第二节
细菌的培养

细菌的培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术，主要用于临床样本或培养物中单一细菌的分离，为细菌的鉴定、研究及疾病诊治等提供技术支持。

一、接种工具

常用的接种工具有接种环（含一次性）、接种针、玻璃涂棒和棉签等（图2-2-1）。接种辅助工具有酒精灯和红外电热灭菌器（图2-2-2），其中酒精灯不能在生物安全柜和超净工作台中使用，而红外电热灭菌器可以。

二、培养基

培养基是指由人工配制的，供微生物、动物组织和植物组织生长繁殖或产生代谢产物用的营养物质。培养基中含有碳源、氮源、无机盐、维生素和水等。

1.按性状分类

培养基可分为固体、液体和半固体培养基（图2-2-3）。

（1）固体培养基：在培养基中加入琼脂或明胶等凝固剂，这类培养基常用于微生物的分离鉴定、计数和菌种保存等方面。

（2）液体培养基：这类培养基为液体，微生物能充分利用培养基中的养料。这类培养基适用于生理研究和工业发酵。

（3）半固体培养基：在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于菌种鉴定、细菌运动的观察及噬菌体效价测定等方面。

2.按用途分类

培养基可分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基和选择培养基。

（1）基础培养基：只有基础营养成分，含有一般细菌生长繁殖需要的营养物质，并且可在这种培养基的基础上添加某些成分制成其他培养基。

（2）营养培养基：在基础培养基中加入某些成分，如动物血清、酵母膏、葡萄糖或生长因子等。对营养物质要求较高的微生物需要此类培养基。

（3）鉴别培养基：是一类含有某种特定成分的培养基，某些微生物在其上面生长产生的某种代谢产物与这些特定成分能发生比较明显的反应，根据这一特征性反应可以鉴别这类微生物。

（4）选择培养基：在基础培养基中加入选择性抑制物质，这类物质可以抑制非目的微生物的生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。

三、接种方法

划线法主要是借助划线而将混杂的细菌在琼脂表面分散开，使单个细菌能固定在某一点，生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。

1.分区划线法

此方法多用于污染较为严重的样本中的细菌分离（图2-2-4）。将一个平板分成4个不同面积的区域划线，第一区面积最小，可称为菌源区；第二区和第三区为逐级稀释的过渡区；第四区是提供纯种用的关键区。在划第二区之前，应将接种环灼烧1次，待冷却后再划线。一般情况下，平板上4区面积应是第四区＞第三区、第二区＞第一区。

2.连续划线法

该方法较分区划线法操作简单，可用于一般样本中细菌的分离培养（图2-2-5）。但对于污染严重的样本，分离效果不如分区划线法。

当获得纯化的细菌后，常需要接种到相关的培养基中，以测试其各种生物学性状。一般可用斜面培养基、液体培养基、半固体培养基来检验细菌的培养特性。

3.倾注平板法

此方法用于液体样本的细菌计数，适用于厌氧、兼性厌氧且对热不敏感的微生物。将样本用灭菌生理盐水稀释（10倍的浓度梯度进行倍比稀释），吸取1ml稀释液加入平皿，倾注高压灭菌后并冷却至50℃左右的培养基，混匀，冷却后倒置培养［图2-2-6（a）］。

4.涂布培养法

涂布培养法是用于活菌计数的一种培养方法，适用于需氧微生物的观察。将待测样品制成倍比稀释的稀释液后，取一定量加到培养基表面，使用涂抹棒进行均匀涂抹，倒置培养［图2-2-6（b）］。

5.斜面接种法

将细菌培养物划线接种于斜面培养基上的方法［图2-2-7（a）］，用于扩增细菌、保存菌种，或用于观察细菌的某些生化特性。

6.液体接种法

将细菌培养物接种于液体培养基的方法，用于扩增细菌、观察细菌的生长特性或测定细菌的生化特性［图2-2-7（b）］。

7.穿刺培养法

用接种针垂直地穿入半固体培养基中心至底部，然后沿着原接种线将针拔出［图2-2-7（c）］。用于检验细菌的运动性或观察细菌的生化反应。

四、细菌培养方法

1.一般培养

需氧菌或兼性厌氧菌采用此方法。使用普通恒温培养箱［图2-2-8（a）］，温度设置一般为35～37℃，培养时间为18～24h，一些较难生长的细菌需要培养更长的时间。此外，也有些细菌较为特殊，如李斯特菌在4℃也能生长，弧菌的最适生长温度为28～30℃。

2. CO ₂ 培养法

有些细菌在初次分离时须置5%～10% CO ₂ 环境中才能生长良好，如猪链球菌、副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌等。目前常用的CO ₂ 培养法有如下几种。

（1）CO ₂ 培养箱法：这类培养箱外接钢瓶，钢瓶内充满CO ₂ ，气体通过管道进入培养箱［图2-2-8（b）］。培养箱既能调节温度，也能调节培养箱内CO ₂ 的含量。

（2）烛缸法：此方法是将点燃的蜡烛放入烛缸内（图2-2-8），在烛缸磨砂边缘涂上凡士林后盖上盖子，蜡烛由于氧气缺乏而自行熄灭，烛缸内CO ₂ 的含量达到5%～10%。

3.厌氧培养法

厌氧菌在有氧的情况下不能生长，必须在无氧条件下培养，如产气荚膜梭菌等厌氧菌。厌氧培养法主要包括厌氧罐法、厌氧袋法和厌氧手套箱法。

（1）厌氧罐法：将接种的平板或液体培养基放入厌氧缸内，用物理或化学的方法使缸内造成厌氧环境（图2-2-9）。包括抽气换气和气体发生袋法。抽气换气法适用于一般实验室，将标本接种平板放入厌氧罐，用真空泵抽出罐中空气，然后充入高纯N ₂ 使压力真空表指针回归0位，反复3次，最后一次充入70%的N ₂ 、20%的H ₂ 和10%的CO ₂ 。气体发生袋法是采用化学的方法，通过化学反应产生CO ₂ 和H ₂ ，最后在厌氧罐中加入指示剂和平板培养基即可进行培养。

（2）厌氧袋法：厌氧袋法是在塑料袋内造成厌氧环境进行细菌培养（图2-2-9）。原理与气体发生袋法相同，只是用塑料袋代替了厌氧罐。该方法不需要特殊设备，操作简便，实验室或外出现场接种均可。

（3）厌氧手套箱法：厌氧手套箱法是当今公认的培养厌氧菌最佳方法之一。厌氧手套箱是一个密闭的箱体，由手套操作箱、传递箱、空气压缩机及气瓶等组成，箱体前面有一个透明面板，板上装有两个手套，可通过手套进行操作。但是，该仪器价格昂贵，且长期维持厌氧环境需要消耗大量气体，费用较高。

4.血液培养法

血液培养法是对无菌采集的体液或败血症、菌血症等患病动物血液中的病原微生物进行培养的一种方法。目前应用较多的是全自动血液细菌培养仪（图2-2-10），包括培养系统、检测系统、外围设备和计算机。基本原理是微生物在培养过程中产生的代谢产物或消耗的营养物质与培养瓶中的感受器发生结合，信号经检测系统检测得到信号变化的参数，进而判断瓶内是否有微生物生长。