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呼出气的采样方法有多种形式，一般分为离线和在线两类。前者是先将样本存储在介质中，随后转移至分析平台进行检测；后者是呼出气由分析器直接采样并立即检测，避免样本在介质中的存储。采样模式主要由用于生物标志物检测的分析平台决定，但也可能受其他因素影响。例如呼气相采集时段，采集样本是来自口腔，还是混合呼吸或呼气末。除了采样所用的材料和方案之外，生理因素也可能影响呼出气样本，需要考虑所有的这些因素，以实现采集样本的可重复性。一般来说，呼出气样本的稀释、污染以及采样和储存过程中分析物的损失会导致不同研究结果的巨大差异。因此，明确且可重复的呼出气样本采集是呼出气分析研究的重要先决条件。本节将详细介绍呼出气样本采集的方法以及影响因素。
在人类中，单次呼气不是作为均匀混合物的均匀流速和体积进行的，而是由几个亚阶段组成，如图2-2-1所示，呼出气二氧化碳（carbon dioxide，CO 2 ）可分为四个时相：①时相Ⅰ波形在基线，为吸气和死腔通气时间；②时相Ⅱ为上升支，是死腔通气和肺泡内气体混合呼出时间；③时相Ⅲ波形呈高位水平线，为呼出肺泡气时间；④时相Ⅳ为时相Ⅲ末至基线，代表下一次吸气开始。在呼出气分析中，采样阶段取决于目的，如果要采集与口臭或口腔中细菌产生的VOCs，则应采样Ⅰ时相阶段；当探索上呼吸道中产生的化合物时，Ⅱ时相最为相关，例如NO或一氧化碳（carbon monoxide，CO）；Ⅲ时相是肺泡气体的代表，因此靶向检测血源性挥发物（内源性或外源性）时最受关注。应当注意，呼气期间在口或鼻处采样的呼气末气体不能被认为是纯肺泡气体，因为肺泡气体通过气管和上呼吸道并可能与其相互作用。然而，在Ⅲ期采集是无创采集肺泡气体的最佳时期。呼出气研究主要是寻找全身循环中与疾病或暴露相关的生物标志物，这些标志物在血液交换后能够从肺泡中呼出而被检测。血液携带的VOCs在呼气末样本与混合呼出气样本相比，浓度高2～3倍，并且呼气末气体采集可以减少来自死腔气体的污染物。
图2-2-1 呼出气二氧化碳（CO 2 ）的四个时相
混合呼出气被认为是最简单的呼出气采样类型，因为它涉及获取如图2-2-1所示的所有气体的呼气相。混合呼出气采样虽然具有简便性，但是由于环境、口腔和鼻部污染物的含量较高，可能无法提供最佳质量的呼出气样本。应用其进行生物标志物的检测，出现假阳性结果的概率很高，即将外源性VOCs识别为生物标志物。因此一些研究强调在获取呼出气样本时需要严格的质量控制以实现可重复采样。尽管如此，目前的很多研究还是进行混合呼出气采样，最常见的原因是其简单或缺乏合适的控制方法。混合呼出气采样期间，在没有对呼吸相位控制识别的情况下采样，样本可能会被死腔气体稀释。由于呼出气中存在的VOCs浓度在十亿分之一（part per billion，ppb）至万亿分之一（part per trillion，ppt）范围，分析结果很容易受到吸入空气中的杂质或气体稀释的影响。因此，控制取样是呼出气生物标志物分析的一个关键要求，可确保采集呼气时相的呼出气，从而最大限度地减少混杂因素，并可通过比较呼气阶段的VOCs情况，揭示呼出气VOCs的来源。
CO 2 视觉控制是用于收集呼气末呼出气样本最常用的方法，涉及在呼气期间监测CO 2 浓度。在呼气的第Ⅰ阶段中，CO 2 水平通常较低，但在第Ⅱ阶段开始上升，随后接近平稳状态表明肺泡相第Ⅲ阶段开始，可以通过CO 2 监测仪来监测呼出气中的CO 2 水平，即可视化呼出气的各个阶段，以指导何时开始呼吸采集。通常用于识别和分离呼吸阶段的任何参数必须以至少为200ms的时间间隔记录。使用主流商用二氧化碳检测仪可以实现高频率的CO 2 检测，这是临床实践中的常规操作。实际上，CO 2 可以被认为是最广泛使用的呼出气生物标志物，通过呼出CO 2 浓度进行的控制性呼气末采样最适合用于靶向血源性VOCs生物标志物的采集。CO 2 视觉控制呼吸采样的使用也可以扩展到机械通气患者，一些设备可以在达到肺泡相时手动去除空气以及自动捕获。
重复呼吸法采样是获得呼气末样本的另一种方法。在这种方法中，目的是在受试者呼吸时实现容器、气道和血流之间的平衡。在此过程中，通常不会引入外部空气。据推测，采样容器中的浓度可以接近血液的浓度。使用这种方法已显示出一致的呼出气和血液中的乙醇浓度。但是，这仅适用于分析单个化合物，可能并不适用于所有代谢物。Ohlsson等人获得了类似的结果，使用他们的等温重复呼吸容器旨在最小化容器和气道中的凝结。但由于二氧化碳的升高和氧气浓度的降低，这种方法会为患者带来不适感，因此这种方法可能不适合临床应用。另外，冷凝也会影响以这种方式收集的VOCs的稳定性。
