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微生物组（microbiome）指一个特定环境或者生态系统中的全部微生物及其遗传信息，包括其细胞群体和数量、全部遗传物质（基因组）。它涵盖微生物群及其全部遗传与生理功能，其内涵包括了微生物与其环境和宿主的相互作用。微生物组学（microbiomics）是以微生物组为对象，研究其结构与功能、内部群体间的相互关系和作用机制，研究其与环境或者宿主的相互关系，并希望最终能够通过调控微生物群体生长、代谢等，为人类健康和社会可持续发展服务的学科。微生态（microecology）是存在于植物或动物体内的包括共生微生物和病原微生物的共生生态群落。人体微生态是近年来发现的具有重要作用的“新器官”。人体存在数目庞大（超10 14 个，干重约占人体总重量1%～2%）且结构复杂（包括细菌、古细菌、原生生物、真菌和病毒等）的微生物群落，定植于胃肠道、口腔、皮肤、泌尿生殖道、呼吸道等，它们所编码的基因数量可达人体自身基因数量的150倍，相当于人体的“第二个基因组”，包含重要的遗传信息。人体微生态无论在维持人体健康还是在疾病的发生发展过程中都扮演着重要角色。一方面，它是宿主消化吸收、免疫反应、物质能量代谢的重要维持者，直接或间接调控消化系统、免疫系统、神经系统等功能 ［10］ ；另一方面，人体微生态失衡与多种疾病的发病机制密切相关，同时也是药物代谢、微生物耐药的中间站，并且微生态会随着年龄增长不断变化，与人的衰老、寿命息息相关。
国内外对肠道菌群的研究一直很活跃，但对泌尿道菌群的研究最近才开始。高通量DNA测序和增强培养方法（expanded quantitative urine culture，EQUC）最先被用来鉴定传统尿液样本培养阴性的女性膀胱细菌，并取得了成功。这些研究通过导尿取得中段尿标本，结果显示女性膀胱微生物与急迫性尿失禁和膀胱过度活动症（overactive bladder，OAB）等有密切联系，某些种类的乳酸菌缺乏甚至会导致患者术后易发尿路感染（urinary tract infection，UTI）。为了确定泌尿道微生物组的特征，研究人员主要使用了两种方法：16S rDNA高通量测序和EQUC。16S核糖体RNA在细菌中高度保守，通过16S rDNA高通量测序可以准确快速识别。16S rDNA高通量测序是一种非常敏感的检测方法，但它不能确定是不是活菌。虽然用于检测大肠杆菌和其它一些确定的尿病原体的标准临床微生物学尿液培养已建立和完善，但此方法仅可培养某些需氧菌和生长快速的病原菌，如肠杆菌属、粪肠球菌属等。而对于另一些生长较慢、厌氧以及对生长环境要求较严格的微生物，如棒状杆菌属、乳杆菌属等，则难以通过标准培养进行分离与鉴定。EQUC通过改善尿液菌群生长条件，包括增加标本量、改变不同的生长介质和气体条件，并延长培养时间，能在种水平上鉴定出标准培养所遗漏的细菌，可以更完整地描述存在的微生物（图3-2）。通过联合16S rDNA高通量测序和EQUC发现二者检测出的细菌类型存在明显重叠，表明测序所鉴定出的细菌大部分处于存活状态。泌尿道微生物群包括泌尿道的细菌、真菌、寄生虫、衣原体、支原体和病毒等所有微生物群体，但是通过宏基因组学研究至今未发现正常情况下健康人泌尿道病毒和真菌的存在证据，因此习惯把泌尿道微生物群称为泌尿道菌群。泌尿道菌群只是泌尿道微生物群的一部分，把清洁中段尿培养的尿液菌群称为膀胱菌群，严格意义上也是不合适的。