第二节
荧光原位杂交技术

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种非放射性标记分子杂交技术，弥补了传统染色体核型分析无法对间期细胞、复杂核型及染色体微小缺失检出的局限。作为基于细胞形态基础上的分子检测，已经在临床血液病实验诊断、肿瘤相关分子检测等实验研究中广泛应用。

一、检测原理

利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光素的单链DNA作为探针和与其互补的待检目标样本的DNA杂交，探针能特异性地结合在细胞涂片或组织切片细胞中的DNA序列互补区域，通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况，可进行定性、定位或相对定量分析。

二、样本要求与质量控制

FISH检测对被测样本没有特殊要求，可以用来自骨髓的细胞、外周血的细胞、冷冻切片的标本及石蜡包埋的标本。对于G显带的染色体核型标本，还可以用75%乙醇或甲醇脱色，继续进行FISH检测和分析。

用于FISH检测的细胞无须经过培养扩增，制备好的玻片可以放在-20℃环境存放6个月，信号强度基本不变。探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键，其检测准确性以及能否运用于某个领域的关键来源于探针的设计，而且探针还必须具备经过原位杂交的处理而不变性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片段。荧光基团的标记也直接影响检测的灵敏度和原位杂交结果。

其他质量控制内容参见第七章第四节“核酸分子杂交技术”。

三、检测结果分析与解读

由于FISH检测简便快捷，结果直观准确，因此已成为许多疾病包括血液病实验诊断的重要检测工具。通过一系列特异性DNA序列探针的设计，荧光标记的DNA探针能定位于特定染色体位点上，使原位杂交技术在细胞克隆类型甄别与分子检测之间架起一座沟通的桥梁。FISH技术对分裂期、分裂间期的细胞均可以检测。FISH还可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。FISH技术还可以应用几种不同颜色荧光素标记的多个DNA探针同时测定，因此一次杂交可显示多个荧光信号，能够更准确更直观地显示染色体的数目或结构异常。

肿瘤或遗传疾病机制的主要特征是克隆性染色体异常，它通常包括染色体、基因数目异常和结构异常。

采用计数探针标记一段特异性的DNA片段，这个特异性的片段可以是某条染色体特有或者是某段基因特有，由于正常人的染色体是二倍体，那么正常人的检测信号就是两个，当信号多于两个或者少于两个（排除切片影响），该染色体或者基因的异常就会明显地表现出来。正常细胞为2红2绿，基因缺失或扩增的阳性信号模式即为2红1绿或2绿1红。

当采用结构探针时，某基因发生重排时会在相对恒定位置断开，通过不同颜色荧光素标记断裂点两端特异性的DNA片段，该基因没有发生重排时，不同颜色（如红、绿）靠近会发生混色形成其他颜色（如黄），如果发生断裂，则形成单独的颜色（如单独的红或绿）。采用融合探针时，正常信号为2红2绿。检测的染色体一条发生融合时，显示为1红1绿2黄。

染色体上细带的丢失，普通核型显带法检测不易发现，用特定的基因探针检测时，在正常应该有荧光信号的部位如不出现信号，表示有染色体的丢失。FISH还能有效地检测染色体上定位扩增的特定DNA的可能来源，特别是当细胞遗传学发现在染色体均质染色区（HSR）或异常的显带区域（ABRS）来源及位置不明时，推测可能扩增的肿瘤基因，从而有目的地检测某些基因，并能很快得到直接清晰的基因扩增的信息。

四、临床应用

FISH技术的主要优点体现在：①FISH不需要放射性同位素作探针标记，安全性高；②探针稳定性高，一次标记后可在2年内使用；③实验周期短，能迅速得到结果，特异性好且定位准确，可以从增殖系数低或终末分化细胞中得到细胞遗传学的数据，从而检测出某些传统染色体核型分析认为是正常核型的细胞遗传学异常，提供更强的检测敏感性；④FISH能通过多次免疫化学反应，使其杂交信号明显增强，从而提高灵敏度，FISH技术可定位长度在1Mb的DNA序列；⑤FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针，再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子，因此可以用荧光显微镜在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到它们的相关位置和顺序。

