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代谢组学（metabolomics）是众多组学中的一种，是随着生命科学的发展而发展起来的。与基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）、蛋白组学（proteomics）不同，代谢组学是通过考察生物体系（细胞、组织或生命体）受到刺激或干扰后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或随时间的变化，从而研究生物体系的一门科学。所谓代谢组学是基因组的下游产物，也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子量小于1 000的内源性小分子。生物体的代谢产物可以通过多种途径扩散、释放至体外，因此研究者通过收集富含代谢信息的样本进行定性、定量分析。目前，常用作代谢组学分析的样本包括：全血、血浆、尿液、消化液、胆汁、粪便、呼出气等，其中呼出气样品中蕴含有生物体大量的代谢信息，并且可以无创且轻易的获取，因此，呼出气代谢组学分析成为近年来代谢组学领域中研究的热点和焦点，我们在PubMed里检索“volatile organic compounds and breath”，可以看出关于呼出气挥发性有机化合物的出版物自2010年开始快速增加（图1-1-1）。
图1-1-1 随时间增长的、与“挥发性有机化合物与呼出气”有关的年度出版物
在远古时代，希腊医师已经意识到受试者的呼出气异味和可能相关疾病之间的关系。希波克拉底在其关于呼出气香气和疾病的专著中首次描述了口臭和胎儿肝。Antoine Lavoisier在18世纪后期发明了第一种“现代”的呼出气分析方法，他通过发现豚鼠体内产生的二氧化碳，得出了动物的呼吸作用实质上是缓慢的氧化过程，从而取代了燃素理论。他的发现构成了二氧化碳图的基础，二氧化碳图是有史以来最常见的呼出气测试。半个多世纪以后，在1857年，布拉格的Wilhelm Petters在一名糖尿病患者的尿液（丙酮尿）中发现了丙酮，并在糖尿病患者的呼出气中发现了“奇怪的苹果和紫罗兰样气味”。1897年，Nebelthau确定了慢性饥饿期间呼出的丙酮量，发现每日呼出约3.6g，而丙酮只有大约1/10是通过尿液排泄的。Johannes Müller于1898年发现了糖尿病患者的混合呼出气中的丙酮浓度超过百万分之一（part per million，ppm）水平。研究估计健康的非饥饿志愿者丙酮的平均值约为400ppb（0.4ppm）。在饥饿期间，健康人的丙酮浓度可以增加到5.8ppm。到了20世纪，人类发现了呼出气中的其他分子。1949年，Davidson证明重症肝病患者的呼出气中存在硫醇，并假定这些分子是被称为“胎儿肝”的气味起源。在60年代，乙醇也在呼出气被发现，而乙腈在吸烟者的呼出气、血液和尿液中均能检测到。1977年，在人的呼出气中测量了氨气，1979年，Lovett等人报道了氨气的实时分析。1977年，Simenhoff等人报告了在患有终末期肾病“尿毒症呼出气”中可检测到二甲胺和三甲胺。1974年，Cohen及其同事在呼出气中鉴定和定量了脂质过氧化产物——短链碳氢化合物，他们提出这些挥发性碳氢化合物的浓度可以用作体内氧化应激的生物标记。这项研究是第一个假设呼出气分子（碳氢化合物）产生机制的出版物。
人类呼出气是一种化合物含量丰富的生物介质，是包括来自外源性（环境）和内源性（代谢）的气体、气溶胶以及呼出气颗粒的复杂混合物。呼出气中最丰富的成分是氮气、氧气、水蒸气和二氧化碳。除这些主要成分外，还含有微量浓度的无机和有机化合物，其中一些化合物可能为了解个体当前的生理和健康状况提供信息。呼出气分析具有以下优点：①采样简单、无创，可按需进行；②呼出气取之不尽，允许重复采样；③分析可在诊室立即进行；④采样不需要专业技术人员。因此呼出气分析用于疾病诊断具有很好的应用前景。近年来，在呼出气生物标志物领域的发现和应用方面取得了一定的成功，但在开发出可用的检测方法之前，仍须克服许多挑战。
