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第三节
凝血因子检验

一、全血凝固时间测定

(一)检测原理

凝血时间(clotting time,CT)是血液离开血管,在体外发生凝固所需要的时间。试管中加入白陶土-脑磷脂的混悬液以充分激活因子Ⅻ、Ⅺ,并为凝血反应提供丰富的催化表面,以提高本试验的敏感性,是筛查内源性凝血途径和共同途径中各凝血因子有无异常、有无抗凝物质增多和纤溶亢进的试验。有试管法和玻片法。

(二)标本要求与质量控制

1.4%白陶土-脑磷脂的混悬液是将脑磷脂用巴比妥缓冲液作1:50稀释,再加等量4%白陶土悬液混合而成。

2.本试验较敏感,可检出因子Ⅷ:C小于45%的亚临床型血友病患者。

(三)参考区间

试管法:4~12min;硅管法:15~30min;塑料管法:10~19min。

(四)临床应用

1.延长

①严重的FⅧ、FⅨ减低,如血友病A、血友病B等;②严重的FⅠ、FⅡ、FⅤ、FⅩ缺乏,如严重的肝病、维生素K缺乏等;③原发或继发性纤溶亢进;④口服抗凝剂、应用肝素等;⑤循环血中存在病理性抗凝物质,如抗FⅧ或抗FⅨ抗体、狼疮抗凝物等。

2.缩短

①高凝状态,如DIC高凝等;②血栓性疾病,如心肌梗死、深静脉血栓形成等。

二、血浆凝血酶原时间测定

血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)是在体外模拟体内外源性凝血的全部条件,测定血浆凝固所需要的时间,是外源性凝血系统的筛查试验。

(一)检测原理

37℃的条件下,在待检血浆中加入足量的组织凝血活酶(含组织因子和磷脂)和钙离子,通过激活FⅦ而启动外源性凝血途径。从加入钙离子到血浆开始凝固所需要的时间为PT。

(二)标本要求与质量控制

1.采血后宜在1h内完成,置4℃冰箱保存不应超过4h,-20℃下可放置2周,-70℃下可放置6个月。

2.水浴温度稳定控制在37±1℃,过高或过低均会影响结果。

3.抽血要顺利,抗凝要充分,绝不可有凝血块,这将影响凝血酶原时间的准确性。

4.市场上供应的组织凝血活酶制剂应注明国际敏感指数(ISI),以选用ISI<2.0的组织凝血活酶为宜。

(三)参考区间

1.血浆凝血酶原时间(PT)测定手工法

男性11.0~13.7s,女性11.0~14.3s,男女平均为12±1s;待测者的测定值较正常对照值延长超过3s以上才有临床意义。仪器法:不同品牌仪器及试剂间结果差异较大,需要各实验室自行制定。

2.凝血酶原时间比值(PTR)

0.82~1.15(1.00±0.05)。

3.国际标准化比值(INR)

依ISI不同而异,一般在1.0~2.0。

(四)临床应用

1.PT延长

见于先天性FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ缺乏或低(无)纤维蛋白原血症;获得性凝血因子缺乏,如严重肝病、维生素K缺乏;血液循环中有抗凝物质或口服抗凝剂等。

2.PT缩短

见于先天性因子Ⅴ增多症、长期口服避孕药、高凝状态和血栓病等。

3.口服华法林等抗凝剂的监测

使PT维持在正常对照值的1.5~2.0倍,PTR维持在1.5~2.0倍,INR在1.5~2.5最佳。

三、活化部分凝血活酶时间测定

活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)是在体外模拟体内的内源性凝血全部条件,测定血浆凝固所需时间,是内源性凝血系统较灵敏的筛查试验。

(一)检测原理

在37℃条件下,在待检血浆中加入足量的的活化接触因子激活剂(如白陶土等)和部分凝血活酶,再加入适量的钙离子,可激活FⅫ从而启动内源性凝血途径。从加入钙离子到血浆凝固所需时间即为APTT。

