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体外酶促核酸扩增技术又称聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），它通过对目的基因片段进行百万倍的体外扩增放大，极大地提高了核酸分子检测的灵敏度。PCR技术发展至今，在方法学上有了诸多发展和延伸，如实时PCR检测技术、数字PCR检测技术、多重连接依赖式探针扩增技术等。
实时PCR（real-time PCR）检测技术是在DNA扩增反应中，加入示踪物质，可实时监测经PCR扩增后产物总量的变化，其测定速度快、特异性强、灵敏度高，可进行定量而得到广泛应用。
PCR技术的基本原理是依据DNA半保留复制的机制，通过变性、退火、延伸三步反应循环完成。理论上每完成一个循环，目的DNA扩增一倍，即靶标DNA数目以2 n 几何倍数扩增。实时PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光标记探针或荧光染料，这些荧光物质有其特定的波长，仪器可以检出。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。利用荧光信号积累可以实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
临床上采用的标本类型有血液、骨髓、组织、体腔液等含有细胞或核酸的标本。实验标本的正确采集对临床核酸扩增检验质量非常重要，标本采集的要求如下：
对血液病来说，需要该方法进行实验诊断的一定在初诊治疗前采集标本，治疗过程中进行治疗效果观察也要选准时机，以使检测结果具有代表性并能反映临床真实状态。
采集标本前，需要对采集部位进行清洁或者消毒，以去掉杂物和混入的微生物。
采样后应尽快送检，特别是组织和体腔液标本，防止储存过程被污染。
PCR属于临床核酸扩增检验范畴，其质量控制管理可分为实验前、实验中、实验后三个阶段。
指从临床医师开出医嘱到检验分析启动前的全过程，包括检验申请单的填写、患者的准备、标本采集、运送、保存、处理、接收和内部传输等各个环节。
包括测定标本的核酸提取、扩增和产物分析。质量控制和质量保证包括两个方面，即室内质量控制（internal quality control，IQC）评价和室间质量控制（external quality control，EQC）评价。按照实验室的SOP文件进行操作，定期进行IQC和EQC评价。IQC通过使用内标或定值的PCR质控品，对实验结果进行监测，排除假阴性或者假阳性，评价本实验室的检测能力。EQC是本实验室检测分析由行业管理部门或行业协会质控检测网发布的PCR质控品来评价实验室检测结果的正确度。
包括测定标本的保存及处理，检验结果的审核与发出，与临床医师或者患者的沟通三个方面。
荧光阈值和CT值是实时荧光PCR的重要参数。荧光阈值是指PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时设定的荧光值，高于阈值的荧光信号被认为是真实信号。CT值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（图7-1）。CT值与起始模板的关系：每个模板的CT值与该模板的起始浓度的对数存在线性关系，起始浓度越高，CT值越小；反之亦然（图7-2）。利用已知起始浓度的标准品可做出标准曲线。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。
图7-1 实时荧光定量PCR扩增曲线
图7-2 实时荧光定量PCR扩增CT与标本浓度关系图
目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域，其中临床应用主要集中在以下几个方面。
实时荧光PCR技术不但能有效地检测基因的突变，而且能准确测定表达量，可用于确诊一些遗传性血液病。另外，对血液肿瘤通过相关融合基因、突变基因的定量测定可早期诊断、明确诊断、评估治疗效果及判断转归预后，指导临床对患者实行个体化的治疗。