呼出气分析是基于对呼出气中挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）的检测和定量。VOCs是一类具有足够挥发性的含碳化合物，在室温下可以在气体中检测到。美国环境保护署将饱和蒸气压＜0.1mmHg的化合物定义为具有“挥发性”。VOCs目前在环境污染评估、香料制造、反恐等领域已经是较为成熟的应用。临床实践中呼出气VOCs分析包括酒精呼出气检测仪、幽门螺杆菌的 13 C呼出气检测、哮喘的呼出气NO检测和小肠细菌过度生长的氢甲烷检测等。1971年，两届诺贝尔奖得主莱纳斯·鲍林报告了应用气相色谱法（gas chromatography，GC）对呼出气样品中250种挥发物的定量。GC是在马丁和辛格（诺贝尔化学奖，1952年）发明色谱之后进行的，而质谱（mass spectrum，MS）是由阿斯顿（诺贝尔化学奖，1922年）首次提出的，GC-MS组合提供了分离和鉴定气体样品的可能性。自20世纪90年代以来，用于大气化学的直接进样分析技术，如质子转移反应（proton transfer reaction，PTR）-MS和选择性离子流管（selected ion flow tube，SIFT）-MS，已被用于呼出气VOCs的分析。利用这些技术，质谱检测可直接在电离样品中进行，无需事先校准即可定量。在离子迁移谱方法中，电离样品与缓冲气体和一个或多个电场相互作用，以实现分析物的分离。离子迁移谱可以作为独立仪器使用，也可以与质谱仪结合使用。硅芯片质谱已被开发用于选择性检测和定量羰基化合物（醛和酮）。近年来，二维气相色谱（two-dimensional gas chromatography，GC×GC）与快速质谱检测器（如飞行时间）的结合，进一步提高了检测分辨率，使呼出气中VOCs的检测达到ppb或ppt水平，以更精确地识别和定量VOCs，进而研究疾病诊断的呼出气生物标志物。
VOCs生物标志物的检测和分析在开发快速、非侵入性和廉价的癌症筛查工具方面具有很大的潜力，因此有希望成为癌症诊断的前沿性方法。VOCs是相对分子质量较低、蒸气压较高的有机化合物。癌症患者的血液、尿液、粪便、皮肤或汗液、呼出气以及癌细胞和组织的顶空（密封容器中在癌细胞上方的VOCs混合物）中都可以检测到与癌症相关的VOCs。大多数对VOCs生物标志物的分析都是在呼出气样本中进行的，因为这些样本易于收集和分析，呼出气VOCs测试可以频繁进行，并可能反映癌症进展情况，这些优势有助于临床中疾病的诊断和监测治疗。此外，呼出气测试是无痛和非侵入性的，因此适合儿童和危重患者。呼出气VOCs既可以来自外源性挥发物，也可以来自内源性挥发物。对于外源性挥发物，化合物可以通过皮肤从外部环境吸入或吸收，也可以通过口服食物产生。对于内源挥发物，化合物可以在生理或代谢过程中产生。就癌症而言，病理生理学引起新陈代谢改变，进而可导致VOCs成分和浓度的改变。一般认为癌症的发生与以下一种或多种因素有关：氧化应激增强、CYP450的诱导、糖酵解率高、乳酸产生过多、基因变化、蛋白质变化和脂类代谢。因此，理论上讲，肿瘤细胞将产生反映疾病状况的独特VOCs曲线，这些VOCs可以被排泄到体液中，在组织中迁移，并可能储存在脂肪中。这些特定的VOCs可以进一步释放到血液中，并在血液系统中循环。根据血-气分配系数（λ b∶a ），血液中的VOCs也可以在气道和肺泡内交换，非极性VOCs在血液中的溶解度较低（λ b∶a ＜10），即具有较低的血-气分配系数，几乎只在肺泡内交换。相反，易溶于血液的极性VOCs（λ b∶a ＞100）倾向于在气道中交换，10＜λ b∶a ＜100的VOCs可在气道和肺泡内交换。作为血-气分配系数的结果，VOCs的分布还受其在血液中的浓度和化合物在肺内滞留时间的影响。总体而言，内源性VOCs可以通过血液从器官运输到肺部，经过气体交换后从气道呼出。当病理过程发生时，人体的生物化学会发生改变，导致内源性VOCs的变化和呼出气成分的变化，这就产生了一种独特的呼出气指纹（breathprint），像每个人的不同指纹一样，每个人的呼出气也可能成为独特的呼出气指纹。因此，检测内源性VOCs可以区分包括癌症在内的各种疾病，并提供健康状况的重要信息，而对外源性VOCs的评估则表明接触了药物或环境化合物。
然而，呼出的气体中含有成百上千种VOCs，浓度从ppm到ppt不等。因此，正确区分外源性VOCs和内源性VOCs，以及稳定识别独特的疾病VOCs是一项具有挑战性的工作。为了从呼出气中检测出低浓度的特定VOCs，并提高早期诊断的准确性，人们开发了许多呼出气采集和分析方法，虽然大部分的方法已经证实可以用于呼出气检测并成功区分了疾病和正常组，但是，其中一些方法既没有提供有关VOCs的定性或定量信息（例如，狗的鼻子或电子鼻），也没有提供与仪器相关的信息，例如PTR-MS和SIFT-MS。目前对于呼出气中VOCs的最佳定性和定量测定，气相色谱-质谱法（GC-MS）仍然是最常见的应用方法。关于呼出气的样本采集和分析方法，在第二章和第三章会详细介绍。
