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1.非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）危险度分层、疾病复发及进展预测，进一步综合治疗必要性评估。
2.肌层浸润性膀胱癌（MIBC）的复发或进展情况监测，根治性手术及综合治疗的效果评估。
3.转移性膀胱癌治疗效果评估（对于评估肿瘤突变、寻找药物突变靶点、评估治疗效果和耐药的应用还需研究验证）。
一般情况下无绝对禁忌证，需排除以下两点：
1.凝血功能障碍。
2.对抗体及药物存在过敏反应。
目前，主流的CTC捕获技术有先捕获后检测和体内探针法（不采集）直接检测，以下分别以CellSearch和CellCollector作为两种技术代表举例。
1.CellSearch 所需器材清单
传统的CellSearch体外捕获技术是免疫亲和法，通过肿瘤表面特异性表达的抗原与抗体结合。
所需材料包括：抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗原抗体（对癌细胞的阳性选择），患者血液（3～10ml），涂有抗EpCAM抗体的铁颗粒，磁场（以捕获铁颗粒结合细胞），4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、荧光标记抗体（染色技术标记癌细胞）。
2.CellCollector所需器材清单
在传统的CellSearch基础上，通过利用其物理（尺寸、密度、电荷、可变形性）和生物学（细胞表面蛋白表达、活性）特性的不同进行体内富集和检测。
（1）物理性质所需材料包括尺寸（膜过滤装置）、可变形性（芯片中的微流体系统）、密度（Ficoll离心）和电荷（介电泳）。
（2）生物学特性基于细胞表面标志物的表达，包括上皮细胞黏附分子（EpCAM）的阳性富集和CD45的阴性富集，所需材料包括：与磁珠偶联的抗EpCAM或抗CD45抗体（用于在磁场中富集CTCs）；微柱或纳米柱上连接抗-EpCAM抗体，抗-EpCAM抗体偶联3μm的磁珠（以更利于离心分离CTC），不同尺寸纳米颗粒上的抗-EpCAM、抗-HER2 /neu、抗-EGFR抗体（用于捕获和检测不同的CTC）。
1.明确把握CTC检测适应证，能正确解读CTC检测报告并与临床实际相结合的医师团队。
2.熟悉CTC血样采集及处理规范流程的护理团队。
3.擅长CTC样本处理、检测操作流程，并能做出正确CTC结果判读及报告的研究团队。
1.采集 将收集的3～10ml外周血置于含有EDTA和细胞保护剂的试管中。
2.采集血处理 将试管进行4℃，3 000rpm，离心10min，取中上层稀释液。
3.捕获 基于免疫亲和原理，结合抗体或多态的免疫纳米磁珠捕获CTC（CTC用CK8，CK18和CK19抗体染色，CD45阳性染色细胞被认为是白细胞，并被排除在分析之外）。
4.通过磁场作用，将磁珠捕获及未捕获的细胞分离开（施加磁力以分离磁珠结合的EpCAM阳性细胞）。
1.通过留置针将CellCollector置于静脉血管中
CellCollector体内CTC检测技术检测原理与CellSearch类似，但在体内未进行采集过程，使用的EpCAM抗体特异性捕获CTC，首先均运用留置针将功能区置于肘静脉血管中。
2.体内静置30min以捕获CTC
在采集过程中，功能区将在血管中停留30min。
3.免疫荧光染色计数
进行显微免疫荧光特征分析，FITC标记细胞角蛋白CK抗体，CD45标记A647荧光基团，Hoechst对细胞核进行特异性染色，同时结合形态学鉴别循环上皮细胞，以确保捕获方法的特异性及灵敏度。
4.下游检测
捕获的CTCs经定位和分离后，可以进行后续的探索与应用研究（进一步分子分型和基因分型可有助于将“液体活检”应用于临床决策），检测灵活方便，可以在治疗过程中动态地多次进行检测。
5.结果判读及分析
判定标准：循环肿瘤细胞的判定标准为CKs（+），Nuclear（+），CD45（-）；白细胞判定标准为CKs（-），Nuclear（+），CD45（+）。