(二)标本要求与质量控制

1.标本应及时检测,最迟不超过2h。血浆加白陶土部分凝血活酶后被激活的时间不得少于3min。

2.分离血浆应在3 000r/min离心10min,务必去除血小板。

3.白陶土因规格不一,其致活能力不同,因此参考值有差异。但若正常对照值明显延长,提示白陶土部分凝血活酶悬液质量不佳。

4.本试验较试管法全血凝固时间敏感,能检出因子Ⅶ:C<25%的轻型血友病。

(三)参考区间

1.手工法

男性31.5~43.5s;女性32~43s。较正常对照值延长10s以上为异常。

2.仪器法

不同品牌仪器及试剂间结果差异较大,需要各实验室建立相应的参考区间。

(四)临床应用

1.APTT延长 ①FⅧ、FⅨ水平减低的血友病A、B,FⅪ缺乏症;FⅧ减少还见于部分血管性血友病;②严重的FⅠ、FⅡ、FⅤ、FⅩ缺乏,如严重肝脏疾病、维生素K缺乏等;③纤溶活性增强,如继发性弥散性血管内凝血、原发性弥散性血管内凝血(后期);④血液循环中存在病理性抗凝物质,如抗FⅧ或FⅨ抗体、狼疮抗凝物等;⑤口服抗凝剂、应用肝素等。

2.APTT缩短 ①高凝状态,如DIC高凝期、促凝物质进入血流以及凝血因子的活性增强等;②血栓性疾病,如心肌梗死、不稳定型心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺栓塞、深静脉血栓形成、妊娠期高血压疾病和肾病综合征以及严重灼伤等。

3.监测肝素抗凝治疗的疗效,APTT延长正常对照值的1.5~2.0倍使治疗效果最佳。

四、血浆凝血酶时间测定

血浆凝血酶时间(thrombin time,TT)是筛查血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白过程中有无异常的指标。

(一)试验原理

37℃条件下,将一定量的“标准化”的凝血酶加入到乏血小板的待检血浆中,将纤维蛋白原转变为纤维蛋白,使血浆发生凝固所需的时间。

(二)标本要求与质量控制

采集空腹血,用枸橼酸钠(血液与抗凝剂比例为9:1)抗凝。3 000r/min离心10min,获乏血小板血浆。

(三)参考区间

凝固法:16~18s,超过正常对照值3s为异常。每个实验室应建立相应的参考区间。

(四)临床意义

TT延长见于低(无)纤维蛋白原血症、异常纤维蛋白原血症、获得性低纤维蛋白原血症、肝素增多或类肝素抗凝物质存在、原发性或继发性纤溶亢进。

五、血浆纤维蛋白原测定

(一)检测原理

纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)检测是被检血浆中加入足量的凝血酶使其凝固,血浆凝血时间和Fg浓度呈负相关,从国际标准品FIB参比血浆测定的标准曲线中获得FIB的浓度。

(二)标本要求与质量控制

1.参比血浆应同时与标本一起操作,以核对结果是否可靠。

2.凝血酶复溶后在4~6℃可放置2d。

3.凝固时间延长,查得纤维蛋白原浓度降低可有以下情况:①血浆纤维蛋白原浓度真正的降低;②血浆纤维蛋白原浓度假性降低,即由于血浆中出现肝素、FDP或罕见的异常纤维蛋白原血症所致,属以上情况时应进一步用其他实验方法证实或测定纤维蛋白原的抗原浓度。

4.Fg检测的方法学较多,Clauss法是目前首选的方法。

(三)参考区间

正常人纤维蛋白原含量为2~4g/L。

(四)临床应用

1.FIB增高

见于糖尿病和糖尿病酸中毒、动脉血栓栓塞(急性心肌梗死发作期)、急性传染病、结缔组织病、急性肾炎和尿毒症、放射治疗后、灼伤、骨髓瘤、休克、老年人外科大手术后、妊娠晚期和妊娠期高血压疾病、轻型肝炎、败血症、急性感染和恶性肿瘤等。

2.纤维蛋白原减少

见于弥散性血管内凝血和原发性纤溶症、重症肝炎和肝硬化等。

3.做为溶栓治疗监测的指标

溶栓治疗时,FIB通常不应低于1.2~1.5g/L,低于1.0g/L,出血风险增加。

六、凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ促凝活性测定

(一)检测原理

待检血浆按一定比例分别与缺乏FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的血浆混合,测定混合血浆的APTT。将测得的APTT与健康人不同浓度混合血浆得出的标准曲线对比,分别计算出待检血浆凝血因子活性相当于健康人的百分率。

(二)标本要求与质量控制

1.缺乏某因子的基质血浆的因子水平应<1%,而其他因子的水平必须正常。该基质血浆应置-80~-40℃冰箱中保存。

2.待检标本采集后应立即测定或将分离血浆置-40~-20℃冰箱内待测,但不能超过2个月。同时避免反复冻融。

3.每次测定都应做标准曲线。正常人新鲜混合血浆要求至少30人份。

4.高浓度的肝素、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)、自身抗体(如因子抑制物)等,有可能引起因子活性的假性减低。