在研究疾病相关的VOCs之前，需要了解正常人的呼出气VOCs。在健康受试者的呼出气中已检测到3 000余种VOCs，并且在健康人的呼出气、唾液、血液、母乳、皮肤分泌物、尿液和粪便中共确定了近2 000种VOCs，这在第六章会详细介绍。健康受试者和患者之间的VOCs差异可能与疾病有关，例如呼出气样本中的许多VOCs与气道炎症或癌症有关。Philips等应用呼出气VOCs分析方法检测了住院患者与健康对照组，结果发现呼出气中的苯乙烯、烷烃和苯癸烷与结核病相关。Montuschi等报道一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化碳（carbon monoxide，CO）可能反映气道的氧化应激，这是哮喘的重要病理生理学基础。Montuschi等人的研究表明，呼出气样本中8-异前列腺素浓度的升高与哮喘患者的氧化应激水平相关。随着呼出气中8-异前列烷浓度的增加，氧化应激水平也增加，这能够提示哮喘的严重程度，即呼出气样本中的8-异前列烷浓度可能是检查哮喘严重程度的潜在生物标志物。其他潜在的生物标志物，如亚硝基硫醇（RS-NOs）、白三烯B4和亚硝酸盐与慢性阻塞性肺疾病（COPD）有关。RS-NOs和亚硝酸盐参与内源性NO形成，在气道生理上参与亚硝化应激，可能参与气道炎症的病理生理过程。Corradi等的研究表明，COPD和哮喘患者呼出的RS-NOs可被检测到，并在呼出气样本中升高。白三烯和前列腺素作为炎症中的脂质介质，可能在COPD中发挥重要作用。白三烯B4可能参与了呼吸道炎症细胞的聚集和氧化应激。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和8-异前列腺素与肺癌有关，在肺癌发生过程中，5-脂氧合酶和环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）过表达。PGE2和8-异前列烷作为COX-2代谢的最终产物，在肺癌患者气道内增加，并与肿瘤的发展有关。此外，呼出气VOCs分析还可以用于检测其他疾病，例如呼出气样本中VOCs如1-甲基3-庚酮、甲基环十二烷、1-丙氨酸乙酰胺和己醛等的测定可用于检测感染性疾病和神经病学疾病。
综上所述，呼出气VOCs的分析为许多疾病的诊断提供了一种有前途的工具，它能够以非侵入性的方式发现人体内的代谢过程。然而，人体呼出气VOCs的数据非常复杂，而且高度多元化。因此，如何从这些数据中提取有意义的信息是一个重要的问题。化学计量学领域为勘探、可视化、分类和预测提供了多种多变量方法。这些不同的技术使人们能够从实验数据中获得经验模型，然后这些模型可以用于生物学解释，本书的第四章和第五章中将详细介绍呼出气代谢组学数据的预处理和统计学方法。
呼出气分析在疾病检测、治疗监测、对个性化药物的酶活性表型的测定以及肺或胃细菌感染的检测方向有很大的潜力。然而，多数呼出气分析的临床应用目前还没有经过多中心试验的验证，也没有得到美国食品药品监督管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）或欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）的批准。已获FDA批准的呼出气测试包括：①呼出气二氧化碳测定法（呼气末二氧化碳是生命的标志，是正确放置气管插管的金指标）；②新生儿黄疸的呼出气一氧化碳检测（CO是HO-1酶催化血红素分解代谢产生的）；③呼出气氢和甲烷测试用于肠胃诊断（如：果糖和乳糖吸收不良、肠胃运输时间、细菌过度生长）；④呼出气一氧化氮测试监测哮喘治疗；⑤呼出气酒精测试血液酒精含量（执法）；⑥用于检测心脏移植排斥反应的呼出气测试；⑦ 13 C呼出气试验检测幽门螺杆菌。
呼出气包括外源性分子（例如吸烟者的呼出气乙腈或人暴露于燃料后的呼出气甲基叔丁基醚）、内源性分子（如异戊二烯、丙酮、乙烷、戊烷、一氧化氮）以及微生物代谢产物。某些化合物可能被摄入（如丙戊酸、 13 C-氨基比林、果糖或乳糖），而它们的挥发性代谢物可以在呼出气中被观察到（如3-庚酮、 13 CO 2 、氢或甲烷）。目前呼出气分析驱动的生物技术主要集中在以下几个方面：
1. 13 C-尿素呼出气试验检测胃幽门螺杆菌感染。在西方国家，幽门螺杆菌的感染率是25%，在成人生活中随着年龄的增长而增加。幽门螺杆菌感染的流行程度与年龄大致相同，根除幽门螺杆菌的治疗问题之一是对抗生素（如克拉霉素）的耐药性。在过去10年中，推荐的根除方案的成功率从90%以上下降到大约80%。到目前为止，与胃镜检查相比，呼出气检测具有无创性、快速、易于重复的优点，更容易让受试者接受。