1.CTC是存在于外周血中各类肿瘤细胞的统称。通过捕捉检测外周血中痕量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，可实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。
2.大量研究表明，CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团（circulating tumor microemboli，CTM）。因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。
3.对于MIBC，cT 2 -T 4a N 0 M 0 ，拟进行根治性膀胱切除术的患者，CTC在判断患者预后的基础上，能够有效弥补传统影像学检查的不足，亦可筛选新辅助化疗敏感的患者，对新辅助化疗效果进行监测。
4.对于转移性的尿路上皮癌，CTC可以评价一线化疗效果并检测PD-L1的表达，或许可应用于免疫治疗的监测。
1.在NMIBC中，ctDNA用于T 1 G 3 的NMIBC危险度分层、疾病复发及进展预测；尿液肿瘤DNA（urine tumor DNA，utDNA）可用于膀胱肿瘤早筛、NMIBC患者复发的动态监测等。
2.在MIBC中，ctDNA可用于预测根治性膀胱切除术和综合性治疗反应，评估辅助治疗的必要性，以及监测复发或进展等；对于行保留膀胱治疗的MIBC患者，utDNA也可作为监测复发与进展的指标。
3.在转移性膀胱癌中，ctDNA被建议用于评估肿瘤突变、寻找药物突变靶点、评估治疗效果和耐药情况。
无特殊禁忌证。
1.数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法所需器材：EDTA管、ctDNA提取试剂盒、ddPCR分析仪及ddPCR反应体系配置相关试剂。
2.NGS方法所需器材：EDTA管、ctDNA提取试剂盒、NGS测序建库试剂盒、NGS测序平台（Illumina常用）及测序相关试剂。
1.明确把握ctDNA检测适应证，能正确解读ctDNA检测报告并与临床实际相结合的医师团队。
2.熟悉ctDNA血样采集、储存、处理规范流程的护理团队。
3.擅长ctDNA样本处理、检测操作流程、具有ctDNA高效检测设备，并能做出正确ctDNA结果判读及报告的研究团队。
由于ctDNA在总血浆cfDNA中的检出率较低，ctDNA分析具有挑战性，需要灵敏的检测技术。ctDNA检测方法目前大致可分为两种，一种以PCR为基础扩增，另一种高通量测序为基础检测。第一种方法随着数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）的出现，进一步提高了ctDNA的检出率。这项技术的缺点是生产液滴的过程既耗时又困难。另一种ctDNA检测技术方法是第二代测序（next generation sequencing，NGS）为基础的检测方法。根据富集策略的不同，基于NGS的技术目前又可分为靶向扩增子测序（targeted amplicon sequencing，TAS）及目标序列捕获测序（target sequence capture sequencing，TCS）。此外，还有全基因组测序、全外显子测序、全基因组甲基化测序等。基于NGS技术的检测方法灵敏度高，能同时检测多个基因的多种变异，可用于检测未知突变。但是其技术复杂，数据处理相对困难，费时且价格相对昂贵。
以下以目前常用的ddPCR检测ctDNA的方法讲解ctDNA检测流程：
1.选择合适患者，并予血液标本留取，分离离心，弃去沉淀，留下血浆。
2.使用循环游离DNA提取试剂盒提取血浆循环游离DNA。
3.循环游离DNA的富集：将水相和油相混合、振荡配成PCR反应体系并进行乳液PCR扩增，分离水相和油相，得到水相的PCR扩增产物，使用特异性结合循环肿瘤DNA的探针序列捕获所述水相的PCR扩增产物中的循环肿瘤DNA。
