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第一节
血管壁和血管内皮细胞相关检验

初期止血(又称一期止血),与血管壁和内皮细胞的功能密切相关。目前主要的检测内容包括出血时间、血管性血友病因子及血管内皮损伤标志物。

一、出血时间测定

(一)检测原理

出血时间(bleeding time,BT)是指皮肤受特定条件的外伤出血后,出血自行停止所需要的时间。BT反映了皮肤毛细血管与血小板的相互作用,包括皮肤毛细血管的完整性与收缩功能、血管内皮细胞的功能、血小板的数量与功能,血管周围结缔组织成分等。与这些反应相关的血管和血液成分,如血管性血友病因子(vWF)和纤维蛋白原含量(Fg)等有缺陷时,BT也可出现异常。通常用WHO推荐的模板法(template bleeding test,TBT)或出血时间测定器法测定。

(二)标本要求与质量控制

1.采血部位应保暖,血液应自动流出。

2.滤纸吸去流出血液时,应避免与伤口接触。

3.试验前一周应停用抗血小板药物,如阿司匹林、氯吡格雷等。

4.BT测定实验操作较为复杂、皮肤切口稍大,临床开展受到一定限制,一般不作为常规筛查试验。对临床有皮肤及黏膜出血表现、疑为初期止血缺陷的患者,可检查BT。

5.BT测定是筛查血管与血小板相互作用有无异常较为敏感的试验,由于试验条件要求较高,皮肤切口的长度和深度固定,测定结果较为准确。

(三)参考区间

6.9±2.1min。

(四)临床应用

1.BT延长

常见于:①血小板数量异常,如血小板减少症;②血小板质量缺陷,如先天性和获得性血小板病和血小板无力症等;③一些凝血因子缺乏,如血管性血友病(vWD)和弥散性血管内凝血(DIC)等;④血管疾病,如遗传性出血性毛细血管扩张症等。

2.BT正常

并不能完全除外初期止血缺陷。如果有出血家族史,而且又无凝血因子异常,应进一步做其他有关实验检查。

3.BT缩短

见于一些严重的血栓前状态和血栓性疾病。

二、血管性血友病因子测定

(一)检测原理

血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)是一种多聚体大分子蛋白,具有与胶原、肝素、FⅧ轻链、GPⅠb和GPⅡb-Ⅲa、瑞斯托霉素等结合的多个功能区。vWF检测包括含量、活性、功能、多聚体等多个指标的检测。

1.血浆vWF抗原检测(vWF:Ag)

常用乳胶颗粒增强的免疫比浊法(LPEITA)快速定量检测血浆中的vWF:Ag,结果以对照血浆的百分比表示。

2.血浆vWF活性(vWF:activity,vWF:A)

用抗vWF的血小板结合位点(GPⅠb受体)的单克隆抗体包被的乳胶颗粒与待测血浆中的vWF反应,乳胶颗粒发生凝集的程度与vWF活性成比例关系,通过全自动凝血分析仪快速测定vWF:A活性,结果以对照血浆的百分比表示。

3.vWF的功能分析

包括血浆vWF瑞斯托霉素辅因子(vWF:ristocetin cofactor,vWF:RC)检测、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验(ristocetin-induced platelet agglutination test,RIPA)、vWF的胶原结合能力、vWF的FⅧ结合能力(vWF:FⅧ BC)检测。

4.vWF多聚体分析

用SDS琼脂糖凝胶电泳检测vWF的功能多聚体,然后通过放射自显影或Western blotting,鉴定和分析多种多聚体区带。

5.基因诊断

应用PCR和突变分析检测vWF的基因缺陷。

(二)标本要求与质量控制

1.在vWF检测中,vWF:Ag的定量最常用,以前多采用免疫火箭电泳,现已较少用。ELISA也可用于定量检测vWF:Ag,但以胶乳颗粒增强的免疫比浊法最为简便、快速。

2.本试验若以EDTA抗凝,测定结果不准。

3.试管和注射器均应涂硅或使用塑料制品。

4.vWF:Rco和瑞斯托霉素诱导的血小板凝集试验(RIPA)是最常用的vWF功能试验,vWF多聚体分析是诊断vWD最为特异的试验,但检测方法难度较大,一般实验室难于常规检测。对一些疑难病例,在有条件时可进行基因诊断。

(三)参考区间

1.血浆vWF:Ag(比浊法) 41.1%~125.9%(O 型),61.3%~157.8%(A、B、AB 型),O 型人群明显低于A、B、AB型人群。

2.血浆vWF:A(比浊法) 38.0%~125.2(O 型),49.2%~169.7%(A、B、AB 型),O型人群明显低于A、B、AB 型人群。

3.血浆vWF:RC 70%~150%;RIPA RIS(0.5g/L)<20%,RIS(1.5g/L)>60%;vWF:CBc 2.1%~40.5%;vWF:FⅧ BC 924±216U/L。

(四)临床应用

1.血管性血友病诊断与分型

vWF抗原、vWF活性及多聚体分析是诊断血管性血友病(von Willebrand disease,vWD)和对vWD分型的重要依据。vWF:Ag浓度减低是诊断vWD的重要指标。

2.血栓性疾病

vWF:Ag升高,见于周围血管病变、缺血性心脑血管疾病、糖尿病、尿毒症、肺部疾病、妊娠高血压综合征等。

3.急性时相反应

vWF作为一种急性时相反应蛋白,在大手术后、恶性肿瘤、血管炎、器官移植后等,可显著升高。

三、血浆血栓调节蛋白

(一)检测原理

血浆血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)包括抗原含量(TM:Ag)和活性(TM:A)检测。

1.血浆血栓调节蛋白抗原含量(TM:Ag)测定

应用放射免疫分析法(RIA)检测,以抗人凝血酶调节蛋白(TM)单克隆抗体或抗血清包被聚苯乙烯放免小杯,样品中的TM结合于包被的放免小杯上,加入 125 Ⅰ-抗人TM单抗,根据结合的 125 Ⅰ放射性强度计算样品中TM:Ag的含量。

2.血浆血栓调节蛋白活性(TM:A)测定

TM可加速凝血酶激活蛋白C的速率,所以,加入一定浓度的凝血酶,活化蛋白C(APC)的生成量与待测血浆中的TM活性成比例关系。APC分解发色底物S-2336释放出黄色对硝基苯胺(pNA),pNA的最大吸收峰在405nm处,通过自动凝血分析仪动态监测吸光度的变化量可检测TM的活性(TM:A)。

(二)标本要求与质量控制

采集空腹血,用枸橼酸钠(血液与抗凝剂比例为9:1)抗凝。

(三)参考区间

血浆TM:Ag(RIA法)20~35µg/L。

血浆TM:A(发色底物法)68%~120%。

(四)临床应用

TM:Ag是血管内皮损伤的最佳标志物之一,通常作为首选,结合TM:A有助于与TM缺乏症相鉴别。

1.血浆TM增高

常见于累及血管内皮损伤的疾病,如糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、肾小球疾病、弥散性血管内凝血(DIC)、脑梗死、急性心肌梗死等,TM增高与vWF升高呈正相关。

2.血浆TM减低

常见于TM缺乏症,其血栓性疾病的发病率增高。

(陶 玲 袁小庚) fcbt6Y+7hhqhMxnTAS2Se8DJsj2jeBkSUz5pz/bdAzVDLSteZpV4Iw/On9NF0CAz

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