2.呼出气分析用于癌症筛查。近10年来，呼出气最热门的应用领域集中于癌症的诊断，包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌等。呼出气中有超过100种挥发性生物标志物被认为与癌症有关，仔细验证所有这些化合物是十分重要的。这是由于很多化合物的鉴定仅基于光谱库匹配，并没有比较呼出气样品中峰的保留时间与天然标准品的保留时间。此外，由于吸烟可以引起肺癌和慢性阻塞性肺疾病，在寻找生物标志物时区分烟草燃烧的产物是很重要的。对呼出气的分析可以通过对癌细胞的顶空培养和癌组织的研究来补充。
3.呼出气分析用于肝、肾功能及哮喘的诊断。例如 13 C-甲基乙酰丙酮呼出气试验或 13 C-氨基比林呼出气试验，可以估计肝脏微粒体酶的活性（CYP1A2）；一些胺类挥发性化合物例如氨和三甲胺具有诊断肾病的潜力；呼出气一氧化氮（FeNO）被广泛应用于哮喘和COPD的诊断等。
4.环境暴露后VOCs或其代谢物的观察。因吸烟或暴露于航空燃料、臭氧、柴油废气或麻醉而造成的人体暴露。
5.观察肠道或气道中细菌或真菌产生的挥发性化合物，例如由铜绿假单胞菌（ pseudomonas aeruginosa）产生的氰化氢和2-甲基丁酸乙酯，由金黄色葡萄球菌产生的（Z）-2-甲基-2-丁烯醛，由流感嗜血杆菌产生的邻羟基苯甲醛，由肺炎链球菌产生的3-苯基呋喃，由白念珠菌产生的乙烯基乙醚。
6.监测氧化应激状态，特别是在手术期间。乙烷和戊烷是两种很有前景的氧化应激生物标志物，可以用激光光谱实时观察。其他呼出气生物标志物（如与肺部细菌感染相关的二甲基硫醚）可在重症监护室使用。
7.呼出气药物代谢动力学研究，即通过患者或志愿者摄入某种化合物或药物（例如丙戊酸酯、 13 C-氨基比林、果糖或乳糖）以确定其代谢动力学（例如呼出气中的3-庚酮、 13 CO 2 、氢或甲烷浓度升高）。
英国每年确诊的癌症患者超过30万例，实施肿瘤切除术200万例。手术过程中，即便是最优秀的外科医生也不能确保完全切除肿瘤，而只要有“漏网之鱼”，就容易引起癌症复发、癌细胞转移，可能需要二次手术。借助术前扫描来了解手术部位，并且，为尽量清除癌细胞，会切除肿瘤周边组织。切下来的组织样本被送往化验室，以确认是否病变组织。在摘除乳腺癌肿瘤的手术中，近1/3都无法做到完全抹除肿瘤的痕迹。这一比例证明：在外科医生严重依赖于术前收集的医学影像及其他信息的情况下，想要完全切除癌症肿瘤到底有多么困难。
英国帝国理工学院的Zoltan Takats教授说道，“尝试摘除癌组织就像是闭眼开车一样难以做到。”就目前而言，外科医生能够获取的信息都并非直接信息，而是来自于术前评估的间接信息。而这就意味着，他们永远都不会确切地知道自己正在切除什么东西。英国帝国理工学院的研究人员发明了一种智能手术刀（iKnife），能够快速区分健康组织和癌细胞，有助于手术时更精确地切除肿瘤，提高术后存活率。英国癌症研究会的埃玛·金医生说：“智能手术刀能在手术过程中引导外科医生，是一项激动人心的发明。”这种外科手术仪器能让外科医生知道他们正在切除的组织是不是癌变组织。
iKnife是一种电子手术刀，这种手术刀的探针可使用电荷烧穿人体组织。电子手术刀从20世纪20年代一直沿用至今，但与以往的电子手术刀不同，其可从被烧灼的人体组织所散发出的蒸气中提取有用信息。传统的电子手术刀只是单纯地吸走蒸气，而iKnife则可将其导入一个质谱仪，从而对其化学成分进行分析。通过将蒸气的化学特征与数千种人体癌变和非癌变组织的特征进行对比，iKnife能让外科医生知道自己正在切除哪种类型的人体组织（图1-1-2）。通常情况下，这种分析在不到2秒的极短时间内即可完成。这种仪器配备了一个触摸屏监控器以显示分析结果，还可通过音频信号向医生通报信息。早期测试表明，这种仪器可在外科病房环境下精确辨别人体组织类型，而目前其研发团队正致力于设计一种可在手术室中使用的医疗级质谱仪。临床试验表明，与现有的电子手术刀规程相比，iKnife能帮助外科医生切除更多的癌变组织，同时还可降低对肿瘤周边健康人体组织的伤害，尤其在宫颈疾病治疗中的术中诊断具有优势。
摘除更多的癌变组织能够降低癌症复发的概率。以乳腺癌为例，30%的（外科手术）病例中会有肿瘤组织残留，而这些组织会发展为新的肿瘤。早期测试表明，这种仪器可在外科病房环境下精确辨别人体组织类型，一则美国《科学转化医学》刊载的报告表明，在91例肿瘤切除术中的测试结果显示，智能手术刀的准确率为100%。它的工作过程可以总结为以下三个步骤：①医生用iKnife接触肿瘤边缘。②切割过程会冒烟，这种烟包含灼烧组织的信息，研究人员将收集的烟传入质谱仪，分析烟的化学成分，从而判断灼烧组织是否癌细胞。③结果很快显现在手术医生身旁的屏幕上，有时甚至用不了1秒。实心圆圈代表肿瘤组织，空心圆圈则是健康组织。
