第二节
疫苗诱导免疫应答过程

病原体感染或疫苗接种后，首先激活的是固有免疫应答，活化之后的固有免疫系统一方面能够通过激活巨噬细胞、NK细胞（自然杀伤细胞）等固有免疫细胞来清除或控制病原体；另一方面，可以招募树突状细胞等抗原提呈细胞到感染或者疫苗接种局部、促进其分化成熟，使其在引流淋巴结中激活T、B细胞应答（图2-2）。不同病原体或免疫原对树突状细胞的活化作用不同，导致下游活化的T细胞亚群也不相同（图2-2），因而这个环节也是免疫原设计与佐剂开发研究的重要关注点。

一 模式识别受体与固有免疫细胞活化

固有免疫系统是由固有免疫细胞与补体、溶菌酶等可溶性生物活性分子共同构成的，其中，固有免疫细胞主要包括：自然杀伤细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。一般而言，固有免疫细胞对病原体的识别缺乏特异性，主要依赖于一系列模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）。模式识别受体在细胞表面与细胞内均有分布。识别外源的病原相关分子模式或者内源“危险信号”之后，模式识别受体可通过下游信号转导促进固有免疫细胞的分化成熟、细胞因子分泌和抗原提呈。

以通过肌肉途径接种的蛋白疫苗为例，接种后，疫苗及佐剂中所包含的病原相关分子模式可以激活肌肉组织中的树突状细胞、巨噬细胞等固有免疫细胞，诱导炎症因子与趋化因子分泌，继而招募更多的固有免疫细胞至疫苗接种部位，在局部形成炎性免疫微环境，促进树突状细胞和单核/巨噬细胞的分化成熟。分化成熟的树突状细胞和单核/巨噬细胞可以更高效地捕获并处理外来免疫原，并可在细胞表面归巢受体（homing receptor）的牵引下向引流淋巴结迁徙，激发后续的适应性免疫应答（图2-3）。固有免疫活化对后续适应性免疫应答的产生至关重要，缺乏“危险信号”时，DC细胞处于未成熟状态，非但不能促进初始T细胞（naive T cell）向效应T细胞分化，反而会诱导其成为调节性T细胞（regulatory T cell），引起免疫耐受。需要特别指出的是，由于机体不同组织部位所包含的天然免疫细胞类型与数量不同，可导致相同疫苗通过不同接种途径所引起的免疫效果不同。此外，不同形式的疫苗活化固有免疫应答的能力也不同：具有复制能力的减毒活疫苗能够模拟自然感染，因而通常具有更强的激活固有免疫应答的能力，并且可以同时在不同的组织部位诱发免疫应答，免疫原性强；而不具有复制能力的灭活疫苗和亚单位疫苗虽然也同样能够激活固有免疫反应，但一般而言强度较弱，诱发免疫应答的部位也主要局限于接种部位，免疫原性相对较弱。

二 疫苗诱导产生的抗体免疫应答

依据抗原性质不同，抗体应答的产生可分为T细胞依赖性（T cell dependent response）和非T细胞依赖性（T cell independent response）两类。蛋白类免疫原被APC加工提呈后可激活滤泡辅助型T细胞（follicular T helper cell, Tfh），继而通过T细胞依赖的方式诱导产生特异性抗体应答；多糖类免疫原不能有效启动Tfh应答，故通常以非T细胞依赖的方式诱导抗体应答。

1.T细胞依赖性抗体应答的产生

初始B细胞来源于骨髓，随血液循环进入外周后可定居在淋巴结皮质区的淋巴滤泡之中。外来抗原通过输入淋巴管进入淋巴结皮质区后，可以被初始B细胞表面所携带的IgM受体识别并结合，启动B细胞活化。B细胞接下来的活化过程可根据组织定位再细分为滤泡外应答（extrafollicular reaction）和生发中心应答（germinal center reaction）两部分（图2-4）。滤泡外应答速度较快，初次接触抗原数天内即可产生抗原特异性抗体。在T细胞的辅助下，滤泡外应答的B细胞也可以完成由IgM向IgG、IgA或IgE的类别转换，但由于未经历生发中心的亲和力筛选，这部分抗体通常只具备胚系抗体的基础亲和力，相应的浆细胞寿命也比较短。生发中心应答相对滞后，在Tfh和滤泡树突状细胞（follicular dendritic cell，FDC）的辅助下，抗原特异性B细胞在生发中心经过Ig类别转换、克隆扩增与BCR亲和力成熟之后，分化成为能够分泌高亲和力抗体的浆细胞。生发中心应答结束后，部分浆细胞可迁移定居于骨髓之中长期存活并持续分泌特异性抗体，是疫苗提供长期免疫保护的重要机制之一。

