下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
与在线质谱仪相比，基于激光的光谱仪可以提供精确的定量分析结果，而该仪器并不一定需要专业技术人员操作。已经有一些光学呼出气分析仪用于监视临床应用中不同的生物标志物，例如用于二氧化碳分析的非分散红外光谱仪，在呼出气中测量 13 C以诊断幽门螺杆菌感染（产生胃溃疡的细菌）和胃癌，监测呼出气中甲烷（methane，CH 4 ）的红外光谱仪，以电化学传感器检测氢（hydrogen，H 2 ）和氧（oxygen，O 2 ）诊断胃肠道疾病，腔环衰荡光谱系统用于检测呼出气中的丙酮代谢状态异常，例如糖尿病。这些光学呼出气分析仪在现实生活中的成功应用表明这些系统的光明前景，尤其是那些使用激光作为光源的系统。
激光光谱仪可以对单种或几种挥发性化合物进行实时（亚秒级分辨率和呼吸周期解析）检测，检测极限范围从百万分之一到十亿分之一。快速的在线采样与实时检测相结合，降低了对采样和存储的需求。此外，呼吸周期解析采样具有显著优势，因为它能够对不同的呼吸时相中存在的挥发物/生物标志物进行连续测量。高精度、绝对准确度和呼吸周期解析的采样使研究者能够收集更多的数据，减少呼吸时相带来的差异，并可以描述呼吸道中的气体交换过程，使我们能够更好地了解（潜在）生物标记物的来源和化学途径。此外，还可以详细描述哪些生物标志物与疾病真正相关，这一直是呼出气领域研究人员面对的主要困难之一。呼出气分析的未来可能在于监测与对照或与基准值相比生物标志物浓度的变化，尤其是确定对干预措施的具体反应（例如不同病原体、药物治疗或同位素标记摄入等）。
通常对于几乎所有的呼出气分析来说，100ppt的检测限是足够的。大多数VOCs的环境水平将高于此浓度。已经提出了几种方法来校正呼出气测量中环境背景的影响，但是这些方法都不是完全可靠的。如果目标物质在呼出气中的浓度很高（例如丙酮、异戊二烯、氨、甲烷和一氧化碳），则此检测限显然是足够的。对于实时测量，采集速率需要在1～10Hz之间。这样可以完整描述各个呼吸周期，并解决分析物与二氧化碳波形之间的差异。
可调谐二极管激光吸收光谱法、腔衰荡光谱法、集成式腔输出光谱/腔增强吸收光谱、光声光谱、石英增强光声光谱和光频光谱，这些技术的选择是基于它们的成熟度和在临床上的巨大应用潜力，以及它们在呼出气研究中的应用频率。基于激光的光谱学呼气分析所达到的检测极限取决于所选技术的灵敏度。可以通过两种不同的方式来提高吸收测量的灵敏度：增加吸收路径长度或增加信噪比。通过标准的单次吸收测量，只能量化呼出气中高丰度的化合物，例如利用非分散红外光谱进行 13 CO 2 / 12 CO 2 同位素比率分析，该技术已在临床上成功应用于通过尿素呼出气试验诊断幽门螺杆菌感染，并使用稳定的同位素标记底物评估药物代谢酶的活性。为了检测浓度低于百万分之一浓度的呼出气中存在的分子，可以通过使用多程吸收池（multipass cell，MPC）或采用共振腔增强方法例如CEAS来增加吸收路径的长度。此外，光束的强度可以在特定的频率下进行调制，以通过相敏检波器滤除仪器噪声。波长调制光谱和频率调制光谱方法可以用于增加信噪比。光声光谱法除了通过吸收来测量激光强度的降低外，光声还通过增加声强来测量吸收的结果，进而实现光程短吸收光谱的可比性。
使用单一设置可检测的分析物浓度通常取决于所用激光源的类型。光学呼出气仪器的当前标准实现使用具有有限可调谐性的激光器；这通常会将每个仪器的分析物数量限制在几个。使用更宽的可调谐激光器，例如光学频率梳，其光谱覆盖范围将显著增加，可检测的分析物数量也将显著增加。
可调谐二极管激光吸收光谱（TDLAS）是吸收技术的总称，该技术采用单模半导体激光器的单通道或多通道配置和/或使用调制技术来降低噪声。因此，TDLAS包括直接（单程）吸收光谱、波长调制光谱（wavelength modulation spectroscopy，WMS）、频率调制光谱（frequency-modulation spectroscopy，FMS），以及各种多程吸收池（multipass cell，MPC）（例如赫里奥特细胞、白细胞或环形细胞）。