早期研究泌尿道微生物组学的学者习惯把耻骨上膀胱造瘘以及导尿所得的尿液菌群称为膀胱菌群，把清洁中段尿获得的尿液菌群称为泌尿生殖道菌群，但是由于泌尿道微生物组学的研究刚刚起步，还未能对整个尿路的细菌区分进行严格意义的定义，这需要在大量实验数据的基础上进行重新评估界定。在本篇文章中，我们把清洁中段尿获得的泌尿道菌群等同为膀胱菌群，因为在对健康人进行导尿、造瘘或者留取正常尿路黏膜等创伤性操作时获得菌群是不合乎伦理道德的，随着研究的深入，我们会对泌尿道微生物群落的界定进行进一步的考虑。
图3-2 增强培养技术的优势
在人类尿液微生物组中发现的最普遍的菌属是乳酸菌（15%），其次是棒状杆菌（14.2%）、链球菌（11.9%）、放线菌（6.9%）和葡萄球菌（6.9%）。宏基因组学和宏蛋白质组学的结合和进一步发展，使得健康的尿液微生物群和无症状菌尿状态得以区分，同时发现健康的尿液微生物群中女性以乳酸杆菌占优势，男性以棒状杆菌占优势 ［11］ 。几个年龄特异性的菌属也被发现：Jonquetella、Parvimonas、Proteiniphilum和Saccharofermentans只出现在年龄＞70岁人群组中。虽然在健康人群尿液中检测到的菌群没有致病性，会在尿路建立起一个复杂的生态网络，与宿主黏膜相互作用，可以保护机体在生理状态下不被感染，或抑制病原菌的定植和继发感染，起到宿主防御的作用。在肠道菌群中，优势菌群的紊乱产生了所谓的菌群失调，可能导致肠道和肠道外疾病的发生和发展，比如结肠癌。有研究表明OAB患者的泌尿道菌群丰富度和多样性均显著降低。在不同研究中，OAB患者泌尿道菌群特定种属气球菌属和变形杆菌属增多而乳杆菌属减少，专性厌氧菌属（如普氏菌属和梭杆菌属）显著减少，而兼性厌氧菌属（如变形杆菌属和气球菌属）相对增多，呈相似的变化趋势，这一菌群紊乱可能是女性OAB患者特有的菌群失衡状态。研究人员还探讨了男性泌尿道菌群在泌尿系统疾病中的作用。一项关于衰老对男性泌尿道菌群影响的研究报告发现：随着年龄的增长，男性泌尿道菌群的细菌总数显著减少，而属的数量却增加了，即男性尿路中的微生物群落可能变小，但多样性增加。最近一项对男性的研究表明，下尿路症状（lower urinary tract symptoms，LUTS）的严重程度与通过导尿所获得的尿液检测细菌（即男性膀胱菌群）的数量及种类均有一定的相关性。这些结果证明膀胱拥有自己的微生物群落，这些微生物有保护宿主的功能，它的失调会导致膀胱生理功能紊乱。膀胱微生物稳态是膀胱生理功能的重要决定因素，其可决定膀胱的重量、大小及相关基因的表达 ［12］ 。
虽然很多新型生物技术已广泛应用于尿微生物组与良性泌尿系统疾病关系的研究，但尿微生物组与泌尿系统恶性肿瘤关系的研究还很少。
一项来自克罗地亚斯普列特大学的研究采用16S rDNA测序的方法分析了12例男性膀胱癌患者和11例年龄匹配的健康对照组尿液样本中的细菌群落。研究结果表明，两组中最丰富的门是厚壁菌门，其次是放线菌门、拟杆菌门和变形杆菌门。虽然两组之间的微生物多样性和总体微生物群落组成没有显著差异，但可以确定两组中更为丰富的操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）是不同的。在膀胱癌组中显著富集的细胞中，发现了一种属于梭杆菌属的OTU，它可能是一种原发病原体。在一项涉及42个膀胱癌组织的独立样本研究中，有11个组织的核梭菌序列被PCR检测到。健康尿液相比膀胱癌组尿液中含有较多的3种OTU，分别为Veillonella属、链球菌属和棒状杆菌属。虽然没有观察到整体微生物组的主要差异，但确定了几个OTU在膀胱癌或健康亚组中明显过度表达。这些差异提示尿微生物在膀胱癌发病机制中的可能作用，值得进一步评价 ［13］ 。