滤泡外应答与生发中心应答在时相和反应特点上存在差异，这导致机体在初次和再次接触免疫原时的抗体应答特征显著不同。初次接触免疫原时，机体首先通过滤泡外反应迅速（＜7天）产生低水平IgM和IgG应答，继而通过生发中心反应进一步提高特异性IgG水平，一般在初次免疫接种后4周左右IgG水平达到峰值，随后快速衰减至基线水平。再次接触免疫原时，预存的记忆型T、B细胞可以快速活化，在短时间内（＜7天）显著提高外周血中特异性IgG水平，4周左右达到顶峰。峰值过后，迁居于骨髓中的长寿浆细胞能够持续分泌特异性抗体，使外周血中特异性抗体水平在较长时间内维持相对稳定（图2-5）。

生发中心应答是决定T细胞依赖性抗体应答水平与质量的关键环节。初次接触免疫原后，位于淋巴结初级淋巴滤泡之中的初始B细胞（IgM ⁺ IgD ⁺ B cell）被激活并迁徙至位于淋巴滤泡之间的T-B细胞交界区，与抗原特异性T细胞形成稳定的相互作用；随后，抗原特异性T细胞逐渐分化成Tfh，而充分活化后的B细胞则迁移回到淋巴滤泡之中，并与捕获了免疫原的FDC相互作用，分化增殖形成生发中心（图2-6）。从初次接触免疫原至生发中心形成一般需要7天左右，此过程中B细胞和Tfh、FDC之间的相互作用是影响特异性抗体滴度与亲和力的决定性因素：生发中心形成之后，位于暗区的B细胞（图2-6）在活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶的作用下，经过数轮细胞增殖后，在抗体可变区引入体细胞超突变，使BCR的多样性增加。增殖后的B细胞迁移至生发中心的明区，与捕获了抗原的FDC相互作用，具有高亲和力BCR的B细胞克隆能够更高效地捕获抗原，继而更有效地获得Th细胞的辅助，使其在与其他B细胞克隆的竞争中获得优势；相反的，BCR亲和力低的B细胞由于无法有效地捕获抗原，因而也无法获得Th细胞提供的生存信号，逐渐凋亡。上述过程反复进行，可使特异性抗体的亲和力逐步提高，称为抗体亲和力成熟过程。抗体亲和力成熟可持续数月，因此，疫苗的初次免疫与加强之间需要留有足够长的时间（4～6个月）间隔才能有效地诱导高亲和力抗体应答。这也是实际乙肝疫苗接种中“0-1-6个月”免疫程序的依据。

2.非T细胞依赖性抗体应答的产生

细菌的脂多糖、荚膜多糖及聚合鞭毛素等抗原在刺激B细胞产生抗体时不需要T细胞辅助，因而被称为胸腺非依赖性抗原（thymus independent antigen，TI-Ag）。TI-Ag多包含重复的B细胞表位，接种之后，TI-Ag随淋巴引流到达淋巴结边缘区，通过重复排列的B细胞表位使BCR发生交联，进而激活B细胞。TI-Ag主要通过滤泡外途径诱导抗体应答，一般而言以IgM为主，完成由IgM到IgG/IgA类别转换的比例较少，抗体亲和力低且难于形成免疫记忆，但这也并不是绝对的。临床观察发现，部分多糖类疫苗接种者体内能够检测到中等亲和力（提示这些抗体经历过亲和力成熟）的抗体，可能的解释有两种：①部分能够交叉识别多糖类免疫原的记忆型B细胞被激活；②部分多糖类抗原特异性的IgM ⁺ IgD ⁺ CD27 ⁺ 记忆型B细胞被激活。非T细胞依赖性抗体应答持续时间较短，并且由于缺乏免疫记忆，导致机体再次接触TI-Ag时仍会呈现出初次免疫应答的特征。