图1-1-2 iKnife的工作原理示意图
iKnife可以吸取手术中不同区域的VOCs，将其注入到质谱中进行快速分析，通过对比正常与肿瘤不同的VOCs，来区分恶性肿瘤与良性组织
iKnife开发乳腺癌识别模型的一个障碍是数据收集的破坏性、耗时和敏感性。Santilli等人首先通过有限的数据标记构建自监督学习模型，该模型可以通过学习将iKnife数据的一般特征与更容易获得的癌症类型相关联。其次，经过训练的模型可以应用于乳腺癌的分类数据，例如从一种组织类型的模型转换到另一种组织类型。
Livia Ebervin带领的得克萨斯大学奥斯汀分校研究团队开发出了一种实时组织学诊断设备，命名为MasSpec Pen。据称它能够在10秒之内确定手术切缘组织的良恶性状况，用时是现行病理诊断手段的1/150。手术切除实体肿瘤时，对切缘性质的判断是非常关键的。但到底切除多大范围，才能实现完整切除不留后患呢？临床实践中并没有统一的标准，手术中更多要依靠术者根据术前检查结果、肿瘤形态、切除组织量对正常生理功能的影响等因素进行判断。
MasSpec Pen的整套设备主要由三个部分组成：一台微量注射泵、双向活瓣导管和形状与一支笔相似的手持探测器，还有旁边的质谱分析仪。MasSpec Pen的工作原理可概括为：随着生长失控，肿瘤细胞的代谢会出现明显失调，与正常细胞的差异极大，因此我们用MasSpec Pen对组织进行像采集指纹一样的提取和分析。通过简洁和平缓的化学过程，MasSpec Pen就能在不造成组织损伤的状况下迅速提供给我们诊断所需的分子信息，探测器注入极微量的水，提取出患者体内的小分子物质，然后将提取物传递到质谱分析仪，进行良恶性的判断。整个过程中，探测器接触组织的时间仅需3秒，而判断可在10秒钟之内完成。
当然，为了实现良恶性的判断，还需要首先收集用来判断的数据。研究人员先从正常的组织中获取相关的数据图谱，并与解吸电喷雾电离-质谱成像（desorption electrospray ionization-mass spectrometry imaging，DESI-MSI）法的结果进行比对，结果基本一致。再用同样的手段对癌组织进行检测，标定出与正常组织明显不同的图谱表现，让MasSpec Pen有了判断的基础。在实现快速判断的同时，MasSpec Pen的损伤也是极小的，相比大手术时十几厘米的切口，400μm的取样，基本可以称为完全无创了。研究人员使用MasSpec Pen对包括肺、卵巢、甲状腺、乳腺在内的253份人体组织样本进行检查，其中近半为癌症组织，发现每种癌症都会出现不同的质谱图，而数据分析的结果显示，MasSpec Pen的诊断特异性可以达到96.2%，敏感性为96.4%。
在人的呼出气中能够检测到大约3 000种VOCs，大多数呼出气样本通常含有200种以上的VOCs。其中包括小的无机化合物（例如NO、O 2 、CO 2 ）、VOCs（碳氢化合物、醇、酮、醛、酯）和非挥发性物质（例如异前列腺素、细胞因子、白三烯和过氧化氢），这些非挥发性物质可在呼出气冷凝物中被发现。
人的呼出气中存在的主要VOCs包括异戊二烯、丙酮、乙醇、甲醇、烷烃和其他醇，患有特定疾病的患者的呼出气挥发物特征与正常挥发物特征不同。但是，大多数VOCs的来源和生理功能仍然未知。呼出气中的某些VOCs来自环境，因为它们可能作为污染物通过皮肤吸收或通过吸入或摄入吸收。这些化合物可能在体内代谢，然后通过呼出气而排出。内源性VOCs是人体代谢过程或肠道细菌活动的产物，会在人体内产生，并随人体的代谢而产生变化。影响人类呼出气成分变化的因素主要包括受试者的总体健康状况、食物摄入、环境影响和整体生活方式等。
又名二甲基酮，是一种有机物，分子式为C 3 H 6 O，结构式如图1-1-3所示。丙酮是最简单的饱和酮，是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味，易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂，易燃、易挥发，化学性质较活泼。丙酮是人类呼出气中最丰富的VOCs之一。
图1-1-3 丙酮的结构式
在人体内，丙酮有两大生理来源。第一个来源是乙酰乙酸的脱羧，而第二个来源是异丙醇的氧化。除此之外，丙酮是酮体的一部分（2%），在酮症患者、糖尿病失控患者和饥饿期间，血液中的酮体会增加。在饥饿时，肝糖原储备耗尽，人体开始分解脂肪代替葡萄糖作为能量，就会产生酮体。开始主要在肝小叶的静脉周围区域，随后它们被带到血液中，从而使循环中的酮体水平至少提高一个数量级。当酮体水平较高时，将随呼出气和尿液排出。