4.配置ddPCR（数字PCR）反应体系：将DNA样品、引物和探针/EvaGreen染料与ddPCR预混液混合。
5.微滴制备：将ddPCR反应体系添加至微滴发生器芯片小孔。
6.进行微滴PCR：将微滴转移至PCR反应板中，并密封。
7.微滴分析：将PCR反应板转移至微滴分析仪上，分析每个样品微滴的荧光信号，软件根据阴性微滴的比例，结合泊松分布原理，定量ctDNA浓度。
8.对ddPCR结果进行分析，对ctDNA进行定性及定量。
9.根据检测结果，结合患者临床实际病情，予以诊断及治疗策略制定。
1.ctDNA是cfDNA中最重要的一部分，是进入血液循环系统中的来自肿瘤的DNA片段，携带了肿瘤细胞多种基因信息。
2.ctDNA结合传统组织学病理诊断、影像学诊断、临床诊断等，有助于对肿瘤疾病状态的全面综合评估，精准判断患者肿瘤转移状态及生物学特性，有助于精准治疗。
3.ctDNA的定量分析可用于评估肿瘤负荷，在膀胱癌诊疗过程中对ctDNA动态定量分析，有助于早期判断疾病是否复发和进展。
4.ctDNA中携带了突变、插入、缺失、重排、拷贝数异常和/或甲基化等基因信息，对膀胱肿瘤ctDNA突变信息的检测，有助于判断患者对化疗、靶向治疗、免疫治疗等的敏感性。尤其在无法获得组织样本的转移性膀胱癌患者中，有助于判断转移灶生物学特性，指导选取有效的治疗药物。
5.目前ctDNA仍然是科学研究热点，其仍然存在检测率较低、假阳性率较高等缺点，需要进一步革新检测技术，进一步开展相关研究。
1.外泌体技术在膀胱癌临床中的应用尚处于早期阶段。
2.外泌体可用于膀胱癌早期筛查，用于NMIBC侵袭转移、危险度及预后评估。
3.在MIBC中，外泌体技术可能可用于判断肿瘤侵袭性和转移能力，并评估患者预后。
4.在mUC中，外泌体技术可用于评估转移灶生物学特性。
无特殊禁忌证。
外泌体成分多样，提纯及检测方法多样，根据提纯及检测方法，所需器材不同。
1.目前外泌体检测还未正式进入临床实践，需要医师团队把握外泌体性质特点开展相关研究，需符合伦理委员会规定，同时对研究结果谨慎判断，不得盲目用于临床实践。
2.目前外泌体检测方法多样、分析方法多样、分析内容繁杂，需要有专业的熟练掌握外泌体相关研究方法的科研团队，与临床医师紧密合作，正确解读外泌体研究结果。
外泌体分离方法丰富多样，目前无标准方法：
1.超速离心法 依据密度特性通过超高速离心，将外泌体从生物流体中分离出来的方法。
2.超滤法 根据特定截留分子量的超滤膜，将粒径较大的外泌体从生物流体中分离出来的方法。
3.排阻色谱法 当生物流体通过排阻色谱柱时，不同分子量的颗粒或分子会因流速不同而被分配到不同馏分中，可用于外泌体的纯化。
4.免疫磁珠法 通过将涂覆有抗标记抗体的磁珠和外泌体结合，可以选择性分离外泌体。
5.聚乙二醇沉淀法、微流控芯片技术等其他方法。
外泌体分析方法需根据分析成分，采用不同分析技术：
1.外泌体形态分析 使用透射电镜，对单个外泌体形态进行鉴别。
2.外泌体蛋白质分析 蛋白质印迹、流式细胞仪、ELISA或质谱技术可用于分析外泌体中蛋白质。
3.RNA分析 二代测序可用于了解外泌体中RNA组成，对于一致的RNA可以通过qPCR方法进行验证。
4.DNA分析 PCR、微阵列技术可用于已知DNA序列，二代测序可用于发现新的序列。
5.代谢分析 外泌体中还包含脂质、糖、氨基酸等小分子，代谢物变化分析可用于评估其来源的肿瘤代谢。
1.外泌体携带了母细胞来源的蛋白质、RNA、DNA，提供了一种实时动态监测疾病状态的新方法，外泌体和ctDNA、CTC共为液体活检三驾马车。
2.外泌体携带信息量介于CTC与ctDNA之间，其包含组分多样，肿瘤相关信息丰富，同时因外膜的存在，其内含物状态更加稳定。
3.ctDNA只能反映肿瘤基因组信息，而CTC虽然携带信息量最大，但其检测丰度较低。外泌体携带信息丰富，且其丰度适合，在肿瘤异质性分析、肿瘤预后标志物、肿瘤早筛等中具有极大前景。
4.目前受限于分离提纯技术和相关分析技术，外泌体距离实际应用于临床，仍需要进一步探索。
志谢：感谢张瑞赟、王逸秋、阿克周力等在本章节编写中做出的贡献。
（陈海戈）