5.血液标本采集不当(如采血不顺利、组织液混入血等)、保存不当(如低温保存时引起的冷激活等),可使凝血因子活性呈假性增高。若输血后检测凝血因子,不能排除无因子缺乏症,一般应在输血7d后再测定。

(三)参考区间

FⅧ:C(103±25.7)%、FⅨ:C(98.1±30.4)%、FⅪ:C(100±18.4)%、FⅫ:C(92.4±20.7)%。

(四)临床应用

1.因子Ⅷ:C减低

见于血友病A,按减低程度分为:重型(<2%)、中型(2%~5%)、轻型(5%~25%)、亚临床型(25%~45%);其次见于vWD和弥散性血管内凝血(DIC);抗Ⅷ:C抗体所致获得性血友病较为少见。

2.因子Ⅸ:C减低

见于血友病B,临床上减低程度分型与血友病A相同;其次见于肝脏疾病、维生素K依赖的凝血因子缺乏症、DIC、口服抗凝剂和抗FⅨ抗体存在等。

3.因子Ⅺ:C减低

见于因子Ⅺ缺乏症、肝脏疾病、DIC和抗FⅪ抗体存在等。

4.因子Ⅻ:C减低

见于先天性因子Ⅻ缺乏症、DIC、肝脏疾病以及部分血栓病患者。

5.因子Ⅷ:C、Ⅸ:C、Ⅺ:C水平增高

主要见于高凝状态和血栓病,尤其是静脉血栓形成、肾病综合征、妊娠期高血压疾病、恶性肿瘤等。肝病时因子Ⅷ:C增高。

七、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ活性测定

(一)检测原理

受检者稀释血浆分别与缺乏FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ的血浆混合,测得混合血浆的凝血酶原时间(PT)。将受检者血浆测定的结果与正常血浆作比较,分别计算受检血浆中所含凝血因子活性相当于正常人的百分率。

(二)标本要求与质量控制

同血浆凝血酶原时间测定及因子Ⅷ:C、Ⅸ:C、Ⅺ:C和Ⅻ:C测定。

(三)参考区间

乏因子血浆纠正试验 FⅡ:C、FⅤ:C、FⅦ:C、FⅩ:C为(70~120)%。

(四)临床应用

1.血浆中因子Ⅱ:C、Ⅴ:C、Ⅶ:C、Ⅹ:C水平增高

同因子Ⅷ:C、Ⅸ:C、Ⅺ:C、Ⅻ:C测定,但肝脏疾病除外。

2.血浆中因子Ⅱ:C、Ⅴ:C、Ⅶ:C、Ⅹ:C的减低

见于先天性因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ缺乏症,但较少见。获得性减低者见于维生素K依赖的凝血因子缺乏症、肝脏疾病(最多和最先减少的是因子Ⅶ,其次和中度减少的是因子Ⅱ和Ⅹ,最后和最少减少的是因子Ⅴ)、DIC和口服抗凝剂等。在血液循环中有上述凝血因子的抑制物时,这些因子的血浆水平也减低。

八、凝血因子Ⅻ检测

(一)检测原理

在Ca 2+ 的参与下,F a能使可溶于5mol/L尿素溶液的可溶性纤维蛋白单体聚合物变为纤维蛋白。因此,含F 的血浆凝固后不再溶于上述溶液。如果受检血浆中缺乏F ,则聚合物可溶于5mol/L尿素溶液。

(二)标本要求与质量控制

1.抽血顺利,不应有溶血和凝血。

2.抽血后立即检测,不宜久置。

3.0.025mol/L氯化钙溶液应新鲜配制。

4.本法简便,对因子 缺乏的检测的特异性较强,敏感性欠佳。但本试验在纤维蛋白原低于0.5g/L的情况,由于无法形成足够的血凝块,结果观察可能受到影响。

(三)参考区间

正常情况下,血浆F :C(70~140)%。

(四)临床应用

若纤维蛋白凝块在24h内完全溶解,表示F 有先天性或获得性缺乏。获得性者见于肝脏病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、淋巴瘤、转移性肝癌、恶性贫血、弥散性血管内凝血及原发性纤溶等。

(陶 玲 袁小庚) 2vhiqcUWxpaH+Pue4fjS/4vf5cArxbzLFAmL2baQUdzHcGKug1tZgZ4NZhl+x+IX

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