典型的光源包括可见光和近红外光谱范围内的分布式反馈（distributed feedback laser，DFB）二极管激光器（0.7～3µm）、垂直腔表面发射激光器（vertical cavity surface emitting laser，VCSEL）、DFB带间级联激光器（interband cascade lasers，ICL）（3～6µm）、量子级联激光器（quantum cascade laser，QCL）（4～14µm）和中红外液氮冷却的铅盐可调二极管激光器。这些激光器可通过改变注入电流或温度，在狭窄的波长范围内进行无模跳变波长调谐，通常可同时靶向检测1～3种低分子量物质。对于扩展的多物种检测，可以组合两个（或多个）窄带激光器。另一种方法是使用外腔二极管激光器（external cavity diode laser，ECDL）和外腔量子级联激光器（external cavity quantum cascade lasers，EC-QCL），其中激光器安装在包含波长选择装置的光腔中，该波长选择装置可提供较窄的线宽和宽带波长调谐范围。
基于直接吸收光谱法的设置，只能用于检测呼出气中二氧化碳（carbon dioxide，CO 2 ）和水蒸气（dihydrogen monoxide，H 2 O）等高度丰富的物种，通常会达到10 -5 ～10 -3 cm -1 ·Hz -1/2 的噪声等效吸收灵敏度（noise equivalent absorption sensitivity，NEAS）。在线实时NDIR光谱法测量和分析二氧化碳呼出曲线（二氧化碳图）是迄今为止在临床实践中最广泛使用的呼出气分析应用。使用调制技术和/或MPC，可以将灵敏度提高几个数量级。例如，通过单程WMS可以灵敏地检测呼出气一氧化碳（carbon monoxide，CO）。呼出气分析中最灵敏、最常用的TDLAS方法是将WMS与多遍增强功能结合在一起。典型NEAS通过使用中红外的强基本分子跃迁，可以对许多重要的呼出气生物标记物实现低ppb范围的检测限。实时呼出气分析有时与对高灵敏度的需求不兼容，通常需要较长的信号积分时间（数十秒）才能实现。此外，时间分辨率还受到典型的多通道样品池的大样品体积（约0.5L）的限制，从而限制了气体交换时间。对于较丰富的气体，例如CO，可以实现亚秒级采集时间的实时呼出气分析。
一氧化碳，作为一种细胞信号分子，是目前使用WMS和/或MPC增强的TDLAS研究的生物标记之一。由于内源性CO主要的来源是血红素的代谢，因此该分子是氧化应激和呼吸系统疾病的潜在生物标记物。由于暴露于外源性CO（吸烟、空气污染）会影响检测结果，所以与传统的电化学CO传感器（用于评估吸烟状况）相比，基于TDLAS的CO检测具有更高的灵敏度、精度和时间分辨率，因此更适合于CO生理学的研究。
总而言之，TDLAS和多程吸收光谱法在高光谱和时间分辨率下具有良好的灵敏度和选择性，并且结构更加优化且价格合理。大多数实施不需要校准（使用具有更高准确性的标准仪器）即可获得具有高精度和高精度的定量结果。该方法适用于选择性检测呼气末浓度低至ppb水平且强烈吸收分子跃迁的呼气生物标志物。对于呼气末浓度约为1ppm的主要呼吸物种和生物标记物（CO、CH 4 、NH 3 和N 2 O）可以进行实时检测。因此，在实践中，TDLAS非常适合一种或几种此类生物标志物的靶向检测，迄今为止，TDLAS一直是临床应用中最成功的呼出气试验之一。
许多呼吸生物标记物的含量低。因此，为了获得必要的灵敏度，必须采用超灵敏腔增强吸收光谱法。与多程吸收池相比，利用腔增强吸收（cavity enhanced absorption，CEA）原理可以进一步增加吸收路径的长度。在CEA实验中，将呼出气样本封入高精细光学腔中，在这样的系统中，光学腔的吸收路径长度取决于腔镜的反射率，并且在路径长度上可以达到几十千米，特别是在镜面镀膜技术的波长区域。在中红外波长区域，镜面反射率通常不那么明显，但可以通过更强的吸收来补偿分子跃迁的线强度。原则上，用于TDLAS的所有激光器类型也可以用于CEA仪器。CEA实验可以在许多不同的环境中使用。最常见的方法之一是记录光学腔内激光强度的时间演变并提取衰减的时间常数，这种方法是腔衰荡光谱法（cavity ring-down spectroscopy，CRDS），其已在许多呼出气研究中被采用，可以记录泄漏出腔的激光强度的总量，被称为集成腔输出光谱（integrated cavity output spectroscopy，ICOS）或简称腔增强吸收光谱（cavity enhanced absorption spectroscopy，CEAS）。