3.记忆型B细胞应答的基本特征及影响因素

如前所述，能否有效诱导免疫记忆是T细胞依赖性与非T细胞依赖性抗体应答之间的重要区别。在生发中心应答过程中，初始B细胞被抗原激活后一部分细胞分化成能够分泌抗体的浆细胞，而另一部分细胞则分化成记忆型B细胞。与浆细胞不同，记忆型B细胞并不分泌抗体，迁出生发中心之后，主要定居于淋巴结和脾脏的滤泡外区。没有抗原刺激时，记忆型B细胞能够以静息态长期存活；再次接触抗原时，记忆型B细胞可迅速活化增殖并分化成为浆细胞并分泌高亲和力抗体。记忆型B细胞应答的主要特征是应答速度快，所产生的特异性抗体量大且亲和力显著高于初次应答。此外，与初始B细胞相比，记忆型B细胞的BCR亲和力更高，因此低剂量抗原刺激即可使其活化，且在缺少CD4 ⁺ T细胞辅助的情况下仍可被激活。

已有的研究证据表明，记忆B细胞与浆细胞在分化方向上的差异出现于分化晚期，而决定分化方向的内因是一系列转录调控因子。由于记忆B细胞与浆细胞的早期分化途径相同，因而一些能够影响浆细胞生成的外部因素也往往能够影响记忆B细胞应答，在疫苗接种过程中有利于B细胞免疫记忆的因素主要包括：①低剂量初次免疫可能有利于记忆B细胞的形成；②初次免疫与加强免疫之间较长的时间间隔（4～6个月）有利于记忆B细胞的亲和力成熟；③高剂量加强免疫有利于促进记忆B细胞的形成；④抗原的持续存在有利于记忆B细胞长时间维持。

B细胞免疫记忆的产生和维持对再次免疫应答具有重要作用，然而，由于记忆型B细胞并不分泌抗体，再次遭遇抗原时需要首先活化、增殖并分化成浆细胞之后才能分泌特异性抗体，因此其是否能够发挥保护作用主要取决于记忆B细胞的激活速度与病原体入侵速度之间的竞争。如记忆型B细胞不能阻断新发HBV感染，然而却能够在病毒形成慢性感染之前完成活化增殖，预防由慢性乙肝病毒感染所导致的肝损伤。在疫苗接种过程中，加强免疫无法将记忆型免疫应答诱导成为具有保护作用的效应型免疫应答的情况被称为加强免疫失败（secondary vaccine failure）。

4.影响抗体应答持续时间的因素

特异性免疫应答持续时间是影响疫苗免疫效果的重要因素。免疫接种过程中，在淋巴结和脾脏中产生的浆细胞大多寿命较短，少部分浆细胞可以从生发中心迁移至骨髓并长期存活（数年至数十年不等），长寿浆细胞的数量和质量是影响特异性抗体应答持续时间主要内因。而影响抗体应答持续时间的外部因素主要包括：疫苗类型、接种时间间隔和受试者年龄（表2-2）。疫苗类型对抗体应答持续时间具有重要影响：减毒活疫苗诱导产生的特异性抗体应答可以持续数十年，而多糖类疫苗则几乎不能诱导产生长效免疫应答。疫苗接种时间间隔对免疫应答持续性同样具有重要影响：短时间间隔（1～2周）可以快速诱导产生特异性免疫应答，但诱导长效应答的效率比长时间（1～2个月）间隔低。受种者年龄也是影响免疫应答持续性的主要因素：免疫系统未成熟或者衰老均不利于长效免疫应答的产生。此外，其他因素如佐剂、受种者健康状况等也会对抗体应答的持续性产生影响。