总之，理想的呼吸采样方法将是简单的、适合个人生理的、允许有针对性地选择气道和/或肺泡气、并消除死腔和环境气影响的采样，但是目前尚无法实现所有这些目标。
许多分析平台的检测速度不足以实现实时呼出气分析，或者对于床边应用来说过于庞大。因此，需要采集离散的呼出气样本，并分别传输至分析仪。这需要额外的采样步骤，以确保采集到明确且可再现的呼出气样本。
离线分析中最常用的呼出气采样技术采用（惰性）聚合物袋和滤毒罐。这些材料在环境条件下会结合挥发性分子，并将其保留，直至在热脱附（thermal desorption，TD）的过程中加热至高温。由于许多呼出气携带的挥发物在长期储存过程中容易发生变化，特别是在气相中（尤其是在袋中），因此通常互补使用这两种方法，从而将收集在袋或罐中的气相呼出气样本转移到吸附剂捕集器上。聚合物袋由于成本低、易于操作和具有重复使用的潜力而被广泛使用。包括Tedlar、Teflon、FlexFoil和Nalophan，其中Tedlar是最常用的。聚合物袋由惰性材料组成，以减少反应。一些聚合物袋被黑色Tedlar的外层覆盖，以阻挡可能损坏样品的紫外线。惰性袋进行呼出气采样是一项相对简单的工作，因此在过去几十年中，一直是呼出气分析中非常流行的采样方法，并且沿用至今。对患者来说，向袋中吹气是简单快速的，并且样品可以方便地运输到实验室进行分析。Tedlar袋已被用于作为糖尿病标志的丙酮、作为胆固醇合成标志的异戊二烯，以及来自健康个体和肺癌患者的挥发物的分析，以鉴定生物标志物。然而，这种方便可能具有局限性，因为用袋子取样有几个缺点。就采样本身而言，一个重要的考虑因素是吹入时遇到的高阻力对呼出气VOCs的潜在影响，这将在下文的生理考虑因素中进行讨论。此外，袋储存呼出气样本的稳定性也是一个关键问题，储存在袋中的样本容易因损耗和伪影而受损，限制了它们在呼出气取样中的适用性。具体而言，几项研究表明，许多VOCs在袋装储存时不稳定，由于通过袋的扩散，即使是在数小时内，化合物也会显著损失，损失程度取决于袋装的类型。一些物质（如碳氢化合物）相对稳定，而其他挥发物（如含氧化合物）随着时间的推移会明显减少。显然，这种现象会对呼出气研究试验的结果产生巨大影响。如果不注意统一呼出气样本的袋存储时间和条件，则在样本之间观察到的任何定性或定量差异可能仅仅涉及样本损失，而不是与生理或临床相关。相反，环境挥发性有机化合物扩散到袋子中会导致伪影，一项研究清楚地证明了这一点。该研究在污染环境中储存期间测量了装满清洁空气的Tedlar袋中的丙酮和己醛。连续监测了袋内丙酮和己醛的浓度，同时将作为参考标准品的这些化合物的敞口小瓶放在密闭环境中的袋旁。污染后几分钟内，观察到袋内两种化合物显著增加，表明污染物快速扩散到袋中。由于气相环境成分的存在可危害袋样品，因此它们在污染区域中的储存，例如在临床环境或化学实验室中的储存，肯定会在样品中引入伪影。此外，袋子的聚合物材料可能会释放出化合物（如苯酚），可能会干扰呼出气样本的分析。基于对这些现象的观察，普遍认为只有在储存期很短（理想情况下在几分钟内）时，使用聚合物袋进行呼出气采样才是可接受的。通常情况下，将样本立即转移至分析仪进行即时分析的袋式取样，或转移至吸附剂材料上进行预浓缩和后续分析的袋式取样，会使样本损耗最小，且被认为是可接受的。
对于临床应用，理想的收集容器应该是成本低廉、容易、耐用、惰性的，重要的是不允许环境VOCs或呼出气VOCs的进入，也能与多个VOCs捕获设备兼容。呼气收集器（BCA，Menssana Research Inc.，纽瓦克，新泽西，美国）和Bio-VOC TM 采样器（Markes International，Llantrisant，威尔士，英国）同样能收集呼气末气体，但是收集器的结构和机制已经暗示了收集化合物的潜在差异。也就是说，BCA是一个延伸的管状结构，其中空气向下游流动，并收集靠近嘴部的气体。Bio-VOCs TM 采样器是一个小型存储容器，随着呼气的进行，空气在其中不断被置换。这两种设备的目的都是为了捕获呼出气样本，限制凝结，BCA具有加热的组件，而Bio-VOCs TM 采样器则没有，获得的VOCs曲线可能会有所不同。此外，采样中还应考虑其他因素，如容器背景气体或污染物水平。
不锈钢惰性气体罐用于收集和存储呼出气样本，不腐蚀、避光且气体不与容器发生相互作用。不锈钢罐耐用且易于使用，对于呼出气样本的采集是有利的。但是，其缺点是成本高，采样前需要抽真空并且需要专门的清洁设备。经过电子抛光的苏玛（SUMMA）罐已用于收集1L的肺泡气样品，灵敏度达到ppb级别。呼气结束时，打开滤毒罐阀门，将残留的气体从肺部排出到滤毒罐中，然后将其关闭。样品收集后，大多数VOCs在罐中至少稳定30天。该罐已用于分析呼出气中的化合物，以确定地下水、汽油和游泳池中VOCs的暴露水平。
