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呼出气代谢组学的样本类型主要包括气相呼出气、呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）和呼出气气溶胶（exhaled breath aerosol，EBA）三种不同类型。呼出气中主要含有挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）、半挥发性有机化合物（semivolatile organic compounds，SVOCs），而EBC和EBA样本还可以检测到蛋白质、脂质、DNA和微生物群，例如细菌和病毒。呼出气分析的中心目标是非侵入性检测职业、环境暴露或用于医学中疾病状态的检测，根据需要的成分，有多种收集和分析呼出气的方法。如果分析目标是蛋白质、脂质、SVOCs或微生物，则收集EBC是理想的方法。尽管目前对EBC中用于疾病检测和监测的生物标志物的收集和分析引起了人们的兴趣，但总体来说，无论是在不同受试者之间还是对于同一受试者，呼出气样本的采集和分析普遍存在难以标准化、结果差异性较大的问题。EBC中生物标志物的浓度以及样本量可能会因受试者的健康、职业、饮食、基因型、年龄、性别和最近是否接触外源性化学物质等发生很大变化。另外，受检者的呼吸频率、呼气速度及每次呼出气的体积都会明显影响收集的EBC数量。目前，用于收集EBC的方法和技术的标准化程度偏低，导致在研究内部和研究结果之间的比较存在较大困难。但是可以确定的是，控制受试者呼吸的频率和潮气量可能有助于减少某些生物标记物在受试者间和受试者内的变异性。
传统的呼气测试多数围绕着气相呼出气，当人体吸入或暴露于特定环境后，VOCs会保留在人体的不同部位，具体取决于它们的呼吸-血液-脂肪分配系数，脂肪组织中的VOCs释放到血液中，然后通过肺泡和肺中的气道交换到呼出气中，因此，VOCs的呼出气浓度可以反映其血液中的浓度。由于采样的无创性，个体的不适感会很小。VOCs可能来自吸入、摄入或皮肤吸收（例如汽油、食物、乳液）引起的外源性环境暴露或来自体内的内源性物质（例如微生物代谢产物、肿瘤等）。呼出气同时包含死腔气和肺泡气，死腔气来自于口腔、气管和支气管，而肺泡气来自肺部。肺泡气容量在呼吸末期只有350mL。许多呼出气采样技术设计为仅捕获肺泡气，因为只有肺泡气才包含已通过血气屏障交换的VOCs，这在呼出气样本的采集方法中会详细介绍。
在吸气和呼气期间，气道将呼出气加热和加湿，当呼出的气体接触到比其温度低的表面时，就会形成冷凝物，即EBC。EBC包含溶解在呼出气中水蒸气部分的生物标志物，以及在气雾化液滴中捕获的生物标志物。在与冷凝表面接触之前，可以通过在过滤器中收集气溶胶粒子来分离EBC加湿和雾化的部分。当单独采集时，EBC的这种气雾化颗粒部分被称为气溶胶，即EBA。由于EBC中包含99.9%的水，因此EBC中的化合物被高度稀释。EBC与肺泡内衬液（airway lining fluid，ALF）中非挥发性分析物的浓度之比的变化很大，通常在1/50 000到1/1 000之间。不仅在个体之间，即使是同一个体，非挥发性化合物的浓度都有很大的差异。EBC可提供ALF成分的重要信息，例如过氧化氢（hydrogen peroxide，H 2 O 2 ）、氨、腺苷、白三烯、异前列烷、氮氧化物、肽和细胞因子均可以在EBC中检测到。与血清、尿液或唾液类似，EBC是一种生物流体，可在其中识别生物标志物。EBC的成分包括挥发性和非挥发性物质、无机和有机化合物、与pH值或氧化还原相关物质以及蛋白质和非蛋白质成分。
在EBC发现的大多数生物标志物都存在于水蒸气部分，美国FDA已将EBC的pH值标准化，并用于临床胃反流患者的监测。pH值的决定因素是离子成分，包括乳酸、乙酸和甲酸，这些成分均可溶于水。EBC的pH值是反映气道酸碱平衡的一个窗口，EBC pH值下降最相关的情况包括：①急性哮喘发作；②慢性阻塞性肺疾病；③急性肺损伤和ARDS；④在慢性咳嗽、哮喘、COPD、肺移植排斥、肺纤维化、声带功能障碍和运动诱发的呼吸困难/支气管痉挛的情况下评估胃酸吸入。一些研究已经证实，通过检测EBC的pH值能够识别反流性咳嗽并指导其治疗。在一些早期将EBC pH值用于哮喘诊断的研究中发现，与轻度哮喘相比，重度哮喘儿童的pH值降低。根据全球哮喘防治创议（Global Initiative for Asthma，GINA）指南，在一项儿童哮喘控制情况的研究中发现，一组未控制哮喘儿童的EBC pH值显著降低。然而，在最近的其他研究中，没有发现哮喘和非哮喘儿童之间、特应性和非特应性哮喘之间的EBC pH值存在显著差异。近年来研究者还开发了一种基于生物传感器的肺结核杆菌诊断技术，虽然存在一定的假阴性和假阳性结果，但其无创性和便携性为肺结核的筛查提供了一种简单便宜的方法，尤其适用于人群发病率较高的地区。EBC中的H 2 O 2 被视为是反映肺部炎症和氧化应激的指标，研究者因此开发了手持性Inflammacheck分析仪，以对呼出气中的H 2 O 2 实现床旁检测（point-of-care testing，POCT）。表2-1-1列出了一些临床中已商业化的EBC收集检测装置。