在一项针对囊性纤维化（CF）患者的呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）代谢组学的研究中，使用高分辨率2D-NMR光谱法鉴定了丙酮和其他代谢产物。与健康对照组相比，CF患者的丙酮、乙酸盐、乙醇和2-丙醇浓度升高。在CF患者中，稳定的CF受试者的乙醇和2-丙醇水平较高，而不稳定的CF受试者的乙酸盐和甲醇水平较低。因此，包含丙酮的特定VOCs分析可能会为CF的检测和病理生理学提供进一步的见解。
又称2-甲基-1，3-丁二烯（2-methyl-1，3-butadiene），是一种有机化合物，分子式为C 5 H 8 ，无色易挥发液体，其结构式如图1-1-4所示。异戊二烯不溶于水，可溶于乙醇、乙醚等多数有机溶剂，可通过丙烯二聚法制备，用于合成橡胶、丁基橡胶单体等，也是呼出气中最常见的VOCs之一，其在人呼出气中的烃类中含量最高。它被合成为许多重要化合物的前体，并始终存在于人的呼出气中。
图1-1-4 异戊二烯的结构式
异戊二烯沿胆固醇合成的甲羟戊酸途径在胞质中形成。在大鼠肝脏中，通过酸催化的二甲基烯丙基焦磷酸酯的消除反应产生胞质异戊二烯。在某些植物中，该反应由含Mg 2+ 的酶催化。在哺乳动物组织中，异戊二烯可通过Mg 2+ 依赖性异戊烯基焦磷酸异构酶催化反应生成。该酶催化异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的相互转化。异戊二烯的另一个可能来源是角鲨烯的体内过氧化自由基介导的。异戊二烯已被鉴定为胆固醇代谢异常的标志物，例如高胆固醇血症。儿童的异戊二烯浓度与成人相比较低，随着年龄增长，异戊二烯水平会增加，直到25岁左右不再增加。呼出气的异戊二烯还可能与检测背景有关，例如在某些植物中已经检测到产生异戊二烯的非甲羟戊酸途径，因此环境中的异戊二烯可能对检测结果产生影响。
呼出气中直链烃（乙烷和戊烷）的存在是细胞膜中多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）脂质过氧化的结果。脂质过氧化是一种自由基介导的过程，在该过程中，PUFA受到了潜在的影响，形成了各种各样的羰基二次氧化产物，这些产物随后在呼出气中被排泄。氧化应激是指自由基产生和抗氧化剂系统的平衡被破坏而有利于促氧化剂自由基生成的状态，它存在于衰老和很多疾病的病理机制。例如，乙烷和戊烷水平的升高与乳腺癌中的氧化应激、心脏移植排斥反应、支气管哮喘、类风湿性关节炎、急性心肌梗死和精神分裂症等疾病的氧化应激有关。
是ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸（亚麻酸、亚油酸和花生四烯酸）分解过程中形成的主要挥发性烃。戊烷会在人体脂肪库中积累，在几天内缓慢释放，被肝细胞色素P450部分代谢。乙烷是高度挥发性的，在组织中相对不溶。乙烷在形成后迅速释放，且代谢极少。因此，乙烷是反映PUFAs氧化降解的主要来源。呼出气乙烷的测量可能会提供体内脂质过氧化的敏感标志物，并直接表明受试者发生生理事件的时间。
易挥发的硫化合物，如乙基硫醇、二甲基硫醚或二甲基二硫醚会引起肝硬化患者呼出气的特征性气味。甲硫氨酸在转氨途径中的不完全代谢会在人体内产生含硫化合物。肝功能受损的患者体内含硫化合物的水平升高，这些化合物与肝病和恶臭有关。
例如二甲胺和三甲胺，已被确认是导致不同程度肾衰竭患者（包括尿毒症患者）独特呼出气气味的原因。如果由于肝功能受损而限制了转化为尿素的氨，则血液中会出现大量的氨。氨不会在体内积聚，因为它是来自蛋白质和核酸代谢的天然人体产物。氨被转化为尿素和铵盐，并以这些形式随尿液从体内排出。但是，氨也会通过肺排出。对于由于尿道幽门螺杆菌细菌性胃部感染引起的肾脏疾病或溃疡引起的尿素平衡紊乱的患者，测量呼出气中的氨水平可能是一种快速的诊断方法。
综上所述，呼出气代谢组学研究具有采样无创、患者依从性强、可重复采样等优点，使得呼出气代谢组学在未来的临床应用中具有诱人的前景。然而，到目前为止，呼出气研究的大多数报告研究规模较小，并且缺乏外部验证。临床研究的复杂性给疾病呼出气生物标志物的筛选带来巨大的挑战，体外研究可能是推进呼出气疾病诊断有价值的工具，但是应考虑不同环境下体外研究与体内研究中的结果可能不同。实时分析技术的发展将进一步扩展呼出气分析作为无创、快速诊断工具的潜力。此外，收集样本、分析样本和数据报告程序的标准化也是研究重点。除了检测的准确性，成本效益、装置的小型化和耐用性是呼出气检测仪器研发的关注重点。呼出气生物诊断技术在未来的个性化诊断领域中具有巨大的潜力，为了取得更大的进步，需要紧密的跨学科（技术专家、卫生从业者、监管机构和商业专家）合作。