由于大多数VOCs在人的呼出气中以ppt或ppb的水平存在，因此必须使用适当的技术来准确监测这些VOCs。鉴于这些VOCs的浓度较低，许多呼出气分析流程中，在仪器分析之前需对分析物进行预浓缩。呼出气分析通常采用三种主要的预浓缩方法，即热脱附管、固相微萃取、针头捕集器法。
吸附技术由于其相对简单和易于使用而最常用于呼出气分析。热脱附管，即TD管，是预浓缩VOCs的常用方法，占预浓缩方法的近一半。常用的吸附剂包括Tenax TA & GR、Carbograph 5TD和碳分子筛（Carboxen）等。为了防止分析物的过度吸附损失导致失去一些痕量的潜在VOCs标志物，对挑选吸附材料也极为讲究。但无论是在挥发性还是在极性方面，填充界面的分析物与吸附剂之间的相互作用都会一定程度地影响重现性，从而影响化合物的回收率，甚至可能影响储存期间的稳定性。强力吸附剂（例如Carboxen）适用于吸附挥发性极强的有机化合物（C2～C4），而Tenax吸附剂则适用于吸附挥发性较低的挥发性有机化合物（C7～C15）。
当呼出气样本暂时存储在聚合物袋中时，通过将TD管的一端连接到袋上，另一端连接到泵上进行VOCs吸附，泵的功能是通过吸收剂从袋中“吸气”。尽管使用这些含吸附剂的TD管非常敏感，但仍会非常耗时。同样，像羧甲酸酯之类的吸附剂是亲水性的，这可能不利于某些分析物的定量分析。吸附剂中VOCs的稳定性、存储以及物流等问题也是需要考虑的。研究表明，这些TD管在分析之前最多可保存2周，而另一项研究则建议使用更长的时间。使用这种方法收集的样品可以在医院的实验室中进行分析，或者可以将TD管临时存储并发送到异地实验室。ReCIVA装置（Owlstone Medical Ltd.，剑桥，英国）可以将呼气末气体直接捕获到吸附剂管上。样品收集后，将试管加盖并通过自动热脱附（automated thermal desorption，ATD）气相色谱质谱进行分析。根据不同的VOCs，可以使用具有不同吸附剂的TD管。需要注意的另一个重要问题是，要考虑呼出气的高湿度，无论是容器还是吸附剂材料取样。因为水蒸气会影响袋中样本的稳定性或吸附系统的吸附能力。
固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）是1989年由加拿大Waterloo大学的Pawlinszyn及其合作者Arthur等提出的。最初研究者将该技术应用于环境化学分析（水、土壤、大气等），随着研究的深入和方法本身的不断完善及装置的改进，现在已逐步扩展到食品、天然产物、医药卫生、临床化学、生物化学、毒理和法医学等诸多领域。
SPME是基于采用涂有固定相的熔融石英纤维来吸附、富集样品中的待测物质。SPME方法分为萃取过程和解吸过程两步：萃取过程是将具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取；解吸过程是将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样装置的气化室内，使萃取纤维暴露在高温载气中，并使萃取物不断地被解吸下来，进入后序的气相色谱分析。通常达到平衡所需的时间取决于目标分析物的物理化学性质。平衡时间可以通过几种策略来减少，包括搅动样品、最大化样品-顶空界面、加热样品和/或冷却纤维。样品基质与纤维涂层之间的平衡条件如公式（1）所示：
其中
和
分别是样品中和纤维涂层上的平衡浓度。
Vs
和
Vf
分别是样品和纤维的体积。样品和纤维涂层之间分析物的分布系数（
K
fs
）也可以通过公式（2）计算得出：
通过公式（1）和公式（2）可以得到公式（3）：
此外，通过假设 Vs 比 Vf 高得多，可以通过等式计算通过涂层提取的分析物的总摩尔数（ n ），即公式（4）：
该方程式表明，涂层提取的分析物量与样品基质中的分析物浓度成比例。也就是说，使用SPME可以进行定量分析。