另一项更为详细、样本量更大的研究来自于笔者所在的南方医科大学南方医院，笔者收集了31名男性膀胱癌患者和18名健康对照组的中段尿液，从中提取DNA，利用Illumina MiSeq对V4区进行高通量16S rDNA测序，经过QIIME过滤和UPARSE聚集进行结果序列读取，观察到与对照组相比膀胱癌组细菌丰富度增加，不动杆菌、厌氧菌属、鞘脂杆菌属（Acinetobacter，Anaerococcus，Sphingobacterium）等菌属富集和沙雷氏菌属、变形杆菌属、玫瑰单胞菌属（Serratia，Proteus，Roseomonas）等菌属减少（图3-3）。癌症组和非癌症组的β多样性存在显著差异，在不同的风险水平之间存在差异，而在不同的肿瘤分级之间无明显差异。在具有高复发和进展风险的癌症患者中观察到赫氏杆菌属（草螺菌属）、卟啉杆菌属和拟杆菌属（Herbaspirillum，Porphyrobacter，Bacteroides）的富集，这意味着这些菌属可能是危险分层的潜在生物标志物（图3-4）。在此项研究中发现了癌症组的葡萄球菌感染以及甘油脂代谢、视黄醇代谢等多种功能通路增加，从微环境及代谢组学的角度显示出微生物对肿瘤进展及其微环境的影响，但仍需要进一步研究 ［14］ 。
鉴于早期对女性尿微生物组的研究，中段尿往往不能精确代表膀胱微生物组，中段尿中检测到的细菌DNA与经导尿检测到的DNA有差异，利用导尿得到的结果可能更理想。前述两项研究均受到尿液标本的限制，但考虑到研究中采取了严格的会阴清洁流程，以及男性与女性解剖上存在差异，我们对男性清洁中段尿的结果仍然非常肯定。
图3-3 各样本在属水平上尿液菌群结构组成
树状聚类图（右侧，基于未加权UniFrac度量，样品越靠近，枝长越短，说明两个样品的物种组成越相似）；属级别尿液菌群结构分布直方图（左侧，每种颜色代表一个细菌分类群，每一条直方图代表一个样本；直方图的长度代表细菌的相对丰度，相对丰度＜0.5%和未分类的细菌属归为其他）。
海军军医大学第一附属医院（上海长海医院）收集了22例膀胱癌组织和12例癌旁正常膀胱黏膜组织标本而不是用尿液标本，进行了生物信息学分析。他们的研究结果显示两种组织的优势门均为变形杆菌门，癌组织的物种丰富度和多样性较低，癌组织和正常组织的β多样性存在显著差异。在癌组织中，微生物属Lactobacillus、Prevotella_9和Ruminococcaceae的相对丰度较低，而Cupriavidus spp（Brucellaceae科的一个未知属）、Acinetobacter、Anoxybacillus、Escherichia、Shigella、Geobacillus、Pelomonas、Ralstonia和Sphingomonas的相对丰度较高。研究者认为这些属可能作为膀胱癌的生物标志物，并可能有助于该疾病的筛查和监测。考虑到膀胱肿瘤的多中心性，以及膀胱因为尿液的流动性在微生物学理论上是作为一个整体出现，该实验选用了癌变膀胱黏膜及癌旁正常组织的膀胱黏膜作为标本，为膀胱癌变和进展过程中黏膜微生物群的改变提供了重要依据 ［15］ 。
