球菌属）可产生需Ca ²⁺ 的明胶酶，建议在培养基中按0.01mol/L的量加入氯化钙。

（5）质控菌株，建议普通变形杆菌作为阳性对照，大肠埃希菌作为阴性对照。

2.吲哚试验

（1）原理：有些细菌利用自身的色氨酸酶来分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），其再与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚。本试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

（2）试验方法：将纯培养的待检细菌接种于蛋白胨水培养基中，36℃培养24～48h，滴加吲哚试剂，观察结果。

（3）结果判断：培养基表面呈红色为吲哚试验阳性；呈橙色为可疑；不出现红色为阴性（图1-4-11）。

（4）注意事项

① 因胰化酪蛋白胨含有丰富的色氨酸，试验更多采用此培养基。在使用普通蛋白胨时，也可加入少量色氨酸（0.2～1g/100ml）。

② 吲哚试剂应贮于带塞的棕色玻璃瓶中，并置4℃冰箱中保存。吲哚试剂性质不稳定，应同时进行吲哚阳性对照和阴性对照菌株的吲哚试验。

③ 吲哚试验中不宜使用含有颜色指示剂的培养基上的培养物，以免指示剂干扰吲哚的显色反应。

④ 质控菌株，建议大肠埃希菌作为阳性对照，克雷伯菌作为阴性对照。

3.苯丙氨酸脱氨酶试验

（1）原理：有些细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂形成螯合物，产生绿色反应。

（2）试验方法：取待检细菌涂布接种到苯丙氨酸脱氨酶琼脂培养基斜面上，36℃培养18～24h，向试管中直接自斜面上方滴加适量的10%三氯化铁试剂，轻轻转动试管使试剂布满斜面，1～5min观察结果。

（3）结果判断：菌落生长处有绿色出现，苯丙氨酸脱氨酶试验阳性（+），菌落生长处无绿色出现，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性（-）（图1-4-12）。

（4）注意事项

① 试验中应做较大量接种，加入三氯化铁试剂后转动斜面试管，使试剂与细菌、氧气充分接触，增加反应速度和强度，结果判断应立即进行，以不超过5min为宜，延长反应时间会引起褪色。

② 质控菌株，建议普通变形杆菌作为阳性对照，大肠埃希菌作为阴性对照。

4.氨基酸脱羧酶试验

（1）原理：有些具有特异性脱羧酶的细菌能使氨基酸脱羧（—COOH）而生成胺和CO ₂ ，使培养基的pH升高。最常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。

（2）试验方法：挑取细菌培养物分别接种不同氨基酸培养基和不含氨基酸的对照管内，上面滴加一层无菌液体石蜡，36℃培养18～24h，必要时可延长至48h，观察结果。

（3）结果判断：培养基呈紫色，氨基酸脱羧酶阳性反应（+）；培养基呈黄色，氨基酸脱羧酶阴性反应（-）（图1-4-13）。

（4）注意事项

① 接种前须将各种培养基及对照管做好标记，以免混淆而造成误判。

② 阳性反应为培养初期（10～12h）因葡萄糖发酵产酸使培养基变为黄色，继续培养则因氨基酸脱羧产胺（碱性）而又使培养基由黄色变为紫色；阴性反应因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。本试验在静置培养时可呈现黄色与紫色两层不同的颜色，判断结果时需轻摇试管，若已培养24h则出现任何紫色的痕迹均判阳性。

③ 判断结果时，应与空白对照管进行比较，经培养后空白对照管必须为黄色，否则该试验无效。试验管出现任何紫色的痕迹都可判定为阳性结果。培养时间一般不应超过4天，若时间过长，蛋白胨中其他氨基酸可以被分解产碱而出现假阳性。

④ 本试验主要用于肠杆菌科的鉴定，也可用于假单胞菌属、气单胞菌属、弧菌属等细菌的鉴定。弧菌属细菌进行该试验时需在培养基中加入NaCl（1g/100ml）。

⑤ 质控菌株，建议鼠伤寒沙门菌CMCC（B）50115作为阳性对照，培养基呈紫色；普通变形杆菌CMCC（B）49027作为阴性对照，培养基呈黄色。

三、碳源与氮源利用试验

1.枸橼酸盐利用试验

（1）原理：某些细菌（如产气肠杆菌）能利用枸橼酸盐作为唯一的碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解其中的铵盐生成氨，使培养基由酸性变为碱性，培养基由淡绿色转为深蓝色，为阳性。大肠埃希菌不能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，在该培养基上不能生长，培养基颜色不改变，为阴性。

（2）试验方法：将细菌纯培养物先斜面划线、再穿刺接种于枸橼酸盐培养基，36℃培养1～2天后观察结果。

（3）结果判断：培养基变蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性（+）；培养基不变色，为阴性（-）（图1-4-14）。