SPME有三种基本的萃取模式：直接萃取（direct extraction SPME）、顶空萃取（headspace SPME，HS-SPME）和膜保护萃取（membrane-protected SPME）。在直接萃取中，将涂覆有吸附剂的纤维插入样品基质中，然后将分析物直接从样品传递至萃取相。HS-SPME是优选的VOCs和复杂样品的萃取方式，如尿、全血、血浆和头发。在HS-SPME中，涂覆有吸附剂的熔融石英纤维暴露在样品上方的顶部空间中，然后挥发性或半挥发性化合物在样本、样本顶空和吸附剂之间进行分配。最后，样品和顶部空间平衡后的挥发性和半挥发性化合物被纤维涂层捕获。因此，使用HS-SPME可以得到更纯净的提取物并具有更高的选择性。另外，由于样品基质不与涂层直接接触，有利于增加吸附剂的寿命。膜保护萃取将直接萃取与中空保护膜一起使用，这种膜保护层可防止大分子扩散到萃取相中，同时允许分析物的质子转移。Pawliszyn等人研发了管内SPME，适用于使用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）检测。对于管内SPME，用作SPME装置的毛细管柱固定在HPLC自动进样器的进样环和进样针之间。无论是光纤还是管内SPME技术，均取决于提取阶段和样品之间的分配系数，因此，该系数是SPME萃取阶段设计中的重要热力学参数。与液相色谱系统在线耦合是管内SPME的最重要优势之一，它可减少样品处理、降低操作成本并缩短分析时间。这种技术的其他优点是减少溶剂用量、灵敏度高、小型化、自动化、应用简单和快速。
选择合适的吸附剂是在SPME程序中获得良好的精密度和高回收率的关键因素。随着样品制备技术的进步，已开发出许多新型材料，例如不同的吸附剂，用于从样品中分离分析物。到目前为止，在SPME技术中已使用了多种商业材料（聚二甲基硅氧烷、羧甲基、Tenax TA）作为吸附剂。近年来研究人员开发合成了许多新材料，以提高提取效率并减少吸附剂蒸气容量有限等不足，在这些材料方面发表了大量的文章及综述。不同的商业吸附剂可以用于SPME分析，包括聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、聚丙烯酸酯（Polyacrylate，PA）、二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB）、羧酸盐（carboxen，CAR）和聚乙二醇，适用于SPME在各种非极性和极性有机化合物中的应用。然而，SPME商业纤维价格昂贵并且提取能力低。为了解决这些局限性，近年来人们为开发新的吸附剂付出了巨大的努力。研究人员还使用不同的制备和合成方法（例如溶胶-凝胶和电沉积）来生产SPME纤维。这些纤维能够抵抗强的有机溶剂和酸性溶液。与商用纤维相比，高孔隙率纤维能够带来更高的灵敏度和更短的提取时间。Jalili等人建议进一步的研究致力于在SPME技术中合成和使用具有更多特殊性能（例如更大的容量和孔隙率）的新吸附剂。
虽然SPME已被报道了适用于环境、食品、植物和草药产品以及药品等多个方向的样本分析，但迄今为止，尚未在临床实验室应用中站稳脚跟，在制药或生物技术行业中作为标准方法也未得到广泛认可。医学研究中的SPME分析要求除了前面提到的简单性和高通量外，关键特征还包括自动化、样品量小、有机溶剂的消耗最少等，并且具有成本效益。表2-2-1中列出了满足临床应用的SPME需具备的优点。
表2-2-1 医学研究中的分析要求和满足这些要求的SPME功能
为了满足代谢组学应用中对痕量分析功能的需求，Nozoe等人通过减少固定相的厚度同时增加其表面积来提高提取物的数量。涂有Tenax TA的薄膜微萃取（thin film microextraction，TFME）装置可以分析常规SPME方法未涵盖的挥发性癌细胞代谢产物。为了进一步提高LOD和呼出气及体液中存在的反应性物质在纤维上的稳定性，衍生化也可以用作样品制备工作流程的一部分。新的SPME涂料例如氧化石墨烯涂料引起了人们的特别关注，因为它允许包含基于氧的官能团（羧酸、羰基、羟基和环氧基）通过氧化石墨烯的合成途径来控制吸附性能。尽管可以进行灵敏的分析，但与商用DVB/CAR/PDMS纤维相比，涂有石墨烯的SPME纤维在测定气态样品中的低分子VOCs时，精度要差得多，可能与GC进样器中热脱附所需的高温下官能团降解有关。Li和Xu解决了观察到的氧化石墨纤维的缺点，即其低的热稳定性和机械稳定性或可复制性，他们应用原位电化学沉积法用聚苯胺/聚吡咯/氧化石墨烯覆盖不锈钢棒。该新方法已用于A549腺癌细胞和MRC-5人胚成纤维细胞顶空的灵敏VOCs分析（LOD为1～12ng/L），并证实了其优越的灵敏度、线性范围和可重复性。
针阱法（needle trap device，NTD）是一种萃取捕集法，即在小针头内包含吸附剂，可以通过气密注射器或泵将流体主动吸进或排出，或者通过其他方式将分析物被动地引入到捕集器中扩散。捕针器（needle trap，NT）是一种潜在的无溶剂采样技术/样品制备和引入装置。流体分析物和颗粒都可以捕获在针头内，然后吸附的分析物在分析仪器的入口中解吸，并引入以进行鉴定和定量。流体可以是气态或液态。NTD还用于从呼出气中捕获分析物。简而言之，吸附剂材料被限制在针状装置内，并且通过针“拉动”呼吸以捕获挥发性有机化合物。该方法旨在涵盖SPME和TD管的最佳功能，即减少采样时间，同时保持足够的灵敏度，与TD管类似，可以通过增加采样量来提高灵敏度。据报道，使用SPME和NTD在观察到重大损失之前，可以稳定几个小时。