腔增强吸收光谱：在许多呼出气研究中，使用仪器平均时间（从几秒到几分钟不等）来探测静态呼出气样本。但是，实时激光光谱测量可以得出呼吸周期内主要呼出气的重要生理和医学信息。一个重要的例子是Ciaffoni及其同事的最新工作，他们开发了一种传感器，可以通过逐次呼吸来确定接受麻醉和/或麻醉插管患者嘴中的耗氧量（oxygen consumption，VO 2 ）。该分析仪被称为分子通量传感器（molecular flux sensor，MFS），其结合了最先进的流量计，在光腔中利用二极管激光吸收，后者可立即适应（10ms分辨率）以适应变化的气体成分。在这里，已经有了最新的进展，通过将宽带射频噪声应用于激光器，CEAS测量的灵敏度得以提高。MFS设备将吸气和呼气之间流量感应的偏差从5%降低到了0.2%，并且可以量化对标准操作的生理反应。该设备应该进行进一步研究，以了解各种程度的电击患者中一系列常见干预措施对VO 2 的影响；这些干预措施包括使用输液、输血、升高的氧气和血管活性药物。此类研究是使用滴定疗法进行介入性临床研究的目标导向算法设计的前提。最近，同一研究小组认识到，高精度和时间分辨的MFS数据提供了从稳定呼吸到氮气多呼吸冲洗（multibreath washout，MBW）阶段提取与肺不均匀性有关的信息的机会。MBW相的形状编码肺泡通气宽度对体积分布的量度，而在呼气过程中CO 2 和O 2 出现的轮廓则编码解剖死腔及其在肺中的分布。CO 2 和O 2 呼气图之间的不对称性反映了通气与灌注比在肺中的分布，这是两者之间血气化学差异的结果。
Mountain等应用高精度、高时间分辨的气体交换测量开发了评估肺不均匀性模型。该模型具有一个参数集，可以使用气道MFS测量呼出气气体流量来识别该参数集。可以还原的关键参数是肺分布的标准偏差（σ），包括：①死腔区域（吸入的不参与气体交换的气体，因为其存在于上呼吸道，或到达未灌注或灌注不良的肺泡）；②肺部顺应性分数（肺部伸展和扩张能力的量度）；③血管电导率（通过肺的血流量的量度）。他们研究了6名健康的年轻参与者（20～30岁）、6名健康的老年参与者（70～80岁）和6名慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者，在每个参与者上重复该方法6次。该模型很好地拟合了数据，并且测试之间的参数值具有很高的可重复性。方差分析显示，在所有组中，对于所有3个参数，各组之间以及各组中的个人之间存在非常显著的差异，所有COPD患者的σ个体值始终高于任何对照参与者。这些初步结果表明，这种测量能够无创区分肺疾病。
光反馈腔增强吸收光谱：光反馈腔增强吸收光谱学（optical feedback-cavity enhanced absorption spectroscopy，OF-CEAS）解决了CEAS实现中最关键的问题之一，即在提供良好的光谱分辨率和高信噪比的同时，将足够量的激光注入到非常精细的光腔中。像其他CEAS方法一样，OF-CEAS通过使用谐振光学腔作为样品池来实现高灵敏度。然后通过非常精密的设置、有效的吸收路径长度可以轻松达到数万米。OF-CEAS的独创之处在于，光学腔是由三个以“V形”放置的反射镜制成的。以此方式，被捕获在光学腔内部的并因此被腔频率选择的一部分光可以返回到激光器。然后，利用激光器的非线性响应，将激光激射到激发腔“模式”的确切频率上。这种“光反馈”效应还导致激光发射线宽度变窄，导致腔传输增加，同时降低了噪声（通常是由于窄腔模与相对较弱的腔模耦合造成较宽的激光线），所产生的信噪比比其他光谱方法大几个数量级。腔体的长度通常为1m（折叠成外部基本长度仅为50cm），而有效吸收路径的长度很容易达到数万米。