FISH检测技术的局限性在于：①不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率下降。②不能检测未知背景的遗传学异常，不能分辨杂合性缺失和单亲源二倍体。③FISH检测一次最多只能检测5~8个位点，无法进行整个基因组的检测。

FISH技术在临床诊疗中的应用主要集中在产前诊断、血液肿瘤诊断、感染性疾病诊断及实体瘤的诊断和药物靶向治疗等领域。在血液肿瘤的应用中，FISH可以检测任何组织类型染色质和基因的异常，利用合适的探针可对血液病患者发挥辅助诊断、预后评估、残余病灶、早期复发及评估治疗方案等的效能。常见的恶性血液病FISH检测靶点分述如下。

（一）急性粒细胞白血病

常用FISH检测靶标： AML1 - ETO 基因融合、 PML - RARA 基因融合、 CBFB 基因断裂、 MLL 基因断裂。如 AML1 - ETO 基因融合在AML患者中的发生率为20%~40%，在WHO分型中列为独特的伴重现性遗传学异常的亚型。 AML1 - ETO 基因融合阳性是预后好的标志，患者对治疗反应佳，完全缓解率可达90%，5年无病生存率可达50%~70%。 MLL 基因断裂在成人AML中，则主要见于M4/M5亚型，除 t（9；11）、t（10；11）以外，大部分 MLL 重排白血病缓解率低，并且第一次缓解后极易复发，生存率短，预后很差。

（二）急性淋巴细胞白血病

常用 FISH检测靶标： ETV6 （ TEL ）- AML1 基因融合、 TCF3 （ E2A ）基因断裂、 BCR - ABL 基因融合、 KMT2A （ MLL ）基因断裂及4、10、17号染色体数目异常。ALL中遗传学改变发生的频率可达80%~90%，遗传学变异较大，但大部分是特异性改变，与特定的形态学和免疫表型有关。ALL中遗传学改变主要是两种形式，一是染色体结构异常，二是染色体数目异常。

（三）慢性髓细胞性白血病

常用FISH检测靶标： BCR - ABL1 基因融合，患者可检可测出t（9；22）（q34；q11）易位。有些慢性髓细胞性白血病（CML）患者通过普通的核型分析难以检测到Ph染色体，但用FISH技术或PCR扩增技术检测出基因融合存在，仍被归为Ph ⁺ CML分类。

（四）慢性淋巴细胞白血病

常用FISH检测靶标：13q ^- ，+12，17p ^- ，11q ^- 。由于CLL细胞增殖低下，体外培养增殖慢，进入分裂中期的细胞少，传统的核型分析有困难。常规染色体显带技术仅22% CLL可检测到克隆性染色体异常。近年来，随着间期FISH技术的应用，CLL染色体异常的检出率大大提高。

（五）骨髓增生异常综合征

常见的细胞遗传学异常主要是染色体缺乏或非整倍体，因此FISH检测靶标多选择5q、7q、20q、8、X/Y，其中5q ^- 是MDS的一个独立亚型。

（六）淋巴瘤

常见的异常包括： MYC - IGH 、 BCL2 - IGH 、 CCND1 （ BCL1 ）- IGHALK 基因融合，以及 IGH 、 MALT1 、 BCL6 等基因断裂。用于辅助诊断伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、等，也有助于评估预后和选择治疗方案。

（七）嗜酸性粒细胞增多症

常用FISH检测靶标： PDGFRA 基因断裂、 PDGFRB 基因断裂和 FGFR1 基因断裂。WHO将具有 PDGFRA 、 PDGFRB 或 FGFR1 基因断裂异常，伴嗜酸性粒细胞增多的髓系和淋巴系肿瘤独立成一个新类，这类患者具有 PDGFRA 基因重排、 PDGFRB 基因重排或 FGFR1 基因重排，即使不伴有 BCR ABL 基因融合，依然对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼治疗敏感，治疗后完全缓解率高。

对于G或Q显带难以确定的染色体结构改变，运用FISH技术可以帮助解决。许多不能归类的标记染色体，FISH技术可以确定畸变的来源。

（赵晓武） rdM/Osp26Tsd8Rb83wBGFL/C9El+ImFaKmUMn3h5XRKC4FkR0+pffP76ezrVF+HU