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1.受试者依从性好，能配合检查和治疗。
2.膀胱癌组 病理检查确诊为膀胱尿路上皮癌，包括非肌层浸润组和肌层浸润组。
3.对照组 无明确泌尿系统疾病，无泌尿系疾病相关的症状体征。
1.近1个月内有泌尿道感染史或标准中段尿培养阳性或合并下尿路症状。
2.近1个月内有抗生素使用史。
3.合并严重的全身性疾患，如免疫缺陷等。
1.部分实验材料
Z.N.A.ostool DNA提取试剂盒、Big Dye v3.1测序试剂盒、Iruseq DNA LT Sample PreP K建库试剂盒。
2.主要仪器
Thermo nanodrop 2000紫外微量分光光度计，Illumina Misey测序平台。
1.具有一定的临床操作技术能力和临床经验、正确的无菌观念、良好的医患沟通能力等。
2.具有一定的实验技术水平。
3.具有一定的生物信息学挖掘能力。
操作步骤见图3-5。
图3-5 实例演示流程图
1.标本采集 留取受试者清洁中段尿液标本（晨尿）于灭菌采集管中（30～50ml），迅速置于4℃冰盒中保存，2小时内离心，后移弃上清液，留取沉淀保存于-80℃环境下，以备提取DNA。
2.DNA提取和质检 使用专用试剂盒进行总DNA提取。
3.文库构建和测序 包括DNA质检、定量PCR扩增、纯化PCR产物、去掉Buffer和二聚体、加接头和PCR法、纯化文库。
4.生物信息学分析 包括数据统计、序列拼接、物种分类和丰度分析、OTU统计、α多样性分析、β多样性分析、样品组间显著性差异分析、LEfSe分析、Metastats分析、PICRUSt分析。
5.患者尿液菌群丰富度明显增高；膀胱癌复发和进展风险越高，尿液菌群丰度越高，提示尿液菌群丰度可能与膀胱癌存在一定相关性（图3-6）。
图3-6 膀胱癌组和对照组尿液菌群相对丰度
条形图每种颜色代表一种细菌分类群，条形图的高度代表该分类群的相对丰度。A.门水平；B.纲水平；C.目水平；D.科水平。相对丰度＜1%与未分类的细菌分类群归为“其他”
6.PCOA分析结果显示膀胱癌组标本明显区分于健康对照组，提示膀胱癌有明显不同于对照组的尿液菌群特征，同时膀胱癌组标本明显聚集，提示可能存在共同的菌群失调模式。
7.LEfSe分析结果显示膀胱癌组尿液中Acinetobacter、Sphingobacterium等丰度明显增高，Serratia、Proteus等丰度明显降低，而这些差异菌属可能成为膀胱癌的生物标志物和潜在治疗靶点。
8.非肌层浸润性膀胱癌中高进展风险组及高复发风险组标本中，草螺菌属、产卟啉杆菌属及拟杆菌属的丰度明显增高，提示这些差异菌属可能有助于膀胱癌预后的风险分层。
高通量测序技术及细菌培养方式的发展打破了泌尿道无菌的观念，为膀胱癌等泌尿系统疾病的诊治提供了新思路：
1.性别、地区、年龄等多种被证实与膀胱癌密切联系的因素，可能是通过影响泌尿系统菌群构成，进而影响膀胱癌的发生、发展。
2.泌尿系统菌群完善了对泌尿道微环境的认知，除了尿路上皮细胞外基质，菌群及其代谢物也是微环境的重要组成成分。
3.相比取中段尿，导尿、耻骨上穿刺能够获取更清洁的尿液，得到更加真实的检测结果。
4.膀胱癌人群的泌尿道菌群丰度比健康人低，部分特异菌减少或富集，提示泌尿系菌群总体丰度改变、特异菌构成改变可能影响膀胱癌的发生、发展。这类特异菌可能成为预测膀胱癌预后的非侵入性生物标志物。
5.泌尿系统菌群能影响膀胱癌免疫治疗疗效，如直接作用导致BCG灭活。同时，肠道菌群对多瘤种的免疫检查点抑制剂疗效有着重要影响，泌尿道、肠道菌群同样可能影响膀胱癌的免疫检查点抑制剂疗效，是改善、预测免疫治疗疗效的新思路。
志谢：感谢高义胜博士参与资料搜集和编写工作。
（吴 芃）