使用DFB二极管激光器或ICL/QCL，通过以相对较快的速率（约10Hz）扫描激光频率，在较小的光谱区域（约1.5GHz）中获得OF-EASS吸收光谱。但是，响应时间不受此速率限制，而是受测量体积内部的气体交换限制。因此，设计的样品池具有最小的死腔和小于20cm 3 的小样品量。以稳定的相对较低的室压连续注入气体样本，其交换时间取决于流量和压力。例如，通过将流速设置为8mL/s，腔压力为140mbar。如果需要，可以使用较低的压力和/或较高的泵送速率进一步改进。最后，光谱仪的设计坚固而紧凑：光学组件以及用于实时控制和数据采集的所有电子设备都安装在19英寸（1英寸≈2.54cm）的机箱内。
NIR中的OF-CEAS分析仪已成功用于两种独立的医疗环境。该技术在法国巴黎的医院得到验证，可以在支气管炎症诊断的框架内监控患者呼出的CO和CH 4 。在肺活量计记录中同时进行OF-CEAS测量，以追踪不同通气阶段的CO和CH 4 水平。最近，正在研究呼出的CO和NO作为选择移植肺的生物标记物的作用。在严格控制的器官移植临床环境中，这项研究是由对新的标志物的需求推动的，这些标志物用于恢复最初被拒绝移植的肺移植物。离体肺的评估在离体肺灌注（ex vivo lung perfusion，EVLP）设备中进行：将肺灌注并在密闭容器中通风。通过分析呼吸机管路中的气体，在冷缺血后肺部逐渐复温期间，通过OF-CEAS测量离体猪肺产生的内源性CO。在孤立的器官上进行的这些测量所产生的CO浓度比在整个活体上进行的测量要小一个数量级。在该研究中，CO产生的水平可能与EVLP中缺血/再灌注损伤的严重程度相关，这为定义与EVLP程序临床相关的呼出CO阈值开辟了道路。首先，仍然是在动物模型中测量。其次，NO是参与肺部炎症的主要信号气体传输器。因此，利用中红外OF-CEAS分析仪的发展非常有吸引力，因为它能够实现在分离的肺中进行NO测量所需的亚ppb级的灵敏度。
与其他激光光谱方法一样，激光光声光谱（laser photoacoustic spectroscopy，LPAS）能够以快速灵敏的方式监控气体吸收。腔增强光谱法的高灵敏度来自长的吸收路径（千米）。激光光声技术的优点是，吸收路径的长度非常短（毫米至厘米），并且信号没有背景（在没有吸收体的情况下检测不到信号）。该方法不依赖于透射光强度的降低，而是依赖于从零基线的升高，即依赖于吸收后通过碰撞释放能量。激发能级的减少是通过荧光或碰撞发生的。碰撞灭活在红外波长上是有利的，这是由于红外中的荧光寿命长，特别是在大气压下。由于振动能量到平移能量的转移，气体的温度升高。通过调制辐射源，温度会周期性变化，从而产生周期性压力变化，进而产生可以被麦克风检测到的声波。由于其高灵敏度，LPAS可以从少量采样量（几百毫升）进行单次呼出气采集，而无需进行预浓缩步骤。在LPAS中，可以使用大功率红外激光器实现高灵敏度。此外，需要广泛的可调性，以选择性地检测复杂气体混合物中的气体并在最佳波长范围内运行，以最大程度地减少来自其他气体（例如水）的光谱干扰。最早说明LPAS痕量气体检测以进行呼出气分析的可能性的例子，是研究紫外线辐射对人体皮肤的影响。在压力条件下（如电离辐射、有毒化学物质和疾病），体内自由基的产生显著增加。随后，体内自由基清除剂的能力超载，并激活了一系列化学反应。这最终导致细胞膜损伤（即脂质过氧化，细胞膜中脂肪酸氧化），在某些疾病的衰老过程和发病机制中起重要作用。细胞损伤伴随着轻烃的产生，如乙烷、戊烷和乙烯，可以使用光声实验室装置通过腔内CO 2 激光器测量。
当前的医疗应用领域不仅要求以高灵敏度和快速时间响应来更好地量化呼出气，还要求低功耗的便携式设备。石英增强光声光谱法（quartz-enhanced photoacoustic spectroscopy，QEPAS）可以在很大程度上满足这些要求。QEPAS能够通过紧凑的检测模块实现极高的检测灵敏度。它利用石英音叉（quartz tuning fork，QTF）作为锐共振声换能器来检测微弱的光声激发，可以使用极小的样本体积。石英晶体是一种低损耗、低成本的压电材料，高品质因数（quality factor，Q）的石英晶体被用作时钟、手表和智能手机的频率标准。通常QTF的谐振频率为32 768Hz，当封装在真空中时，QTF的Q≈100 000或更高，在正常大气压下的Q值约为10 000。QEPAS的特点还包括：①可提供良好的环境噪声抗扰度，外部声音不会激发叉头的压电活动模式；②谐振的宽度为4Hz（在大气压下），只有在此窄频谱带中的频率分量才能产生音叉振动的有效激励；③气体采样量极小（0.15mm 3 ）。
