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多项临床研究已证实，循环肿瘤细胞（CTC）是膀胱癌的独立不良预后因子，可能有助于患者的随访监测、化疗决策和潜在的个体化治疗。
在经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of the bladder tumor，TURBT）前，有相当一部分非肌层浸润性膀胱癌患者存在CTC。相关研究报道，采用经典CTC检测方法CellSearch，其CTC检出率为18%～20%，中位数目为1～1.5个。中位随访24个月发现，CTC阳性与较差的预后相关，CTC阳性患者具有较短的无复发生存时间和无进展生存时间 ［1-2］ 。
研究也证实CTC与肿瘤分期具有相关性，pT1期患者CTC检出率为31%（8/26），然而未在pTa期患者中检测到CTC（ P =0.027 5）。并且发现CTC与是否存在原位癌（carcinoma in situ，CIS）相关，根据患者是否存在原位癌，CTC的检出率分别为62.5%（5/8）和8.3%（3/36）（ P =0.002 8）。Kaplan-Meier分析发现，与CTC阴性患者相比，CTC阳性患者具有较短的无复发生存时间（6.5个月vs 21.7个月， P ＜0.001），且87.5%（7/8）的CTC阳性患者进展为肌层浸润性膀胱癌 ［1］ 。另一项入组102例行TURBT及卡介苗（BCG vaccine）灌注治疗的高风险pT1期膀胱癌患者的前瞻性临床研究表明，CTC的存在是较低的无复发生存率（风险比：2.92；95% CI：1.38～6.18）和无进展生存（风险比：7.17；95% CI：1.89～27.21）的独立预测因子。此外，CTC阳性对疾病进展的阳性预测值为75%，阴性预测值为93% ［2］ 。CTC检测是提高当前风险分层模型准确性的可靠工具，这可能对确诊后患者的最佳监测策略制定至关重要。
研究表明，接受根治性膀胱切除术的CTC阳性患者有更高的复发风险、较低的癌症特异性生存率和总生存率。此外，CTC阳性被证实是总生存较差的一个独立预测因素。CTC阳性与肿瘤的不良特征相关，如较晚的病理分期、组织切缘阳性和淋巴血管侵犯 ［3］ 。
一项入组185例患者的前瞻性研究显示，CTC的存在与未接受新辅助化疗的患者预后较差有关，但与接受新辅助化疗的患者无关。作者的结论是，CTC可能能够识别需要新辅助化疗的人群，且对支持或反对新辅助化疗的决策是有用的，特别是对那些基于病理危险因素不建议行全身性治疗的患者 ［4］ 。
目前，前瞻性干预性CirGuidance研究（NTR4120）正在评估CTC是否可以作为指导新辅助化疗治疗决策的生物标志物。
转移性膀胱癌患者，其CTC的检出率和数目相对较高。存在淋巴结转移的患者，26%～91%可检测到CTC，33%～66%的实质器官转移患者存在CTC ［5］ 。CTC检测可能对转移性膀胱癌的治疗监测有用，因为CTC增多与放疗和根治性膀胱切除术后的疾病进展相关。
CTC在单细胞水平上进行表型和分子表征分析的可行性已经得到证实。这为揭示肿瘤生物学特性提供了机会，如研究者可以通过CTC HER2/PD-L1状态预测患者靶向治疗的疗效，或利用CTC从基因组或转录组水平探究肿瘤内部机制、了解发病原因及耐药机制，甚至有机会预测耐药的发生。
在铂类化疗难治性转移性尿路上皮癌（metastatic urothelial carcinoma，mUC）患者中，发现CTC上HER2表达与原发肿瘤HER2表达存在相关性。这些结果表明，HER2阳性的CTC患者可能受益于HER2靶向治疗。
此外，包括荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）和PCR技术在内的分析CTC基因组变异的不同研究方法已经建立。对于单个CTC分析，目前可通过多种测序方法来进行突变和拷贝数变异分析。在尿路上皮癌中，CTC的基因组变异是否能反映疾病和治疗响应或耐药的实际基因组景观，尚未有临床研究验证。
