第四节
核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术是分子生物学中最常用的实验技术之一，其通过碱基互补配对原则进行，除可检测标本中有没有目标DNA或RNA，还可以根据信号强度进行定量。核酸杂交技术已广泛用于基因筛查、基因突变分析、染色体异常检测、病原体检测及遗传性疾病的基因诊断。目前主要有印迹杂交技术、斑点杂交技术、荧光原位杂交技术。

一、印迹杂交技术

印迹杂交包括Southern和Northern印迹杂交，两种技术的原理相同，前者检测DNA，主要用于DNA图谱分析、基因变异分析、RFLP分析和疾病诊断等；后者检测RNA，主要用于检测特定基因的转录情况。

（一）检测原理

印迹杂交是分子杂交中的转移杂交技术，即先利用凝胶电泳对DNA片段进行分离，然后再转移（印迹）到固相基质（尼龙膜或硝化纤维素膜）上，最后与带有标记的核酸探针杂交，探针和具有同源性的待测核酸片段按照碱基互补配对原则退火，产生信号，通过检测信号强弱进行结果分析。

（二）标本要求

1.标本准备

（1）DNA标本：

将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，高盐下通过毛吸和虹吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜（尼龙膜也可）上，烘干固定后即可用于杂交。

（2）RNA标本：

使用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性后将其转印至硝酸纤维素膜上。RNA极易被环境中的RNA酶降解，因此操作过程尽量避免RNA酶污染。

（3）组织细胞标本：

组织经适当处理（包括样品固定、取材、玻片和组织切片的杂交前处理），去除核酸表面蛋白，并且使细胞通透性增加，让探针能够进入细胞内与DNA或RNA杂交。

2.质量控制

参见第七章第一节“核酸扩增的分子诊断技术”中实时PCR检测技术的标本要求、质量控制。

（三）结果分析与解读

印迹杂交技术共7个步骤：

1.限制性内切酶消化待测DNA。

2.电泳分离DNA片段。

3.DNA变性并转印到固相支持物上。

4.预杂交 目的是封闭非特异DNA吸附位点。

5.杂交 将探针与待测DNA单链分子互补序列在一定条件下形成异质双链。

6.洗膜 杂交完成后洗去未结合的和非特异性杂交的探针分子。

7.杂交结果的检测 放射性核素探针的杂交结果一般采用放射性自显影方法进行检测。将漂洗后的杂交膜与X线底片贴紧放进暗盒，曝光数小时到数天，X线底片在暗室中显影、定影即可。

（四）临床应用

主要用于单基因疾病的分子诊断，基因组的定性及定量分析、基因突变、限制性片段长度多态性分析及疾病诊断等。

1.血液病诊断

基因的缺失或突变，使核酸片段经限制性内切酶水解后，其长度呈现出多态性，因此利用Southern印迹法可对α-地中海贫血、血友病等遗传性血液病进行诊断。

2.肿瘤诊断

随着肿瘤发病机制的阐明及针对肿瘤的特异癌基因的发现，印迹杂交技术将成为肿瘤早期诊断、疗效与预后判断的有效方法。

3.病毒微生物检测

与传统的电镜观察、血清学方法和免疫细胞化学方法检测病毒相比较，印迹杂交技术具有高特异性及快速的优点，而且不依赖病毒的复制，可检查细胞中已存在的病毒基因。已有很多病原微生物可以通过核酸分子杂交技术进行检测，如乙肝病毒（HBV）、EB病毒、单纯疱疹病毒（HSV）、巨细胞病毒（CMV）、人乳头瘤病毒（HPV）、艾滋病病毒（HIV）、腺病毒、轮状病毒等。

（五）结果影响因素

核酸分子杂交是一个复杂的反应过程，受多种因素影响。

1.探针的浓度和长度

选择与靶核酸探针具有最大结合度的最低探针浓度，以避免浓度过低所致的杂交信号及过高导致的本底加深；探针长度以50~300bp为宜，杂交时间短且杂交率高，探针长可增强杂交信号但所需杂交时间增长且本底增高。

2.杂交温度

由于温度过低，非特异性结合不易解离，温度过高不利杂交体的形成，故选择较 T _m 值低25℃的杂交温度较为合适。

3.杂交液的离子强度

甲酰胺浓度溶液的离子强度较高时，可消除静电斥力，促进杂交，而甲酰胺能有效降低杂交的 T _m 值。

4.杂交率

在探针过量时，杂交率主要取决于探针长度和浓度。

5.洗涤条件

一般遵循温度由低到高而盐浓度由高到低的原则，温度越高盐浓度越低，杂交条件越严格。

6.促进剂

能够有效促进250个碱基以上探针的杂交率。

二、斑点杂交技术

斑点杂交或狭缝杂交是将核酸变性后直接点在膜上并固定，呈斑点状或狭缝状，随后用探针进行杂交检测，检测是否有杂交信号及信号强度，实现定性和半定量检测。

（一）检测原理

斑点杂交是印迹杂交的简化，不需要对核酸分子进行色谱或电泳分离，而是将核酸变性后直接点在膜上，与带有标记的核酸探针杂交，探针和具有同源性的待检测核酸按照碱基互补配对原则退火产生信号。

（二）标本要求

标本要求与核酸分子杂交技术标本要求相同。

（三）结果分析与解读

斑点杂交技术共10个步骤：

1.固相膜的处理

硝酸纤维素膜在水中浸湿，放到15×SSC中。

2.标本变性

DNA：样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。RNA：溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液，使RNA变性。

3.点样

使样品中的DNA或RNA与膜结合牢固。

4.预杂交

预杂交缓冲液进行预杂交，目的是封闭非特异性DNA或RNA吸附位点。

5.杂交

将探针与待测核酸单链分子互补序列在一定条件下形成异质双链。

6.洗膜

杂交完成后洗去未结合的和非特异性杂交的探针分子。

7.封闭

使用封闭液封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。

8.酶联反应

酶联抗体进行显色结合。

9.洗膜

洗去残留的酶联抗体结合物。

10.显色及结果分析

显色液须现配现用，并在要求时间内完成显色反应，读取显色结果。

（四）临床应用

1.血液病检测

利用斑点杂交法进行血液病基因突变的筛查，具有简便、快速、经济等优点，应用PCR体外扩增结合DNA反向点杂交技术可快速准确检测全血样本中β-珠蛋白基因上的多个突变位点，为β-地中海贫血的诊断提供重要的实验依据。

2.病原体检测

目前已用于肺炎链球菌、HIV-1、HSV-2、HPV6和HPV11检测，并且特异性好、灵敏度高，此外利用斑点杂交技术还可以对HPV进行基因分型，相比传统的DNA诊断方法具有操作简单、检测时间短、分型范围广、准确性高等优点。

（五）结果影响因素

与核酸分子杂交技术结果影响因素相同。

（吴巧萍） 8aQ1ZDHeSZLYCKQfCbLopbVv3oPdpFchH4/jADnWM9s5PLqo2805jqOoeu9G5Ew6