在过去20年中，人们对EBC作为潜在生物标志物来源的兴趣明显增加。尽管已对几乎所有年龄组和疾病状态的几种收集技术进行了描述和标准化，但EBC的组成在收集方法和患者人群之间仍存在差异，因此，为了保持样本的完整性，掌握与EBC采集相关的知识至关重要。
理论上，EBC的采集是一个相对简单的过程。简而言之，每当我们在寒冷的表面（如镜子或窗户）上呼吸时，就会形成EBC。有三个变量控制这个过程，即：①呼出气体积（采集期间每分钟的通气量）；②冷凝器表面积；③呼出气与冷凝器表面之间的温度差。增加这些变量中的任何一个都会增加收集的EBC量。值得注意的是，冷凝器温度的变化将改变所采集的EBC成分。因此，EBC采集方法的标准化，是确保采集结果之间具有可比性的重要条件。一些商用设备允许运营商之间使用更标准化的方法，RTube、Turbodecss和EcoScreen是经常用于收集EBC的三种商业设备。RTube的优势在于它是一种一次性套件，具有一个与收集管连接的单向非呼吸阀。Turbodecss还可携带一次性收集池和不带呼吸阀的便携式装置，使该采样器也可用于家庭收集。EcoScreen系统具有一个双向阀，当呼出的空气在冷凝器中冷却时，该阀可防止吸入的和呼出的空气混合。但是与RTube和Turbodecss相比，EcoScreen并非便携式，限制了其在家庭中使用的能力。因此，EcoScreen主要用于实验室研究。表2-2-2显示了一些商业化的EBC收集系统。
温度是EBC采集期间要考虑的最重要的变量之一。在0℃以上采集时，EBC以液态采集；低于0℃时，作为“湿冰”收集；低于-40℃时，会以干晶体或“雪”的形式收集。采集的最大EBC体积将出现在最低的冷凝器温度下，因为这些温度会使冷凝器表面和呼出气之间的温度梯度最大化。因此，最佳收集温度取决于目标化合物和所需EBC的体积，概括如下：
表2-2-2 当前的商业EBC收集系统
（1）EBC的挥发性有机化合物比冰更容易被液相水吸收，因此最好在略高于冰点的温度下收集。
（2）存在于EBC稀薄气溶胶部分中的较大分子可更好地被快速冷冻的冷凝物捕获，因此最好在可能的最冷温度下收集。
（3）当需要挥发性和气雾化化合物时，在不同温度下采集两个样品可能是最佳方法。
EBC的理想采集发生在规律的呼吸周期期间。规律的呼吸模式有助于标准化采集期间的气溶胶液滴大小和体积，且对受试者而言不太费力。值得注意的是，患者在指导呼吸期间可能会换气过度，必须小心避免。美国胸科学会和欧洲呼吸学会已提出了呼出气生物标志物收集的技术标准，且这些标准的更新正在持续进行。在收集EBC和EBA的数据时，应将这些标准与本章中的建议一并考虑。
EBC分析的另一个领域是收集机械通气患者的冷凝物。这对于早产儿特别有意义，因为不能定期对他们进行足够的血样或尿液分析。在机械通气期间，可从所有年龄和疾病状态的受试者采集呼出气冷凝液。对于无法遵循命令并主动向采集设备呼吸的受试者，在机械通气期间采集EBC可能更容易。机械通气期间的采集遵循与上述相同的原则，在此设置中还必须考虑其他几个问题，包括患者/工作人员安全和样本完整性。
机械通气是维持生命的设备，与此类设备连接时必须始终小心。在这种设置下采集EBC时，需要将冷凝器放置在呼吸机的呼气端。冷凝器对呼气端的任何阻塞都会导致机械通气停止，并对患者造成潜在的气压伤。打开呼吸机回路以放置和移除冷凝器会导致机械通气暂时停止，这可能是某些受试者无法忍受的。当呼吸机管路打开时，病原体可能会被引入患者体内，或者病原体可能会从患者体内传播给采集人员。为了解决这些问题，必须进行以下考虑：①在与任何型号的呼吸机一起使用之前，应测试冷凝器，以确保它们在收集过程中不会阻碍通气；②在从机械通气患者中采集EBC之前，应始终咨询临床工作人员；③对于被认为不太稳定而不能暂时中断机械通气的患者，不应放置或移除冷凝器；④应在中断机械通气前对患者进行预充氧，再放置或拆除冷凝器；⑤每次使用前，应对放置在通气回路内的所有冷凝器进行消毒；⑥在放置和移除冷凝器时，采集人员应使用无菌技术；⑦采集工作人员应穿戴适当的个人防护设备，以防止病原体的传播。值得注意的是，EBC可以从一些呼吸机的排气口收集，该排气口位于呼吸机回路外部。在这种收集方法中，雾化部分会丢失，因为它会被截留在呼吸机的呼气过滤器中。
EBC的水蒸气和雾化颗粒部分可通过过滤进行分离。商用细菌过滤器可捕集呼出的气溶胶，防止其污染呼吸医疗设备，如肺功能机。这些过滤器在大多数医院和临床环境中均可轻易使用。受试者在潮汐呼吸期间佩戴的简单手术面罩可采集更简单、可再现的呼出气溶胶水平。通过这些方法采集EBA时，温度梯度不相关，因为气溶胶被过滤器或面罩机械截留。