（4）注意事项

① 细菌接种量不宜过量，否则会使斜面呈现淡黄色到淡褐色而影响结果判断，造成假阳性。不能通过细菌接种带入原培养基中的营养成分或其他碳源。

② 质控菌株，建议使用肺炎克雷伯菌ATCC13883作为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照。

四、酶类及其他试验

1.氧化酶试验

（1）原理：氧化酶在有分子氧或细胞色素C存在时可氧化，对二苯二胺出现紫色反应。本试验用于检测细菌是否有该酶存在。假单胞菌属、气单胞菌属等阳性，肠杆菌科等阴性，可区别。

（2）试验方法：将氧化酶试剂直接滴在固体培养基细菌的菌落上，或蘸取细菌菌落少许涂抹在白色的洁净滤纸上，加氧化酶试剂1滴，立即观察结果。

（3）结果判断：滴加Kovacs氏试剂，在15s内观察结果，出现玫瑰红色至深紫色者为氧化酶阳性（+）；滴加Ewing氏试剂，2min内观察结果，出现蓝色为氧化酶阳性（+），否则为氧化酶阴性（-）（图1-4-15）。

（4）注意事项

① 对革兰阴性杆菌首先进行氧化酶试验，初步区分非常必要。

② 不能使用选择性培养基和（或）鉴别培养基上的细菌进行氧化酶试验，避免这些培养基的某些成分或指示剂颜色的干扰；因葡萄糖发酵可影响氧化酶活性，也不能使用含有葡萄糖的培养基。一般常用胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、脑心浸液琼脂（BHI）。

③ 目前有商品化氧化酶试剂，按使用说明操作即可。试验时可以用一次性接种环或灭菌牙签将新鲜细菌单个菌落涂抹于白色滤纸上；因微量铁可引起对二苯二胺试剂氧化而导致假阳性结果，故不能使用含铁金属接种环。

④ 氧化酶试剂容易失效，应临用前新鲜配制。避光保存，建议将试剂分装在1～2ml的安瓿瓶中置低温冰箱（-20℃）冷冻保存，临用前融化，融化后的不宜再保存使用。

⑤ 用Kovacs试剂时，一般在10s内观察结果，10～60s出现阳性反应者为迟缓反应，60s后仍不出现相应颜色反应者为阴性反应。对出现迟缓反应者，最好用含有血液的琼脂培养基上的新鲜培养物重新试验。

⑥ 质控菌株，建议用铜绿假单胞菌ATCC 27853作阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作阴性对照。

2.过氧化氢酶试验（触酶试验）

（1）原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。

（2）试验方法（玻片法）：挑取固体培养基上的新鲜单个菌落置于洁净的玻片上，然后加1～2滴3%过氧化氢溶液，静置，1min内观察结果。

（3）结果判断：于1min内产生大量气泡者为过氧化氢酶试验阳性（+），不产生气泡者为过氧化氢酶试验阴性（-）（图1-4-16）。

（4）注意事项

① 3%过氧化氢试剂不稳定，最好临用前配置于棕色瓶内，于4℃阴暗处保存。

② 红细胞中含有过氧化氢酶，当待检细菌营养要求高、需在含有血液的培养基上生长时，可使用巧克力琼脂培养基（红细胞已被溶解）进行过氧化氢酶试验。

③ 待检细菌必须是新鲜培养物，因为只有新鲜培养物才具有过氧化氢酶活性。老龄培养物可能会丧失酶活性，导致假阴性或弱阳性反应。

④ 试验时可以用一次性接种环或灭菌牙签将新鲜细菌单个菌落涂抹于玻片上。不可用含铁金属接种环，否则会导致假阳性反应。

⑤ 质控菌株，建议用金黄色葡萄球菌ATCC25923作阳性对照，链球菌属细菌作阴性对照。

3.尿素酶试验

（1）原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解而产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，使pH指示剂（酚红）呈粉红色。不同细菌产生尿素酶的能力具有明显差异，尿素酶的测定是一项常规细菌生化鉴定指标，大肠埃希菌、沙门菌无尿素酶，培养基颜色不改变，则为阴性。

（2）试验方法：挑取18～24h待检细菌培养物大量接种于改良Rustigian尿素肉汤培养基管中，摇匀，于36℃±1℃培养10min、1h和2h，分别观察结果。或大量涂布接种于Christensen氏琼脂斜面并浅穿刺（不要到达底部，留底部作变色对照），培养2h、4h和24h，分别观察结果，如阴性应继续培养至4天作最终判定。