呼出气中生物标志物的检测作为一种诊断特定疾病的工具越来越受到关注。总体来说，如果能够证实可靠的疾病呼出气生物标志物，对于疾病尤其是癌症的早期诊断和治疗将会有重要意义。
首先，对于出现可能是癌症早期的非特异性常见症状的患者，呼出气分析可以作为一种预检分诊检查，指导患者进行更专业的检查，这尤其适用于基层医院。例如，如果全科医生正在评估一名胃肠道症状不典型有待转诊的患者，他们就不需要观察和等待症状是否恶化，而是立即进行呼出气分析，一名护士就可以执行测试并将呼出气样本送到实验室进行分析。如果结果是肯定的，就有理由立即转诊进一步检查。如果检测结果为阴性，可以继续观察。如果症状持续存在，还可以重新检测或进行其他必要检查。其次，使用呼出气检测还可以作为初级保健筛查，呼出气检测的无创性非常有利于增加患者的耐受性。最后，呼出气分析用于监测癌症治疗的效果及疾病复发，如检测手术切除后结直肠癌的复发。但是需要明确不同确定肿瘤分期以及组织学和分子亚型与呼出气VOCs的关联。
然而，目前已确定的与疾病有关的生物标志物仍然较少，不同研究之间的疾病生物标志物差异较大，这与采样方法、分析方法以及数据处理都密不可分。如何排除呼出气检测众多的影响因素，建立科学的采样方法、分析方法是目前呼出气分析面临的巨大挑战。
在呼出气检测中，排除外源性VOCs是十分重要的。由于呼出气中相当一部分分子来自环境，如吸入（污染）的空气和饮食，因为这些外源性VOCs有可能被错误地识别为疾病标志物。在某些情况下，某些VOCs的浓度过高会影响整个样本的VOCs组成（例如，严重糖尿病患者的丙酮、进食大蒜或酒精饮料）。因此，在样本采集时需要遵循两种方法。第一，人们可以尝试消除所有可能的混杂因素，例如将VOCs从吸入的空气中排除，并对食物摄入提出严格的条件，即禁食一段时间。第二，允许并计算呼出气可能的变异/混杂因素，方法是在取样前不设置任何限制。这些变异的多样性预计将在要比较的群体之间平均分配（例如，健康患者和患病患者），进而使用统计方法来消除VOCs中所有不相关的混杂因素。此外，呼出的化合物也可能与人体新陈代谢无关，而是来自共生微生物或微生物感染。细菌在口腔、肺和肠道中无处不在，并且是VOCs的强力制造者。这将在第十一章详细介绍。
在人类呼出气中，VOCs是一种低分子量的挥发性分子，其特征是在室温下具有高蒸气压。这些VOCs在体内产生，通过血液循环系统输送到肺部，然后通过呼吸排出。人们发现，呼出气中VOCs的浓度是微量且变化的，通常在百万分之一（part per million，ppm）至万亿分之一（part per trillion，ppt）。由于其浓度很低，因此进行VOCs浓缩对呼出气分析十分重要。目前较为常用的浓缩方法包括固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）和针阱法（needle trap device，NTD）。NTD有时比SPME适用范围更广，因为它提取过程简单、不消耗溶剂、灵敏度高。尽管正在不断开发用于生物和非生物应用的SPME不同涂层材料，但对呼出气中VOCs（ppt水平）的分析对于与某些疾病相关的微量水平生物标志物检测仍然具有挑战性。在这方面，通过SPME涂层材料的进一步发展有望在不久的将来克服这一限制。此外，虽然现代临床研究表明同位素呼出气分析对追踪受试者的代谢紊乱非常有效，但迄今为止没有研究报告使用SPME或NTD进行同位素呼出气分析以筛查疾病。使用便携式分析仪器对呼出气样本进行现场分析，有望实现实时监测各种疾病的呼出气及其变化。这类工具的开发和商业化将有助于提高床旁医疗的发展，通过对疾病发展过程的无创监测，可能会发现疾病不同阶段的生物标志物变化，有利于疾病的早期诊断、早期治疗以及治疗效果监测。
研究人员在寻找癌症的潜在生物标志物时采取了不同的方法，问题集中于究竟选择体内还是体外研究。呼出气研究的理想目标是将癌症的不同VOCs用于建立一种100%准确地检测患者癌症的设备。然而，到目前为止，无论是呼出气、血液、尿液还是来自患者的任何其他样本，都不能够建立准确的挥发性生物标志物。主要原因是检测到的VOCs的来源不确定，因为它们的浓度不仅取决于疾病的存在，还取决于许多其他因素，如遗传和环境因素、年龄、性别等。因此，在微细胞水平上研究肿瘤产生的VOCs，可以对体内研究进行补充。细胞水平的研究对肿瘤的生物化学信息提供了很大的价值，可以更直接地解释色谱图中化合物的来源。然而，在体外方法中也存在一些不确定性，主要原因是人们对VOCs代谢途径的复杂性知之甚少，即肿瘤细胞产生的VOCs与其在患者样本之间的关系，并且体外和体内的代谢环境和过程可能存在差异，从而对VOCs产生影响。然而，体外研究是推进癌症生物标志物研究的有价值方法。理想情况下，研究应该将患者的癌细胞或组织中的VOCs与同一患者的呼出气、尿液和血液中检测到的化合物进行比较。为了消除尽可能多的变量，选择控制也至关重要。因此需要更多的研究来比较肿瘤细胞产生的VOCs与呼出气或生物流体中发现的VOCs，以及许多细胞系和原发性肿瘤样品产生的VOCs，以便尽可能多角度地描绘细胞、肿瘤以及机体产生的特定癌症相关VOCs。
