第四节
血红蛋白病的检验

血红蛋白病（hemoglobinopathy）是一组由遗传性或基因突变所致的珠蛋白肽链结构异常或合成肽链速率改变引起Hb功能异常所致的疾病，包括珠蛋白肽链数目合成异常（量的异常）和珠蛋白肽链结构异常（质的异常）两大类。前者称为地中海贫血（thalassemia），包括β-地中海贫血和α-地中海贫血；后者称为狭义的血红蛋白病，如常见的镰状细胞贫血（HbS病）、HbE病。血红蛋白病的常用检查方法主要有以下几种。

一、血红蛋白区带电泳分析

（一）检测原理

各种Hb由于组成珠蛋白的肽链不同而具有不同的等电点，在一定pH的缓冲液中可带不同的电荷。在碱性缓冲液中Hb带负电荷，反之带正电荷。肽链中一个或数个氨基酸被取代或缺失后，有时所带的电荷也随之发生改变。在一定的电场中，带有不同电荷的珠蛋白分子便可分别向正极或负极移动，其迁移的速度也因所带电荷的强弱而不同，结果便在支持介质（醋酸纤维素薄膜/琼脂糖凝胶）中形成各种血红蛋白区带电泳图。观察电泳图便可初步发现各种异常Hb，用比色或扫描的方法，还可测出其含量，对血红蛋白病（Hb病）作出诊断。

（二）标本要求与质量控制

1.血红蛋白电泳一般采用微量法制备标本，宜稀释1~2倍，这样会使区带更为清晰、整齐。定量分析应以四氯化碳法制备血红蛋白溶液，血红蛋白溶液置4℃保存不能超过1周。冷冻时可保存几个月，但不宜反复冻融，否则将导致变性。

2.点样量要适当，也不要达到膜的边缘以免引起拖尾。过多则分辨不清；染色液不易染透，染色色带容易脱落。过少HbA ₂ （或异常Hb区带）吸光度太低，影响准确性，对于中度或重度贫血的病例，点样量应增大。

3.要避免Hb以外的标本污染醋酸纤维素薄膜。浸膜时应漂浮在浸膜液中缓缓浸透，避免产生气泡。

4.严格控制缓冲液离子强度、染液质量和浓度、染色时间、漂洗次数，以及电泳时电流、电压和时间等，电泳槽中的缓冲液不能长期使用，否则可影响电泳的分析结果。

5.每次试验均应加入已知正常标本和异常标本，分别作阴性对照和阳性对照。

6.室温低时染色时间应延长。气温高时洗脱时间不宜过长，否则洗脱碱液蓝色渐褪，并逐步变为紫红色。洗脱后要尽快比色，超过半小时可能因逐渐褪色而影响结果。

（三）结果分析与解读

1.Hb区带电泳

正常人Hb电泳谱可显出4条区带，最近阳极端量最多的为HbA，其后为少量的HbA ₂ 。再后有两条更少的红细胞内非Hb蛋白成分NHb1及NHb2（可不显现）。HbF在HbA之后，通常很难与HbA分离开来。未发现异常Hb区带。

2.定量分析

临床上Hb区带还需定量分析。正常成人HbA ₂ 定量为1.05%~3.12%。

（四）临床应用

1.通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带，如HbH、HbE、Hb Bart、HbS等异常血红蛋白，应进一步定量检测HbH在pH 6.5电泳时仍向阳极移动（Hb Bart位于膜中间点样线），而其他Hb均泳向阴极。

2.HbA ₂ 升高，是β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者的特征性标志，故HbA ₂ 定量的准确与否，对于临床上β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者的筛查至关重要。HbA ₂ 增高至4%~8%，多数为轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血；若增高至10%以上提示HbE。其他一些疾病如肿瘤、疟疾、甲状腺功能亢进、HbS病等，HbA ₂ 也可轻度增高。

3.HbA ₂ 减低 遗传性HbF持续存在综合征（HPFH）、α-珠蛋白生成障碍性贫血、δ-珠蛋白生成障碍性贫血患者的HbA ₂ 含量较低。缺铁性贫血患者HbA ₂ 常降低，借此可与轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血鉴别。

二、抗碱血红蛋白测定

（一）检测原理

抗碱血红蛋白（HbF）抗碱能力比HbA强，在碱性溶液中，HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中可变性而被沉淀剂沉淀。测定其滤液中Hb含量，即HbF的含量。本试验中所使用的半饱和硫酸铵有停止变性反应、降低pH及沉淀蛋白的作用。

（二）标本要求与质量控制

1.滤液应清澄透明；呈淡黄或淡红色可能为血红蛋白含量高。

2.试验所用试管、吸管等仪器不可沾污酸碱。碱液浓度必须准确，其pH>12，校准后最好分装密闭保存，使用量和作用时间都必须十分准确。

3.酸性半饱和硫酸铵必须准确配制，其pH应为3.0，宜小批量分装。

4.每次试验宜用正常人血和脐带血（HbF含量高）作对照试验。

（三）结果分析与解读

成人HbF为1.0%~3.1%。新生儿为55%~85%，2~4个月后逐渐下降，1岁左右接近成人水平。

（四）临床应用

抗碱血红蛋白明显增高见于β-珠蛋白生成障碍性贫血患者，重型患者可达80%~90%。急性白血病、再生障碍性贫血、红白血病、淋巴瘤等也可轻度增高。

三、血红蛋白H包涵体检查

（一）检测原理

血液中加入煌焦油蓝，在37℃孵育后，血红蛋白H（HbH）因氧化变性而发生沉淀，呈颗粒状，弥散而均匀地分散在红细胞内，被染成墨绿蓝色，形成HbH包涵体。

（二）标本要求与质量控制

1.观察结果时，须注意与网织红细胞鉴别，后者一般呈网状或细小点粒状，与煌焦油蓝混合后在10min内即显现出来。必要时以孵育10min时血涂片进行比较分析。

2.HbH一般要在10min后至1h内产生包涵体。有些不稳定Hb用本法染色也可产生珠蛋白变性沉淀，形成变性珠蛋白小体，但需孵育更长时间（3min或更长）。

（三）结果分析与解读

HbH包涵体染色阳性时，在红细胞内出现大小不等、数目不一的墨绿蓝色圆形小体，分布不规则，散在于整个红细胞内。观察孵育1h后血涂片中1 000个红细胞，报告含有HbH包涵体阳性细胞的百分率，正常人为0~5%。

（四）临床应用

HbH病患者阳性的红细胞可达50%以上，轻型α-珠蛋白生成障碍性贫血时，偶见HbH包涵体。

四、异丙醇试验

（一）检测原理

非极性溶剂会使Hb分子内部的氢键减弱，稳定性下降，随时间推移，逐渐显现混浊和絮状沉淀。

（二）标本要求与质量控制

1.异丙醇溶液浓度（17%）及温度（37℃）要严格控制。pH不得低于7.2。

2.Hb液浓度为 100g/（70~130g/L），抗凝剂无影响。

3.Hb液需新鲜配制，久置可转变为高铁Hb造成假阳性。

（三）结果分析与解读

正常情况下为阴性。

（四）临床应用

本试验阳性提示存在不稳定Hb或HbH，需作进一步检查。此外，HbF及高铁Hb可有混浊发生。

（陶 玲） /hKdMxjd/kBvTjpuHs6spD3irkjMuZQm7oEh8vzlrjGT2Ieekx+5r/T5/1Ax8Cnq