（3）结果判断：培养基变为红色为尿素酶试验阳性（+），培养基仍为黄色为尿素酶试验阴性（-）（图1-4-17）。

（4）注意事项

① 尿素酶阳性反应出现的时间与接种量有直接关系。在一定范围内，接种量越大其反应出现的时间越短，但超过一定的接种量，反应速度不再无限度地加快。

② 仅斜面顶部呈现粉红色为弱阳性（弱+），仅斜面粉红色而底部无变化者为阳性（+），整个培养基均呈粉红色者为强阳性（2+）。

③ 质控菌株，建议用普通变形杆菌ATCC33420作阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作阴性对照。

4.血浆凝固酶试验

（1）原理：病原性葡萄球菌能产生两种血浆凝固酶，一种是结合凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块；另一种是游离凝固酶，不直接作用于血浆纤维蛋白原，能使凝血酶原变成凝血酶样物质，从而使血浆凝固。血浆凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验，用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。

（2）试验方法：主要包括玻片法和试管法，玻片法主要测定结合凝固酶，试管法测定结合凝固酶和游离凝固酶。

① 玻片法：在洁净载玻片中央加1滴生理盐水，取细菌新鲜纯培养物与其混合制成细菌悬液，经10～20s观察，无自凝现象发生，则加入一滴兔血浆，与菌悬液混合，立即观察结果。

② 试管法：取细菌新鲜纯培养物与0.5ml兔血浆（经生理盐水1 ∶ 4稀释）充分混匀，置36℃（水浴锅或恒温箱）中4h，每30min观察1次结果。同时设阳性对照及阴性对照。

（3）结果判断

① 玻片法：5～20s有明显的凝块沉淀出现（稍前后倾斜载玻片更易观察），为血浆凝固酶阳性反应（+）；3～4min后无凝固现象出现，为血浆凝固酶阴性反应（-）。

② 试管法：若4h内试验管和阳性对照管全部或大部分出现凝固，而阴性对照管（不加兔血浆的浓菌液管）不发生凝固，为血浆凝固酶阳性（+）；无凝固为血浆凝固酶阴性（-）。对阴性和仅有小凝块者，放置过夜后再观察（图1-4-18）。

（4）注意事项

① 一般情况下，玻片法常用于初筛检验，对所有阴性反应和延迟阳性结果（超过20s）的均应做试管法证实。因为金黄色葡萄球菌的某些菌株玻片试验可能为阴性，而试管法对结合凝固酶和游离凝固酶均可检出。

② 试管法试验时，接种后及培养期间均不要振摇试管，因凝固初期的凝块很易破碎，且破碎后继续培养也难以形成凝块，导致假阴性结果。

③ 中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间（4h以上）孵育才可出现阳性。

④ 制备的细菌悬液要均匀，以便观察结果。

⑤ 质控菌株，建议表皮葡萄球菌作阴性对照，金黄色葡萄球菌作阳性对照。

5.氢氧化钾拉丝试验

（1）原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现黏性，可用接种环搅拌后拉出黏丝来；革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。本试验主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。

（2）试验方法：取1滴4%氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与氢氧化钾水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出黏丝。

（3）结果判断：用接种环拉出黏丝者为氢氧化钾拉丝试验阳性（+），仍为混悬液者为氢氧化钾拉丝试验阴性（-）。大多数革兰阴性菌于5～10s出现阳性，有的需30～45s；60s以后拉出黏丝者，判断为氢氧化钾拉丝试验阴性（-）（图1-4-19）。

（4）注意事项

① 4%氢氧化钾溶液应新鲜配制（即用前当日配制），否则易出现假阴性。4%氢氧化钾溶液与菌落比例应适当，如菌悬液太稀可出现假阴性。

② 革兰阳性细菌培养物如超过48h可能会出现假阳性，因此必须使用新鲜细菌培养物。

6. CAMP试验

（1）原理：B群链球菌（无乳链球菌）能产生CAMP因子，可促进金黄色葡萄球菌β溶血素活性，使血琼脂平板上的2种细菌在划线交接处溶血能力增强，形成矢形（半月形）的透明溶血区。

（2）试验方法：在羊血或马血琼脂平板上，先将β溶血的金黄色葡萄球菌划一横线接种，再将待检菌垂直划线接种，两者应相距0.5～1cm，于35℃孵育18～24h后观察结果。每次试验应做阴阳性对照。

（3）结果判断：两种细菌划线交接处出现矢形（半月形）的透明溶血区为CAMP试验阳性（+）（图1-4-20）。

（4）注意事项：建议选择金黄色葡萄球菌ATCC25923或B群链球菌作为阳性对照。

7. IMViC试验

吲哚（I）、甲基红（M）、V-P（Vi）、枸橼酸盐利用（C）4种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。大肠埃希菌对这4种试验的结果是++--（图1-4-21），沙门菌为-+-+（图1-4-22），产气肠杆菌为--++。常见肠杆菌科中IMViC试验结果见表1-4-2。