虽然循环肿瘤DNA（ctDNA）水平升高可见于恶性肿瘤，并已被报道与某些癌症的肿瘤负担和预后相关，但在妊娠、创伤或炎症等良性疾病中也可见到其水平升高。一旦进入循环，ctDNA的清除速度很快，往往通过肾脏、肝脏和脾脏等代谢。对于ctDNA的分析，血浆样本被认为是优越来源，比血清样本更可靠。
ctDNA的定量分析可用于评估肿瘤负担，具有诊断意义。例如，癌症患者血浆中ctDNA的含量远远高于健康人或良性疾病患者，并且随着肿瘤分期的增加而升高，并且在不同的肿瘤类型之间也有所不同。最近的一份摘要报告估计转移性尿路上皮癌的ctDNA占cfDNA比例为1.9%。
目前，ctDNA检测结果对临床治疗的指导仍处于探索性阶段，仍无明确指南推荐。
ctDNA在NMIBC的使用目前主要聚焦于早期筛查和诊断、危险度分层、疾病复发及进展预测、对膀胱灌注治疗的反应性预测、复发情况检测等。一些研究也证实了ctDNA在预测NMIBC进展复发中的价值。
Birkenkamp-Demtröder等对12例疾病复发或进展为肌层浸润性膀胱癌（MIBC）的NMIBC患者的新鲜冷冻肿瘤组织进行全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）、全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）、meta-pair分析，且个性化设计并检测了患者血浆ctDNA，结果在83.3%（10/12）患者中检出了ctDNA增高，包括那些仅有非侵袭性疾病的患者。在66.7%（4/6）进展为肌层浸润性疾病的患者中，ctDNA的检出比MIBC临床诊断早了几个月 ［6］ 。Christensen等收集并检测了201个来自NMIBC患者病程期间采集的尿液样本，与没有疾病进展的患者相比，进展为MIBC的患者总体尿ctDNA水平更高。首次就诊时尿ctDNA水平高于中位数的患者（7/13；54%），与ctDNA水平低于中位数的患者（1/12；8%）相比，发生疾病进展风险更大（ P =0.036） ［7］ 。
ctDNA在MIBC的精准检测中可起到较大作用，包括其早期诊断、监测、预测根治性和姑息性治疗反应、评估辅助治疗的必要性，以及监测复发或进展等。
MIBC的标准治疗选择包括新辅助铂类为主的联合化疗结合根治性手术，及在无法行手术或保留膀胱意愿强烈的患者中，可以行TURBT、化疗、放疗结合的“三明治”治疗。目前，MIBC中缺乏对综合治疗反应的预测指标，ctDNA有望成为重要标志物。
丹麦奥胡斯大学研究人员纳入68例患者开展了一项关于膀胱肿瘤切除前后和化疗期间患者的ctDNA深度测序对预后影响的研究。研究结果显示，在患者化疗前，ctDNA阳性与较差预后相关（危险比29.1）。在患者根治性膀胱切除术后，动态检测ctDNA并进行疾病监测过程中，观察到ctDNA阳性患者的总复发率为76%（13/17），12个月复发率为59%（10/17）。在ctDNA阴性患者中，两个时间点（指总复发时间点和12个月复发时间点）的复发率均为0%（47例患者均未复发； P ＜0.001）。并且相比传统影像学检查，ctDNA检测平均提前时间为96天。此外，对于高危患者（治疗前或治疗期间ctDNA呈阳性），化疗期间ctDNA丰度的动态变化与疾病复发相关（ P =0.023）。他们的研究结果表明，与其他现有方法相比，ctDNA分析在膀胱癌诊断及治疗过程的动态检测中具有显著优势 ［8］ 。