三 疫苗诱导产生的T细胞应答

疫苗接种后T细胞与B细胞免疫应答的产生是同时进行的。树突状细胞被组织中的炎症因子激活后摄取免疫原，并迁移至引流淋巴结。在迁移过程中，树突状细胞逐渐分化成熟，摄取的免疫原也被加工成小片段并与MHC分子（人类为HLA）的肽结合槽结合，展示在细胞表面。一般规律是MHC-Ⅰ类分子展示细胞内源性抗原肽片段，MHC-Ⅱ类分子展示细胞吞噬的外部抗原；而由于交叉提呈（cross presentation）机制的存在，使得APC也可以通过MHC-Ⅰ类分子展示外部抗原。由于人类HLA基因的高度多态性，使得T细胞免疫应答在人群中复杂多样。T细胞表位是免疫原被宿主蛋白酶切割后形成的短肽，CD4 ⁺ T细胞识别MHC-Ⅱ分子提呈的表位肽，CD8 ⁺ T细胞识别MHC-Ⅰ提呈的表位肽。细胞表位肽既可以来自免疫原分子表面，也可以来自分子内部。这与B细胞表位有显著区别，BCR识别的是位于细胞外的、完整的免疫原，因而B细胞表位主要是位于免疫原表面的构象表位。

MHC/肽复合物被TCR识别并结合为T细胞活化提供了第一信号，然而仅有第一信号不足以激活T细胞，在缺少共刺激信号的情况下，T细胞会进入无活性或者免疫耐受状态。T细胞活化的第二信号来自APC表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体或配体相互作用介导的信号，例如，APC细胞表面的B7分子通过与T细胞表面的CD28相互作用促进T细胞活化。活化后的CD4 ⁺ T细胞可进一步分化为Th1、Th2、Th17、Tfh等多个不同的亚细胞群，分别具有不同的功能特征（表2-3），例如：Th1细胞可以通过直接接触或者分泌细胞因子（IFN-γ）的方式促进CD8 ⁺ T细胞活化；而Th2则可通过接触或者分泌细胞因子（IL-4）来遏制CD8 ⁺ T细胞活化（图2-7）。由此可见，CD4 ⁺ T细胞的分化方向对疫苗所诱发的免疫应答特征具有重要影响。

众多因素可以影响CD4 ⁺ T细胞的分化方向，例如抗原剂量、接种途径，DC的活化程度与被激活DC的类型等。在这些因素中，DC的活化程度与被激活DC的类型是决定CD4 ⁺ T细胞分化方向的主要因素。初始T细胞与携带免疫原的未成熟DC接触时，由于缺乏第二信号，使这些T细胞无法分化为效应细胞，而是转变为抗原特异性Treg细胞。Treg能够抑制特异性免疫应答，对传染病疫苗研发是不利的，但对预防或治疗过敏性疾病却是有益的。

与B细胞可以形成长寿浆细胞不同，效应型T细胞的寿命一般比较短，90%以上只能存活数天，而记忆T细胞则可在缺乏抗原刺激的情况下，通过稳态增殖在体内长期存在。因而，T细胞疫苗难以通过维持效应T细胞来实现长期保护，形成有效的免疫记忆对T细胞疫苗而言至关重要。决定记忆T细胞有效性的因素主要包括以下四个方面：抗原特异性记忆T细胞的频率、表型、存续时间和组织定位。记忆T细胞的频率反映了初始T细胞扩增的幅度及其随后缩减的幅度。扩增期主要的决定因素是初次免疫刺激时的抗原剂量。这一点是非复制型疫苗的主要局限，因其不能通过复制产生足够量的免疫原，故而需要佐剂或加强免疫。记忆T细胞并不是一个均质群体，根据表型和功能可以将记忆T细胞分为两大类（表2-3）：效应记忆T细胞（effector memory T cell, Tem）在非淋巴器官巡游，监视组织中是否存在被病原体感染的细胞，识别抗原后可以立刻发挥效应；中心记忆T细胞（central memory T cell, Tcm）主要存在于淋巴组织中，遭遇抗原后须首先增殖分化为效应T细胞，然后才能发挥抗感染作用。效应记忆T细胞因为主要存在于非淋巴组织，且具有即时发挥作用的特点，被认为是影响T细胞疫苗长期保护效果的主要因素。据此而言，复制型疫苗载体比非复制型载体在T细胞疫苗研发方面更具优势，原因是复制型载体可以长时间维持抗原存在，有利于效应记忆T细胞的形成。

（万延民；审校：王宾） SYFyAnCm4CTP0hqjU8xAJYDOCDkb7eCA6lehqHawmJZxJKxJbY3+lV+iB4gM3BgQ