图3-4 与膀胱癌相关的微生物分类群
A.表示与膀胱癌组（红色）和对照组（绿色）相关的尿微生物类群的分类图；B.通过线性判别分析效应大小（LEfSe）将特定微生物群分类群与癌症组和非癌症组相关联。红色表示在癌症组中富集的分类群，绿色表示在非癌症组中富集的分类群。
虽然各项研究结果有差异，但是均证实膀胱癌患者发生了膀胱菌群失调，并揭示了先前未被描述的人类膀胱的细菌多样性。这些细菌可能具有影响膀胱癌进展的潜力，并可能与菌群代谢的有害化学产物有一定的相关性，这也可能进一步说明膀胱微环境与膀胱癌的发生密切相关。找到这些变化的原因将为膀胱癌的发病机制提供新的思路，并为膀胱癌的诊断和治疗提供新的方法。因此需要尽快明确膀胱癌与膀胱菌群是否具有因果关系，及其内在的致病机制。
泌尿外科医师通过膀胱内灌注BCG这种微生物，治疗高级别非肌层浸润性尿路上皮癌已超过40年。BCG是牛分枝杆菌的减毒活株。1972年，阿尔瓦罗·莫拉莱斯（Alvaro Morales）首次将BCG注入人体膀胱用于治疗尿路上皮癌（urothelium carcinoma，UC）。虽然BCG灌注治疗已成为中、高危非肌层浸润性膀胱癌患者术后的标准治疗方案，但仍有相当部分的患者出现复发及进展，且治疗的剂量、频率和持续时间（维持治疗）一直存在争议，对于如何在最大限度提高疗效的同时使副作用（尿频、尿急、排尿困难、血尿和更罕见的副作用，如BCG败血症）最小化仍是一个挑战。
在一个关于BCG活性的现代研究模型中发现，牛分枝杆菌首先通过与纤连蛋白和整合素α5β1结合，然后通过胞吞作用进入过表达α5β1的UC细胞，从而使BCG内化。之后，UC细胞上调表达Ⅱ类MHC、ICAM-1和分泌细胞因子（IL-6，IL-8，GM-CSF，TNF-α），随着树突状细胞募集免疫细胞（粒细胞，CD4 + 和CD8 + 淋巴细胞，NK细胞，巨噬细胞），导致大量细胞因子（白介素，TNF-α、IFN-γ，GM-CSF等）的释放。BCG通过多种机制，包括影响NK细胞、CD8 + 细胞毒性T细胞、巨噬细胞和粒细胞（通过肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体或TRAIL）导致对UC细胞的细胞毒性。有研究表明，泌尿道菌群可能通过多种机制影响BCG的治疗反应，这些机制包括导致膀胱腔内BCG的破坏或失活，或通过附着于纤维连接蛋白调节UC细胞对BCG的敏感性。免疫学研究表明，许多宿主共生体和益生菌菌株，如乳酸菌表现出通过NF-κB通路以及对IL-6和IL-8的抑制减弱黏膜炎症的能力，这表明在BCG存在的情况下，局部微生物群落可能通过竞争性地结合纤连蛋白影响BCG的抗癌疗效。
泌尿道菌群可能对晚期和转移性UC也有影响。近年来，免疫治疗在晚期恶性肿瘤治疗中的应用有所增加，尤其是许多针对PD-1/PD-L1免疫检查点新药物应用。最近一些探讨人体肠道微生物群与抗PD-1治疗的疗效之间关系的研究显示，共生微生物的组成与抗PD-1治疗的临床疗效有关，其中尤受关注的是转移性黑色素瘤采用抗PD-1/PDL1药物治疗的疗效与双歧杆菌、油毡菌和粪肠球菌的存在时间有关。抗PD-1/PD-L1药物治疗转移性尿路上皮癌的疗效可能与肠道或泌尿道菌群中某些有机体的存在有关，尽管这一点尚未被研究证实，但是可能性很大。因此，深入探讨泌尿道菌群与免疫治疗间的联系，或许能为晚期膀胱癌患者的个体化治疗提供新思路。