Patel等也证明了ctDNA具有在临床或放射影像学确认之前预测膀胱肿瘤复发的潜力。研究者在17名接受新辅助铂类化疗的MIBC患者队列中，使用膀胱癌特异的8个基因进行标记扩增序列测定（TAM-SEQ），以检测患者TURBT肿瘤组织、血浆、尿细胞球（UCP）和尿液上清（USN）中的ctDNA。结果显示，59%（10/17）患者在开始新辅助化疗前采集的血浆和尿液样本中可检测到ctDNA阳性，但分析显示这对预测患者对治疗的反应无意义。然而，在分析第二周期新辅助化疗前采集的样本后，研究者发现83%（5/6）复发患者中存在ctDNA，而在无复发患者中未检测到ctDNA（特异性100%，敏感性83%）。影像学诊断进展的中位提前时间为243天 ［9］ 。这项研究表明，在新辅助化疗患者中，对其血浆和尿液ctDNA进行综合评估是很有必要的。
综上所述，MIBC中ctDNA的检出率相对较高，但目前随着对MIBC分子分型研究的深入，发现MIBC异质性较大，因此可能需要设计更加特异和灵敏的ctDNA检测方法。在临床，ctDNA检测主要应用于MIBC疾病危险度分层、对新辅助治疗反应的评估、辅助治疗决策、疾病复发及进展预测等。
在晚期癌症患者中，血浆或血清中的肿瘤起源DNA占总cfDNA的比例高达10%。在MIBC患者中，一些非常晚期的患者这一比例高达50%以上。正如Birkenkamp-Demtröder等的研究结果显示，膀胱癌患者中的大多数ctDNA似乎是通过转移病灶进入血液循环的。转移性复发患者的ctDNA水平明显高于无病患者，并且从检测出血浆ctDNA阳性到诊断复发之间的中位提前时间为根治性膀胱切除术后101天。最近的一项研究表明，在没有肿瘤组织可用的转移性膀胱癌患者中，cfDNA第二代测序能够识别出与肿瘤组织检测所类似的基因组改变。因此，ctDNA可能会揭示一些与治疗相关的突变信息，例如 FGFR3 、 HER2 、 PD - L1 突变等，尽管目前ctDNA中的这些突变与患者治疗反应的关系还未知 ［10］ 。
最近的一项研究分析了单个患者的多个转移瘤部位的组织，结果显示转移瘤之间存在明显的异质性。此外，在疾病晚期，患者内部肿瘤的异质性很高，仅使用保存的原发组织会产生误导，从而在药物选择和治疗中产生疑惑。在转移性膀胱癌患者中，ctDNA含量及丰度更高，较高的血浆ctDNA含量允许使用第二代测序（next generation sequencing，NGS）对相应的肿瘤基因组进行更广泛的测序，从而能够检测到患者转移性部位的肿瘤组织基因组特征，避免原发组织及转移灶异质性导致的耐药。从理论上讲，不需要侵入性活检，对血浆ctDNA的分析就可以对转移的肿瘤细胞进行分子表征。尤其是对那些无法穿刺的膀胱转移癌患者，有效的ctDNA测序，可能对其治疗和预后评估有积极的意义。
2016年，Sonpade等将68个癌症相关基因组成组套，在86.2%（25/29）转移性尿路上皮癌患者中检测到ctDNA。该研究小组进一步利用最新的73个基因组套证实了90%（265/294）转移性下尿路上皮癌患者血浆中存在ctDNA，并且发现 TP53 （48%）、 ARID1A （17%）和 PIK3CA （14%）是其中最常见的突变 ［11］ 。
McGrego等使用62个基因的组套，在73%（48/66）转移性尿路上皮癌患者血浆中至少发现一种突变。相比较于基线期肿瘤组织，在顺铂耐药时采集的血浆显示，不仅基线肿瘤组织中发现的 ERBB2 和 TP53 突变持续存在，同时还出现了新的 NF1 （该基因产物是ras信号转导途径的负调节因子，与1型神经纤维瘤病、少年骨髓单核细胞白血病和华生综合征有关）异常 ［12］ 。这意味着转移性尿路上皮肿瘤患者ctDNA中可检测到新的突变位点，表明ctDNA在进一步了解转移性尿路上皮癌的疾病进展和治疗耐药性方面有潜在的应用，有可能在治疗期间监测患者治疗反应或检测新的潜在靶点。