实时定量PCR以其速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，已被广泛应用于MRD的检测。白血病初发时，患者体内的白血病细胞数量为10 12 ~10 13 。诱导治疗缓解后，虽然显微镜下骨髓形态正常，但患者体内的白血病细胞仍然有10 8 ~10 9 ，这就是MRD，如慢性髓细胞性白血病（CML）、急性早幼粒细胞白血病（APL）经药物治疗达到细胞遗传学完全缓解后可通过实时定量PCR技术分别检测 BCR - ABL1 、 PML - RARA 融合基因来了解是否存在微小残留病灶。血液肿瘤需要多次巩固和强化治疗以进一步减少体内肿瘤细胞数，使MRD降到10 -4 以下，减少疾病复发的可能性。MRD检测的时间点及检测灵敏度对于复发预测尤为重要。MRD检测结果常与临床表现、细胞遗传检测和其他分子学数据一起被评估。
利用化疗药物进行抗肿瘤过程中，经常会导致耐药性的产生。目前研究发现主要的耐药机制有：ATP结合基因超家族的膜转运蛋白介导的耐药、凋亡基因介导的耐药、酶介导的耐药。多药耐药是多因素、多种机制共同作用的结果。实时荧光PCR技术可以通过检测耐药基因表达量，来了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略。通过检测用药前后及复发时肿瘤细胞耐药基因mRNA表达的变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。
实时荧光PCR技术可以对EB病毒、巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲/乙型流感病毒、淋球菌、沙眼衣原体、结核分枝杆菌等病原体进行快速、准确检测，有助于各种病原体和病毒的临床诊断。
影响临床核酸扩增检验的因素非常多，主要有以下几个方面。
（1）引物的设计和荧光探针的选择。
（2）引物退火温度。
（3）引物的浓度。
（4）引物、探针的纯度和稳定性。
（5）热启动。
（6）反应体系中镁离子的浓度等。
标本是否正确采集以及标本的质量同样可以影响检测结果。例如，标本采集时机是否合理，检测标本是否采集成功，血清（浆）标本是否溶血、脂浊等均可影响实验结果。
模板的质量同样也是影响实验结果的一个重要因素。DNA标本中如果混入PCR抑制物，如酒精、氯仿、苯酚、二甲苯胺以及乳胶手套上的滑石粉等，就会抑制扩增反应，影响实验结果。而模板的浓度过低，扩增的效果也同样不理想。
实时PCR是一种敏感的扩增技术，虽然它较普通PCR来说，在控制污染方面已经取得了比较明显的进步，但是仍然不能完全排除污染。小量的外源DNA污染仍可以与目的模板一块被扩增，造成假阳性的结果。
在条件允许的情况下定期进行背景校准、空间校准、染料校准或温度校准，以使仪器状态维持稳定。
数字PCR（digital PCR，dPCR）检测技术是一种核酸分子绝对定量技术，通过对PCR产物DNA分子进行逐个计数的方法对标本进行精确定量，是对起始标本的绝对定量。
对待测标本进行稀释，使其达到单分子水平。将稀释好的标本随机分配到几十到几万个反应单元中，进行PCR扩增。将扩增产物与荧光探针杂交，然后对每个反应单元的荧光信号进行统计，从而实现对待测标本原始拷贝数的定量检测。
数字PCR按照分液技术的不同，主要分为微孔板（microplate）、微流体芯片（microfluidic chip）、微滴式（droplet digital PCR，ddPCR）3类。其中ddPCR应用最广泛，该方法是在传统PCR扩增前把测试标本分割成成千上万的水包油微滴，分割后每个微滴成为1个独立的PCR反应单元，通过使用高度均匀的微滴大大提高了检测系统的精确度。
标本要求、质量控制与实时PCR检测技术相同。
数字PCR的定量方法为直接计数法，该技术通过对待测标本的稀释使得每个反应单元中的DNA模板达到单分子水平。在PCR扩增反应结束后，每个具有荧光信号的反应单元中都至少含有一个拷贝分子，将有荧光信号的记为1，无荧光信号的记为0，直接对有荧光信号的反应单元进行计数即可得到目标DNA分子的拷贝数。由于数字PCR是一种终端分析法，若目标分子没有很好的离散化，如一些反应单元包含多个目标核酸分子，那么理论上得到的结果将不准确，因此引入泊松概率分布函数（Poisson distribution）用以分析数据，根据反应单元总数、含有荧光信号的单元数及标本的稀释系数，可得到标本的初始浓度。