在VOCs的生物化学来源方面，近年来取得了较多进展，但大多数仍是未知的。了解导致每种VOCs的生化途径对于准确诊断和靶向治疗至关重要。呼出气分析与其他高维分析技术（例如代谢组学和功能基因组学），以及其他生化工具将有助于确定VOCs的来源。虽然VOCs指纹图谱可以用于诊断，但它可能更有助于对患者进行表型，从而满足在疾病早期识别患者亚组，从而定制治疗方案。近年来，VOCs分析已经与疾病分期、痰中存在的炎症细胞类型、慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者的鉴别相联系。此外，VOCs可以区分儿童哮喘的恶化。体外研究最近表明，微小的遗传变化已经可以诱导不同的挥发性特征，表明VOCs指纹可以反映特定的突变，从而能够在例如肺癌中鉴定特定的基因型。
为了更为高效、便捷地进行呼出气代谢组学的相关研究，近年来研究者建立了人类呼出气组学数据库（human breathomics database，HBDB）。HBDB使得更多初学者或非专业人士也可以通过短时间的学习，快速地进行呼出气分析的研究。呼出气分析过程包括用分析平台识别呼出气样本中的化合物，使用化合物名称作为生物医学文献中的关键字手动搜索呼出气数据。研究人员可能需要结合疾病名称搜索化合物名称，以检索有关疾病和化合物的相关信息。但这个过程耗时长，而且常导致引用不相关的信息。HBDB的目标是将已知的人类呼出气学信息整合到一个单独的、交叉引用的和有组织的数据库中，为关键词搜索和按字母顺序浏览提供一个可靠的平台。迄今为止，HBDB包括2 766项人类呼出气学参考文献、913种化合物和49种疾病。在HBDB的搜索界面，可以搜索到目前研究发现的某一疾病的潜在呼出气生物标志物、标志物的特性和与之相关的疾病。
通过呼出气组学数据库，初学者或非专业人士也可以通过短时间的学习，快速地进行呼出气分析的研究。以“哮喘”为例，我们在HBDB中以“哮喘”作为关键词，在化合物、参考文献和疾病的选项卡中显示419篇相关文献、18种化合物和8种疾病。相关文献的搜索结果包括标题、期刊名称、发表年份和作者，相关化合物按表中相关引用计数降序排序。
化合物表中的每一行都包含具有化学结构的化合物名称。NO、过氧化氢，白三烯B4和8-epi-pgf 2α是HBDB中记录最多的与哮喘相关的化合物。查询关键词“哮喘”的疾病，如哮喘、哮喘儿童、哮喘伴变应性鼻炎，都包含一个到疾病页面的链接。用户可以确定哪些疾病可能与疾病表中查询的关键字相关联。在复合视图中，用户可以根据收集到的参考文献中的描述查看有关疾病可能机制的信息，并可以了解化合物如何与哮喘或其他疾病联系在一起。
8-epi-pgf 2α，也被称为8-异前列腺素，是哮喘患者EBC中氧化应激的标志物。8-异前列腺素是一种稳定的、内源性的、具有生物活性的化合物，使其有望成为哮喘、COPD或呼吸道炎症疾病中氧化应激的标志物。据报道，在哮喘、COPD、阻塞性睡眠呼吸暂停、气道炎症和肺部疾病，8-异前列腺素的浓度增加。与8-异前列腺素相关的疾病被绘制在人体生理图上。用户可以看到，8-异前列腺素与气道、肺和心脏病（如哮喘、肺癌和心力衰竭）相关，在HBDB的复合视图中查看有组织的疾病列表。用户还可以在HBDB疾病视图中阅读相关参考文献列表。8-异前列腺素是与哮喘相关化合物中氧化应激的标志物。此外，肥胖也可能与8-异前列腺素有关，在Komakula等人的研究中，体重指数与哮喘患者呼出气8-异前列腺素水平升高相关。
3-硝基酪氨酸是活性氧化物质的产物，可导致细胞损伤。而3-硝基酪氨酸在哮喘患者的EBC中升高，并被认为是哮喘氧化应激的标志。除与哮喘相关外，3-硝基酪氨酸还与囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）相关。一项研究报告了CF中硝基酪氨酸的水平明显高于正常受试者。他们认为硝基酪氨酸的升高反映了CF患者氧化应激的增加。然而另一项研究报道，儿童呼出气冷凝液中的游离3-硝基酪氨酸不能作为稳定囊性纤维化和哮喘中氧化应激的标志物。
（李恩有 魏绍婷）