可以在室温下使用采样设备或不同形式的过滤材料来收集EBA。聚四氟乙烯过滤器已用于收集，并且可以使用溶剂提取EBA颗粒，还可以使用LC-MS分析颗粒。Gesundheit Ⅱ（G-Ⅱ）采样设备已被用于收集呼出气溶胶，而受试者坐在展位中并通过锥体采样器呼吸。受试者可以像通常一样戴口罩或呼吸器呼吸、说话或咳嗽。呼出气进入狭缝撞击器，该撞击器收集空气动力学直径大于5.0μm的颗粒，捕获在聚四氟乙烯基质上，然后从中提取并使用逆转录定量聚合酶链反应分析（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。该设备可从SKC BioSampler商购，并已用于评估流感和呼吸道中其他病毒的水平。其他市售设备，例如前面描述的ExaBreath®采样器，也可以用于方便地收集EBA。具有级联撞击器的硅片也已被用来根据其惯性从呼出气中收集磷脂。该技术用于比较哮喘、囊性纤维化和健康对照患者的磷脂成分。对于更简单的收集方法，个人可以在指定的时间内佩戴塑料口罩/防毒面具或医院纸质口罩，并且可以使用湿润的滤纸对口罩的表面（或整个口罩）进行采样，用溶剂萃取后进行LC-MS分析。
尽管离线呼出气分析是目前呼出气研究中应用最广泛的方法，但在线分析具有关键优势，且吸引力越来越大，特别是随着传感器系统和光学光谱学领域的快速发展，这些领域可制造成紧凑型便携式设备，从而实现床旁分析。台式或基于实验室的在线系统，如离子迁移谱（ion mobility spectrometry，IMS）、选择离子流动管质谱（selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）和质子转移反应质谱（proton transfer reaction mass spectrometry，PTRMS）是检测VOCs快速变化的在线检测技术，例如，监测运动期间或药物摄入后的VOCs变化。实际上，在线分析系统相对于离线平台的关键优势不仅在于它们进行呼吸分辨率分析的能力，还在于它们进行连续分析的能力，即短时间连续重复测量。这种方法的另外一个应用是药代动力学研究，这已在使用PTR-MS和IMS的研究中得到证实，可以在药物摄入后监测呼出气中药物的挥发性成分，从而确定其从体内排泄的药代动力学特征。在采样方面，大多数在线分析平台都有定制系统，包括一个小孔或管道，其上连接用于呼出气采样的接口管。确切的配置和取样流程因仪器而异，但共同的特点是入口加热系统和使用惰性采样管，如全氟烷氧基（perfluoroalkoxy，PFA）或聚氟四乙烯（poly tetra fluoroethylene，PTFE）管、聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）毛细管或钝化不锈钢管。这两种特性（加热和使用惰性材料）对于确保高效、快速地将极性和非极性的高挥发性和不稳定化合物转移至检测系统至关重要，因为这两种特性可最大程度地减少渗出、残留和对润湿表面的损失。使用惰性材料的优点是，它们通常不会释放出可能污染样本的气体和混淆分析数据的化合物。
许多在线系统的另一个特点是旁流采样，可从主流中连续且相对少量地提取样品气体，即呼出气只有最小的或没有干扰。这意味着可以对呼出气进行采样，而不会受到气流限制，否则气流限制可能会导致与生理相关的VOCs变化。此外，许多在线分析平台的呼吸分辨能力能够实现呼气末采样。一些设备例如二次电喷雾电离质谱检测在其呼吸采样接口中结合了二氧化碳检测仪，另一些设备例如PTR-MS和SIFT-MS利用来自内源性化合物的信号例如丙酮、CO 2 、或水蒸气来识别呼气相，然后在后处理中利用这些信号来选择数据。近年来开发了一种在线缓冲呼气末（buffered end-tidal，BET）采样器，它是为PTR-MS开发的，但与其他分析仪兼容，该采样界面延长了呼气末阶段分析的时间并提高了信号的稳定性。
两种呼吸方法（即鼻吸入-口呼气和口吸入-口呼气）之间存在重要差异，这可能会影响EBC中分析物的浓度。在鼻腔吸入期间，吸入的空气在上呼吸道中被加湿，并且在鼻腔和鼻窦中形成的介质在鼻腔吸入过程中进入下呼吸道。这是一个要注意的重要问题，特别是对于正在进行的上呼吸道疾病的患者，最好采用口腔吸入法或口腔呼气法进行测量，以使只有经嘴部调理的呼入空气进入收集系统。
EBC采样中的口腔吸入可以在使用或不使用鼻夹的情况下进行。通过使用鼻夹，受试者被迫通过嘴吸气。在大多数研究中，样品收集是通过口吸入-口呼气进行的，但需要考虑到来自口腔的氨或其他化合物的影响。