数字PCR系统的敏感性和准确性比传统的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）更高，其在临床应用方面也日趋广泛，可体现在以下几个方面。
数字PCR与常规qPCR相比，通过单分子扩增降低了背景DNA的影响，提高了阳性反应的信噪比，具有更高的准确性、灵敏性和重复性。对于血液肿瘤的MRD检测来说，应用数字PCR检测技术可以在更低的水平上获得更为精确的检测结果，可以达到更深度的MRD检测。
当病原微生物的含量较低或标本中存在抑制剂，这些因素对qPCR的定量都会产生一定的偏差，而数字PCR技术对标本量的要求非常小，可以有效地解决这些问题。目前已经证明数字PCR在乙肝病毒、甲型流感病毒、艾滋病病毒等病毒检测中，比传统qPCR方法具有更高的敏感性和准确性。
影响数字PCR的因素非常多，大部分与实时PCR相同，需要特别注意的是待测标本的分散效果非常关键。数字PCR通过稀释标本使其达到单个分子水平，再通过传统的PCR扩增，当分散效果不理想，每个反应单元中包含两个以上DNA模板分子时，将影响检查结果的准确性。
多重连接依赖式探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）是应用杂交、连接及PCR扩增的一种DNA相对定量技术，是一种高分辨率检测基因组序列中变异重复拷贝数的方法，能检测到新的缺失和扩增，可以检测单一外显子的拷贝数的改变，能检测50~70个核苷酸的片段，具有操作简单、灵敏度高、稳定可靠等特点。
MLPA探针主要被设计成为左、右两个探针。其中左侧探针3′端为与靶序列完全互补的杂交序列，5′端为PCR通用引物序列。右侧探针5′端为与靶序列完全互补的杂交序列，3′端为PCR通用引物序列以及这两个序列中间的长度特异填充片段（不同的检测位点具有不同长度的填充片段）。
将模板DNA双链高温变性至完全解链，然后降温至适当温度使两探针分别与模板杂交，加入连接酶，调节至连接温度，将两个探针连接，当待测模板中存在靶序列突变或者缺失，则该探针不能完成杂交与连接反应。
MLPA技术的最大特点就是以连接完好的探针为模板，使用一对通用引物。前引物和后引物分别位于左、右探针的末端。PCR扩增只在连接完整的探针上进行，而未完成连接反应的探针则不被扩增。不同检测位点的探针上有不同长度的填充片段，该片段长度不同使连接后的MLPA探针长度不同，故其扩增片段长度亦不同，此时可以通过电泳将产物进行分离。
标本要求、质量控制与实时PCR检测技术相同。
MLPA产物经琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳进行分离，利用特定软件进行分析，一般方法为将原始数据归一化处理后，通过与正常对照进行比较分析，产物峰增高或峰面积升高表示靶基因拷贝数增加，产物峰或峰面积降低或缺失表示靶基因存在缺失或变异。
MLPA测定靶序列DNA只要有一个碱基的改变，便可导致杂交不完全，使其扩增产物缺失，因此MLPA高度特异性的检测可用于多种单核苷酸多态性和点突变。
MLPA技术具有高通量、低成本、分析简便的优点，通过MLPA检测急性髓细胞性白血病（AML）中预后有关突变基因拷贝数的改变可为患者预后提供依据。使用MLPA方法研究发现PAX5扩增的急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿更易复发。
研究发现许多肿瘤都是由于基因缺失或重复引起的，如 MLH1 和 MSH2 基因缺失可导致遗传性非息肉病性结直肠癌。应用MLPA技术可检测出肿瘤相关基因的缺失及重复信息，目前MLPA已经应用于肿瘤如遗传性非息肉病性结直肠癌、黑素瘤、脑（脊）膜瘤及头颈部鳞状上皮细胞癌等的检测。
MLPA还被用来检测人类基因组拷贝数变异、单核苷酸多态性、突变、基因表达及甲基化。
影响因素与实时PCR检测技术结果影响因素相同。
（吴巧萍）