第一节
流式细胞术的原理

一、流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪根据其功能的不同分为分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪，其基本结构相同，包括液流系统、光学系统和电子信号收集分析系统，分选型流式细胞仪还包括细胞分选系统。

液流系统的液流包括鞘液流和单细胞流，后者的压力高于前者，两者形成稳定的同轴流动，即单细胞流位于轴心位置，鞘液流包裹着单细胞流在外围。液流经过流动室的喷嘴形成非常细的高速流体，位于流体中央的单个细胞逐一通过激光照射区，不同大小、内部特征及结合荧光抗体的差异被作为细胞信号逐个记录下来，用于后续分析。液流流速越高，单位时间内通过激光照射点的细胞越多，分析测试的速度就越快。

光学系统主要是提供激光光源。结合了不同荧光抗体的细胞经激光照射后产生散射光信号和荧光信号，这两种光信号通过光路系统一系列的透镜、滤光片等，将不同波长的光信号送入不同的光路分离系统，由不同的接收通道接收，再由电子信号收集分析系统将光信号转换为电信号记录储存。计算机和专用的分析软件将采集到的细胞信息以直方图、散点图、密度图等形式分析并图形化。

分选型流式细胞仪通常采用电荷式细胞分选技术将具有相同光信号特征的目标细胞从混合细胞中进行分选纯化。理论上分选出的细胞群纯度高，可用于单细胞培养、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等。

二、流式细胞仪的检测信号

荧光素偶联的特异性抗体对待测细胞进行标记，标记后的高速流动的单个细胞，经特定波长激光照射后，细胞产生的散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收。

（一）散射光信号

散射光信号是样品细胞自身物理特征的反映，代表细胞的大小和复杂性这两个基本的物理特性，包括：

1.前向角散射（forward scatter，FSC）

又称0°散射光，是正对入射激光方向接收到的散射光，其强度反映了细胞的大小和体积。

2.侧向角散射（side scatter，SSC）

是与入射激光方向在同一水平面并形成一定角度的散射光，其强度与细胞复杂性（包括细胞核的有无和弯曲情况，胞内有无颗粒及大小）有关。

（二）荧光信号

荧光信号反映了不同细胞的生物学特征，它是荧光染料偶联的抗体与细胞表面的抗原分子、膜糖蛋白等特异性结合后，荧光素被特定波长的激光激发所产生的荧光。荧光通道接收的信号越强，表示细胞上结合的该荧光素越多，就表示该荧光素偶联抗体所结合的抗原分子量越多，因此根据荧光信号的强弱可判断细胞被测抗原分子的相对含量。

三、流式细胞术的数据分析

流式细胞仪每秒分析上万个细胞，对于荧光素标记的细胞而言，会得到散射光信号和荧光信号，将这些信号通过流式细胞图的形式进行显示和分析。常用的流式图有直方图、散点图、密度图等。

（一）流式图

1.单参数直方图

是对细胞单个参数的检测数据进行分析，只能显示细胞1个指标参数的信息。 x 轴表示一个参数的信号，可以是散射光的光信号，也可以是荧光通道的光信号， y 轴表示细胞数量。直方图反映了细胞数量与光信号强度的关系。

2.双参数散点图

能同时反映同一个细胞的2个指标参数的信息。 x 轴表示一个指标的信号， y 轴表示了另一个指标的信号（图5-1）。散点图密集程度形成的不同细胞群落（population），一个点代表一个细胞，反映符合某种指标特征的细胞数量。

双参数散点图包括二维点图、等高线图和密度图，不仅能反映细胞两个参数的关系，还能反映细胞的数量，了解细胞的分布情况和细胞数量的频度。等高图以等高线形式显示细胞的集中程度，密度图的细胞数量密度有不同的颜色代表。

（二）数据分析

数据分析的目的是鉴别出检测样本中的细胞构成及是否存在异常细胞。借助专用的FCM分析软件通过“设门”的方法，应用单参数或多参数流式图，圈出感兴趣的细胞群，即确定所要分析的区域，再对区域内的细胞各个参数的表达情况进行定性、定量分析。

1.散射光（FSC/SSC）设门 应用细胞的大小和颗粒度这两个物理参数，将FSC和SSC相似的细胞划为一个区域。人外周血细胞的FSC/SSC散点图中，每一个点代表一个细胞，按照细胞的大小和颗粒度分为三群。正常淋巴细胞体积最小（FSC较小）且形态规则无颗粒（SSC较小），而粒细胞稍大（FSC较强）且含有大量颗粒（SSC较强），单核细胞介于两者之间。骨髓中存在不同发育阶段的即过渡期细胞，细胞构成复杂，单纯应用FSC/SSC设门分析无法将各个细胞亚群完全区分开，需应用不同的设门组合进行分析。

2.散射光和荧光设门 可应用FSC/荧光、SSC/荧光设门，也可应用系列标记抗原进行设门。CD45/SSC设门是目前国际上通用的白血病/淋巴瘤设门策略，依据白细胞表达CD45强弱不同和细胞颗粒度大小的不同，将骨髓细胞分为淋巴细胞（lymphocyte）、单核细胞（monocyte）、粒细胞（granulocyte）、幼稚细胞（CD45dim）、有核红细胞（CD45neg）几个细胞群体（图5-2）。应用系列标记抗原进行设门，如应用CD45/CD38或CD38/CD138设门寻找浆细胞。设门组合不是固定的，需根据样本的特征和临床特征进行设门。血液疾病的骨髓标本成分较复杂，要想准确设门就需要应用多参数数据来区分正常和异常的细胞群体。

3.数据分析时，检测的组合每种抗体都要分析，以评估血细胞的抗原表达情况，并充分结合临床表现、形态学检测、细胞遗传学检测和分子学检测等，对疾病进行综合分析，并给出建议、解释和结论。

（袁小庚） DiNg2oC8QW+OKLU6KBYjtzLEEoVsiwUIobRGVHEjMSsrYH3CRV2MYbrS6LQTrnLo