EBC中的许多生物标志物在唾液中也有很高的浓度。例如，类花生酸以高浓度存在于唾液中。因此，避免EBC唾液污染至关重要。这可以通过测量淀粉酶浓度来实现，或测量样品黏度。而且，在鼻子和鼻旁窦中形成的某些炎症介质（例如白三烯和前列腺素）可以通过鼻咽部进入口腔呼出气。因此，排除EBC样品的鼻污染十分重要。目前的研究主要是在三种实验条件下测量生物标志物：①在没有鼻夹的情况下吸气和呼气；②在有鼻夹的情况下吸气和呼气；③抵抗阻力地呼气，以最大程度减少鼻腔污染。由于每种生物标记物的鼻/唾液污染的可能性不同，需要在不同情况下分别解决。
环境和呼吸道温度可能会影响EBC的结果，而不会影响EBC的产量。例如，随着冷却温度的升高，H 2 O 2 、丙二醛浓度和电导率逐渐增加。Czebe等人的研究结果表明：随着温度的降低，pH值降低；另一项研究表明，冷冻的冷凝液中氨的浓度低于液体形式中氨的浓度。冷凝温度对于热不稳定的介体/生物标记物（如白三烯和嘌呤）很重要。因此最好报告冷凝温度，以利于实验室之间的数据比较。
收集后，不应将EBC样品留在室温或环境空气中。环境空气中的分子可能通过几种可能的机制影响EBC中生物标志物/化合物的浓度：①直接进入EBC；②反应并诱导EBC中捕获物质的降解或形成；③促进气道中的炎症和生化变化，随后这些变化会反映在EBC中。例如，已经表明大气中的NO降低了呼出气的H 2 O 2 含量。
Ahmadzai等列出了使用不同设备收集的EBC生物标志物。流量设计、收集设备中使用的内部涂层材料以及冷凝物收集操作中的温度波动会影响生物标记物的浓度。不同的EBC收集系统之间不仅可能存在不均匀的冷凝温度，而且在不同的气流或不同的冷却温度下使用同一冷凝器时，冷凝温度也可能存在不均匀。此外，收集过程中吸收的挥发性唾液污染物（例如CO 2 、氨水和乙酸）可以差异地影响生物标志物或非挥发性化合物的浓度。最后，为了提供一致的数据，EBC收集系统需要在收集温度、涂层材料和流量设计以及其他参数（通气模式、潮气量、呼吸频率、呼出颗粒等）方面进行标准化。
EBC的气道衬里流体成分通过气相冷凝液而被高度稀释。EBC化合物的浓度取决于水蒸气冷凝的效率，该效率受收集温度和表面积的影响。如果没有可靠的稀释因子测量方法，就无法准确确定上皮细胞衬液（epithelial lining fluid，ELF）中化合物的精确浓度。由于这个原因，研究者已经提出了许多针对非挥发性物质的归一化因子，并推荐使用非炎性参考指标作为内标，在ELF中保持相对不变。理想情况下，这些指示剂的浓度与血浆中的指示剂相似，并通过细胞膜扩散，但不会在肺泡或气道中产生。尿素作为候选分子，分子很小，易于扩散，均匀分布在全身，并且不会在肺部代谢。因此，通过检测EBC中的尿素浓度有可能估算出非挥发性化合物的稀释倍数。然而，EBC中的尿素浓度相对较低，血清值具有较大可变性。此外，在受感染的肺中，尿素可能会发生细菌降解。因此，用尿素稀释的估计结果是不准确的。
其他替代方法是总不挥发阳离子或EBC的电导率测量。例如冷凝液电解质的浓度可以作为计算冷凝液稀释度的一种方法。将冷凝液的溶质浓度除以EBC中非挥发性阳离子（Na + 和K + ）的浓度之和，可以将稀释的影响最小化。在通过冻干去除铵离子的条件下，电导率可用于估算气道电解质浓度和稀释系数。一系列研究结果表明，冻干样品的电导率是估计EBC中非挥发性、亲水性生物标志物稀释度的一种廉价、简单且可靠的方法。另一种关于稀释的校正方法是在每次EBC收集过程中计算EBC成分的浓度。但是，由于给定时间段内EBC的收集量与呼出空气量有关，因此该策略具有明显的缺点。尽管稀释因子计算对于解释EBC研究获得的结果至关重要，但上述建议均未证明是“金标准”，并且关于EBC的大多数已发表文章中都省略了稀释因子的计算。
在过去的10年中，Reinhold、Knobloch和Rosias建议将任何EBC成分的浓度相对于所定义的呼出气量（100L）进行标准化。比较每100L呼出气中呼出的不同EBC成分会导致变异性降低，并增加所获得数据的可重复性和可再现性。
在两种情况下，无需进行稀释因子计算：①同时测量多个相互作用或生物学相关的生物标志物并考虑其比率；②需要对一种物质进行可靠的测定时，可作为异常的通断指示器，包括结核分枝杆菌DNA、胃蛋白酶、鼻病毒RNA和炭疽毒素的存在。
应该注意的是，稀释因子与VOCs无关。影响VOCs含量的重要因素包括水溶性、气液分配系数、源流体（气道衬里流体）的温度、冷凝器温度、源流体和EBC的pH值以及在其中发生反应的机会。收集袋和/或容器表面的吸附也是影响VOCs浓度的因素。