ctDNA检测可以评估患者对免疫治疗的反应。2017年美国临床肿瘤学会（ASCO）报道了一项共入组103例膀胱尿路上皮癌患者的研究，给予每2周10mg/kg durvalumab药物治疗。对33位膀胱癌患者治疗前血浆进行ctDNA检测，对29例患者治疗前和治疗6周后血浆进行ctDNA检测。其结果显示使用durvalumab治疗6周后，缓解组患者ctDNA中平均等位基因突变频率（variant allel frequency，VAF）显著下降，而复发组患者ctDNA中平均VAF下降则不明显。这似乎提示在使用PD-L1抗体durvalumab药物治疗的尿路上皮膀胱癌患者中，ctDNA水平降低的患者有更长的无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）。
综上所述，在绝大多数转移性膀胱肿瘤患者的血液中ctDNA水平较高，并且存在与治疗可能相关的基因组突变。在无法穿刺的转移性肿瘤患者中，ctDNA检测可能是评估肿瘤突变，寻找药物突变靶点的潜在工具。除了在监测和识别与治疗相关的基因方面的潜在效用外，ctDNA负荷水平及新的突变还可能作为治疗效果和耐药的预测工具。
外泌体的主要功能是递送各种生物分子，包括蛋白质、多肽配体、DNA和RNAs。据现有文献报道，多种细胞均可分泌外泌体，如T细胞、B细胞、树突状细胞、上皮细胞、内皮细胞、多种肿瘤细胞等，并可在多种体液中检测到外泌体的存在，如血液、乳汁、唾液、腹水、尿液等。
外泌体包含的组分，其分子稳定性优于其在血浆游离状态时，能真实反映分泌细胞的生理及病理功能状态，对于疾病的早期诊断有很重要的价值，可以充当膀胱癌的诊断标志物。外泌体作为一种诊断工具有许多独特优势：①外泌体内含有能反映细胞特性的特异性RNA或蛋白质，这些成分在外泌体膜结构保护下不易被人体的酶类物质分解；②外泌体获取途径简便，可通过非侵入性的方式从体液中获得，如膀胱癌细胞的外泌体即可以从尿液中分离纯化；③外泌体与肿瘤侵袭息息相关，能反映肿瘤生长特性，预测疾病进展。
肿瘤自身分泌的外泌体对膀胱肿瘤的侵袭转移和免疫逃逸有促进作用。Beckham等发现，从高级别膀胱癌患者的尿液中分离出的外泌体可以促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的转移和血管生成。Beckham等进一步从MIBC患者尿液样本中分离提取外泌体，并将其作用于低级别的膀胱癌细胞株，研究结果提示外泌体中EDIL-3蛋白激活了低级别膀胱癌中的ERK1/2MAP通路，从而增强了膀胱肿瘤细胞株的转移和侵犯侵袭能力，而当敲除EDIL-3后，细胞株转移和侵袭能力再次降低 ［13］ 。Jeppesen等研究发现，转移性膀胱癌细胞分泌的外泌体中蛋白质组分较非浸润性膀胱癌发生了明显变化，研究表明这些蛋白与肿瘤细胞发生侵袭转移相关。
一些研究显示，外泌体中的蛋白质对膀胱癌早期诊断和预后监测有意义。Welton等从膀胱癌细胞培养上清液中分离和纯化到了外泌体，对其进行蛋白质组学分析，发现了多种新蛋白质。同时，其在患者尿液外泌体中也证实了这些蛋白质的存在。Smalley等对健康人和膀胱癌患者的尿液外泌体进行蛋白质谱分析后发现，肿瘤患者外泌体中EGFR信号通路相关蛋白表达明显增多。
此外，外泌体中的RNA对膀胱癌的诊断也有价值。Long等收集膀胱癌患者（UCB）组和对照组尿液样本，并通过PCR芯片对外泌体中的236种miRNA进行分析，发现其中7种miRNA表达有差异，这7种miRNA对诊断UCB的灵敏度和特异度分别为88%和78%，提示miRNA可能作为膀胱癌的诊断标志物。此外，有研究提示外泌体中的长链非编码RNA（lncRNA）对膀胱癌的诊断也有价值 ［14］ 。Berrondo等报道HOTAIR（一种lncRNA）能用于识别高级别肌层浸润性膀胱癌，并有希望作为膀胱肿瘤预后预测标志物。其研究发现，与正常患者相比，高级别肌层浸润性膀胱肿瘤患者的外泌体中富集了大量HOTAIR，能促进细胞发生上皮间质转化以及增强细胞迁移和侵袭能力，并与预后负相关 ［15］ 。
综上所述，外泌体小泡中包含蛋白质、DNA和RNA等成分，并且肿瘤分泌的外泌体与肿瘤细胞的生长、侵袭转移、微环境调控等息息相关。外泌体的这些生物特性，提示其在膀胱肿瘤的诊断、治疗、预后评估等方面具有极大的临床应用前景。