表2-1-1 当前商业化的EBC检测生物标志物
EBC的一些其他生物标志物也已经过验证，但尚未获得临床批准，这些生物标志物大多已用于研究气道疾病，特别是炎性气道疾病。呼出气一氧化氮（nitric oxide，NO）是常用的监测气道炎症的指标，EBC中发现的亚硝酸盐/硝酸盐/氮氧化物就源自NO的氧化及其与含有-SH基团化合物的反应。例如当NO与
离子反应时，会形成高反应性的过氧化亚硝酸盐，其与酪氨酸进一步反应可以生成3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）。EBC中NO衍生物浓度及其变化可以间接反映NO的浓度，并提供NO随时间变化的信息。在呼吸系统疾病例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）的EBC中经常发现硝酸盐、亚硝酸盐和3-NT的水平升高。
异前列腺素在体内通过自由基催化的脂肪酸过氧化作用形成，该途径不需要环氧合酶，并且在结构上类似前列腺素。8-异前列腺素（8-isoprostane，8-IP）在体内大量产生，被认为是体内脂质过氧化和氧化应激状态最可靠的标志之一。在健康人和患有各种呼吸道疾病的患者的EBC中都能检测到8-IP，健康个体的EBC中8-IP浓度较低，但在氧化应激期间可以升高数倍。
已经证实的是，EBC中的谷胱甘肽（glutathione，GSH）与气道炎症和氧化应激有关。GSH是一种内源性抗氧化剂，可防止活性氧和自由基对细胞的损害。在肺部，肺泡腔暴露于环境和内源性氧化剂，足够的GSH对于保护气道细胞免受氧化剂损害至关重要。GSH氧化还原平衡的变化被认为会引起炎症和超敏反应。谷胱甘肽水平降低，氧化后的谷胱甘肽二硫化物（glutathione disulfide，GSSG）升高，表明可能存在炎症。在哮喘患者和酒精中毒患者的EBC研究中，均发现GSSG水平显著升高。
EBC的非挥发性成分还包括白三烯、细胞因子以及前列腺素。白三烯通常是在机体与过敏原接触后从气道的炎性细胞中释放，能够收缩气道平滑肌、增加血管通透性并增加黏液产生。这些病理生理常发生在哮喘以及其他引起支气管痉挛的疾病。在EBC中已检测出白三烯，但它们在健康个体中的浓度非常低（10～200ng/L），因此需要预浓缩以及灵敏的检测方法。细胞因子是几乎所有有核细胞分泌的小蛋白，广泛用于细胞间的通讯。细胞因子在炎症反应中十分重要，尤其是呼吸道炎症。这是由于细胞因子可以引发其他细胞因子的释放，而导致细胞因子产生增加和失调。EBC中的细胞因子浓度很低，在各种呼吸系统疾病的EBC中仅发现了几种特异性细胞因子，例如，白介素（interleukin，IL）-4和IL-6在哮喘患者中升高，但在COPD、CF和肺癌患者的EBC中仅IL-6升高，吸烟者的IL-6水平也升高。与稳定的COPD、吸烟者和健康对照组相比，COPD急性加重时细胞因子IL-1 β、IL-6、IL-8和IL-10显著增加。EBC的一些细胞因子也与全身性疾病相关，例如脓毒症和炎性肠病。关于EBC中的前列腺素和血栓素的研究相对较少，其浓度以及作用尚无定论。表2-1-2列出了EBC中不同类型化合物升高反映的疾病。
表2-1-2 EBC中反映不同疾病的化合物
EBA代表EBC的一部分，其分析目标是较大的分子而不是气相物质，例如脂肪酸、细胞因子、蛋白质、病毒和细菌。该样本不需要冷凝，因此与EBC相比具有操作便捷的优势。受试者或患者只需在给定的时间内（例如10min）佩戴标准的医用口罩，然后将口罩带回医院和实验室，即可进行各种目标化合物的分析。
除了生物介质外，EBA采样被视为环境暴露检测和职业健康状况评估最简单的无创方法，可用于检测空气污染时的颗粒物（particulate matter，PM）和纳米颗粒。空气污染时的PM会引起肺部炎症，呼气时会形成呼出气颗粒（exhaled breath particles，EBP）。研究者还利用呼出气EBA检测方法研究了职业接触二氧化钛和氧化铁纳米颗粒的情况。尽管空气中的颗粒物浓度未超过国家空气传播的暴露极限，但与对照相比，暴露于纳米颗粒的员工在EBC样品中显示出明显更多的钛和氧化应激标志物。
EBA检测也被用于检测药物，尤其是用于毒品检测，其优势在于与血液或尿液检测相比，呼出气采样是一种非侵入性技术，可用于工作现场的常规采样。当受试者通过采样设备进行呼吸时，来自呼出气的生物气溶胶会收集在过滤器上。当过滤器浸泡在甲醇中时，药物化合物被释放到溶液中。目前已有研究应用LC-MS方法检测呼出气EBA中的苯丙胺、甲基苯丙胺、四氢大麻酚和可卡因。ExaBreath®（SensAbues AB，索伦蒂纳，瑞典）设备可以将气溶胶颗粒收集到过滤器上，以检测吸毒者EBA中的美沙酮，评估其暴露程度。与EBC一样，EBA也可用于检测细胞因子和趋化因子，在呼出气中以EBA代替肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）进行无创检测是非常有前景的。另外，经空气飞沫传播的病原体也存在于EBA中，因此，在处理EBA时应采取预防措施。
（刘宜平 邱忠志）