采样期间的生理变化，例如与血流动力学效应、呼吸模式或呼吸流量相关的生理变化，可能导致呼出VOCs特征的显著变化。因此，在进行呼出气分析时，必须考虑生理参数的潜在影响，以避免这些因素对呼出气VOCs的影响高于感兴趣的生化、代谢或病理效应。肺通气和灌注会影响肺泡气体交换，也影响呼出气中的VOCs浓度。事实上，简单的生理变化可能会对呼出气VOCs特征产生突然而显著的影响。最近的研究表明，不同呼吸模式或体位引起的血流动力学变化会改变呼出气特征。具体而言，异戊二烯浓度在改变体位后会立即改变，而丙酮不受影响。
通气模式的变化，例如换气过度、换气不足或换气动作（如深吸气或呼出），会立即引起呼出气VOCs模式的变化。例如，屏住呼吸会导致某些VOCs的浓度增加2～3倍，抵抗阻力的呼吸还会导致呼出气中VOCs模式的改变。例如在取样过程中，呼吸或抵抗阻力的呼吸，必须避免通过窄直径管道吹气，或通过小孔填充袋子，旁流取样可以克服这一限制。此外，实施控制方法，例如视觉或听觉辅助的同步呼吸采样，可有助于减少呼吸间采样的变异性。研究者还发现，一些呼出气化合物在其呼出浓度中表现出昼夜节律，例如哮喘患者体内的几种化合物，包括异戊二烯和呼出气一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）都是如此。
综上所述，除了在采样期间引入的误差或生理变化引起的偏差之外，还有许多可能影响呼出气挥发性成分的外部因素。一般而言，外源性化合物可来源于环境空气、饮食、药物等。以吸烟为例，化合物乙腈是生物质燃烧的标志物，其在呼出气中的存在与吸烟活动高度相关。呼出气中的高浓度乙醇表明存在酒精摄入，当在呼出气中闻到时，通常无需仪器即可检测到。呼出气中的数百种VOCs有很大一部分是外源性的，而挑战在于区分哪些化合物是内源性，哪些是外源性的。要做到这一点，没有简单的解决方案，但记录最近的饮食、药物治疗和其他活动信息可能会为呼出气中是否存在某些化合物提供线索。临床呼出气研究中使用越来越多的策略是招募患者的家庭成员作为对照，目的是获得共同居住者吸入暴露量和通过共享膳食的暴露因素方面的样本。此外，越来越多的人关注纵向研究，例如个体在监测疾病进展或治疗干预的疗效方面呼出气VOCs对时间的变化。这可能提供一种新的解决方案，对呼出气中外源化合物的干扰能够准确、快速地识别。这对于临床呼气分析中的稳健采样和数据分析至关重要，以隔离环境中的混杂因素。
如本章概述中所述，由于呼出气研究在目标疾病、目标化合物、分析技术和采样方法等方面的多样性，不可能建立一套适用于所有呼出气分析工作的统一标准，因此目前尚无呼出气研究的标准化流程，但已针对具体应用制定了最佳实践指南，例如FeNO和EBC。Herbig和Beauchamp提出了呼出气采样方法报告标准化的框架，如图2-2-2所示。在这个框架中，呼出气研究的每个方面，从设计到数据评估，都被视为一个独立的研究，通过在每个步骤中建立最佳方法，可以更容易地进行多个研究间的等效性比较。在此框架内，标准参数是可测量的，如检测限（limit of detection，LOD）或分析仪的灵敏度。标准参数可以是广泛适用的，也可以是特定化合物。
在图2-2-2中，每个步骤都是独立的，每一步骤都可以进一步分为子步骤，例如，研究设计包括目标人群、队列、限制条件等，取样程序包括呼出气阶段、受控取样，分析仪包括操作参数、灵敏度、LOD等，以及数据分析等。当为每个步骤（或子步骤）定义了各自的标准时，可由独立研究实验室实施，以降低多变性并确保呼出气研究中同一步骤的可比性。结果中出现的任何差异都可以追溯到与公认的标准化程序不一致的单个步骤。整个过程是迭代的，即新的、优于现有标准的方法可以取代原有的方法。随着时间的推移，呼出气研究工作流程中各过程的各个方面将相互协调，从而降低结果的多变性，提高结果的再现性。此外，建立一个具有动态内容的框架，而不是一套固定的规则，有利于该领域的创新，不会因为固有的限制而扼杀其发展。
图2-2-2 呼出气研究工作的流程图
目前的研究集中于为采样技术和分析平台建立一个基准，引入标准化的框架，并考虑生理学和潜在混杂因素的影响，来调整采样策略，如环境影响或药物应用。分析仪器本身会对呼出气研究的结果产生影响，例如检测限、灵敏度、靶向性和系统漂移度均可在不同程度上影响数据质量。与实验室的分析方法相比，快速在线分析方法的数据可经分段后处理选择相关相位，例如呼气末或吸气相位。任何呼出气研究的成功结果主要取决于所采集样本的质量，一组受影响的样本将导致后续数据的错误解读。
近年来，呼出气分析研究在采样技术、分析仪器和数据处理算法方面都取得了巨大的进步，分析方法正在通过不断交流逐渐地调整并改进，随着采样方法共识的建立，研究者将发现更多更可靠的疾病相关呼出气生物标记物。
（邱忠志）