使用QEPAS进行呼出气研究的例子有很多，例如：①从人的呼出气中确定 13 CO 2 / 14 CO 2 比率，以鉴定幽门螺杆菌感染，肝功能异常和体内细菌过度生长；②检测二硫化碳（carbon disulfide，CS 2 ）以指示肝硬化和囊性纤维化中呼吸道细菌定植的潜在非侵入性标记物；③NH 3 检测，由于NH 3 是蛋白质代谢的产物，因此与许多疾病状态和人体生理学有关。要开发便携式QEPAS系统，可以使用专用的中红外带间级联激光器或量子级联激光器。一个典型的方案是使用光纤耦合的便携式QEPAS设计。在这种设计中，从ICL发出的光被耦合到实心三氟化铟光纤中。光纤输出通过不锈钢微谐振器管（一个小的声谐振腔）引导。谐振管中间的小缝隙将谐振声能耦合到放置在谐振管旁边的石英音叉中。所有QEPAS传感元件都封装在6cm×5cm×6cm的紧凑型气体传感器中，具有微型驱动器，放大器和基于软件的信号处理方法。该系统用于确定CO 2 同位素比，精度＜1%。
光学频率梳（optical frequency comb，OFC）结合了窄线宽连续激光器与宽带超连续谱光源的优点。OFC的光谱由成千上万个同步相干模组成，跨越宽波长范围。此功能使OFC成为灵敏、宽带和高分辨率光谱的理想来源。使用腔增强光学频率梳光谱（cavity enhanced optical frequency comb spectroscopy，CE-OFCS）在近红外波长范围内已证明了它们在同时检测人类呼吸中不同生物标记物方面的潜力，在高浓度水蒸气（H 2 O）和二氧化碳（CO 2 ）存在的情况下，呼出气中检测到痕量的CO、NH 3 和CH 4 。频率梳的宽光谱带宽和高光谱分辨率的独特组合使得检测具有宽吸收特性的分子成为可能，同时区分和描述干扰物种，从而产生选择性多物种检测优势。
尽管大多数生物医学应用的重要物种在中红外波段具有最强的旋转振动跃迁，但是传统上，OFC是由锁模激光器产生的，其光谱通常覆盖可见光和近红外波长范围，而可靠的中红外锁模激光器仍在研制中。为了达到中红外波长范围，最常用的两种主要方法是：非线性频率转换，例如光参量振荡（optical parametric oscillation，OPO）或差频振荡（difference frequency generation，DFG）与近红外锁模激光器结合使用；或者直接从半导体激光器产生中红外梳。此外还有其他方法如使用微谐振器产生中红外梳。
基于非线性转换的OFC已被用于检测与潜在呼出气分析应用有关的不同挥发性化合物，例如使用具有腔增强吸收和傅里叶变换光谱法（Fourier transform spectrometry，FTS）的OPO来检测甲烷（CH 4 ）和一氧化二氮；CH 4 、甲醛（CH 2 O）、C 2 H 4 和CO使用OPO和FTS进行腔内检测；使用DFG和光谱分析仪（optical spectrum analysis，OSA）检测CH 4 ；CH 4 、CO和NO则使用带有多通道电池和FTS的OPO检测。在MIR范围内还使用了不同的宽带光谱方法，例如虚拟成像相阵列（virtually imaged phase array，VIPA）光谱、游标光谱和双梳子光谱，产生了更快的测量时间或更高的检测率，这些有利于实现生物医学应用所需的检测规范。另外，最近使用基于定向图案化的磷化镓晶体的DFG或OPO的双梳光谱结果扩展了现有技术，检测波长可达12µm。尽管基于非线性转换的中红外光谱系统具有所有优点和最新进展，但它们十分复杂、庞大且昂贵。到目前为止，这似乎仍是在实际生物医学应用中使用这些系统的主要缺点。
使用半导体锁模激光器特别是QCL，来产生中红外梳，并实现紧凑的双梳状光谱系统。这些光谱系统在检测不同生物标记物（例如NH 3 和N 2 O）中的潜力已经显示出来。但是，它们的灵敏度需要提高。例如，使用增强腔，以使其适合于生物医学应用。这些系统是可商购的，非常可靠，坚固且相当便宜。但是，与基于非线性转换和锁模激光器的中红外梳相比，基于QCL的梳通常具有1～2个数量级的窄光谱带宽和更高的重复率。较窄的光谱带宽可能会限制多物种的检测能力，并且较高的重复率会限制基于这些源的光谱仪的光谱分辨率，从而使其更适合于液体和固体样品的光谱学检测。
（王东春）