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各种尿液标本：排泄尿、器械尿或回肠导管尿等，推荐使用过夜尿。
严重的泌尿系统感染及结石。
1.尿液收集瓶。
2.离心机。
3.液基薄层全自动制片仪。
4.通风柜。
1.熟练操作尿液标本液基薄层制片的技术员。
2.掌握尿液标本石蜡包埋的技术员。
3.尿液细胞学诊断需要工作5年以上的细胞学病理医师进行操作。
1.收集尿液脱落细胞
（1）尿液收集：留取过夜尿150～200ml，留取时间段为当日22点至次日8点，取无菌容器收集尿液（嘱患者适当进行膀胱按摩）。
（2）细胞收集：摇匀标本，倒入3～4支50ml离心管中，600g 离心10min，弃上清。
2.固定
（1）固定：按标本，固定液比例为1∶10加入固定液，摇匀。
（2）离心：静置30min，取1支离心管用于薄层液基制片（其余用于制作细胞蜡块），600g离心10min，弃上清。
3.清洗
（1）转移：观察离心管内沉渣，若可见，吸取沉渣1～5滴转移至12ml离心管，加10ml缓冲液；若不可见，加10ml缓冲液，摇匀后全部转移至离心管。
（2）离心：600g 离心5min，弃上清。
4.上机制片、封片。
5.标本质量评估 为保证诊断的准确性，必须首先对检测的尿液标本进行满意度评估，目前针对尿液细胞学标本满意度评估的标准并没有明确的定义，在ThinPrep液基制片中，推荐尿路上皮细胞数量不少于2 600个，或者连续计数10个高倍视野，平均每个视野不少于2个。若用体积衡量，推荐尿量至少为30ml。
在液基片中若发现尿路上皮细胞被完全遮盖，例如炎症细胞、血液等，镜下无法进一步诊断，则该标本应判为不满意标本。若发现非典型尿路上皮细胞，则不计尿路上皮细胞数量，均判为满意标本。
1.无明显诱因出现的血尿。
2.尿液脱落细胞学提示恶性肿瘤，但内镜检查未发现病变。
3.临床已确诊尿路上皮癌患者术后的随访。
严重的泌尿系统感染及结石。
1.通风柜。
2.防脱载玻片。
3.FISH杂交仪。
4.恒温水浴箱。
5.荧光显微镜。
1.熟练操作FISH技术的技术员。
2.掌握FISH荧光显微镜诊断的医师。
3.工作5年以上病理医师1名，能完成疑难病例解读。
1.尿液脱落细胞样本的处理及制片
（1）收集尿液脱落细胞：
留取过夜尿。将尿液样本倒入50ml离心管，2 000rpm/min离心5min，弃上清。将细胞沉渣全部转移至15ml离心管中。
（2）低渗：
加5ml 0.075mol/L KCl溶液（溶液需提前预热至37℃），混匀，37℃水浴10min，期间吹打3～4次。
（3）预固定：
加2ml 固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1，现配现用），用吸管吹打混匀，2 000rpm/min离心5min，弃上清。
（4）第一次固定：
加5ml固定液，混匀静置10min，2 000rpm/min离心5min，弃上清。
（5）第二次固定：
加5ml固定液，混匀静置10min，2 000rpm/min离心5min，弃上清。
（6）细胞悬液的制备：
根据细胞沉渣倒入适量固定液，混匀后滴片至少2张，每张1～2滴，每滴10μl（细胞浓度和滴片高度综合考虑，一般高浓度选择5cm，低浓度选择3cm）。
（7）细胞悬液的保存：
细胞悬液可在-20℃环境中保存2年。若需重复实验，使用前2 000rpm/min 离心5min，弃上清，加入新配制的固定液，混匀后滴片（操作同前）。
（8）样本玻片的保存：
将载玻片置于56℃烤箱中至少30min，或室温条件下过夜（室温保存最长2周）。
2.样本玻片预处理
（1）漂洗：
室温下将玻片置于2×SSC溶液中（pH 7.0），漂洗5min。
（2）消化：
将玻片置于37℃预热的胃蛋白酶溶液中，浸泡5min（不同实验室具体消化时间需要适当调整）。胃蛋白酶溶液：20mg胃酶（粉剂）溶于1ml ddH 2 O，160μl分装，-20℃保存。使用前取1支加入40ml 0.01mol/L HCl溶液中（终浓度为0.08mg/ml），37℃预热。
（3）漂洗：
再次将玻片置于2×SSC溶液中，漂洗5min。
（4）固定：
甲醛/PBS缓冲液40ml（甲醛：PBS按体积1∶39）溶液中，漂洗5min。
（5）脱水：
将玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各3min脱水，自然风干。
3.变性、杂交（避光操作）
（1）离心：
将杂交液充分震荡混匀，瞬时离心。
（2）加样：
吸取10μl杂交液，加到载玻片的杂交区域（可用油笔提前画圈标记），盖上盖玻片，避免产生气泡。
（3）封片：
用封片胶密封盖玻片边缘（需注意密封完整，防止干片）。
（4）杂交：
杂交仪内浸湿湿条，将玻片置于杂交仪上，75℃变性5min，42℃杂交至少16h。
4.杂交后洗涤及复染（避光操作）
（1）去密封胶：
取出玻片，用镊子轻轻撕去边缘的密封胶，移去盖玻片，或将玻片直接放入2×SSC溶液中，浸泡2min，便于盖玻片自行脱落。
（2）漂洗：
2×SSC溶液中（47℃预热），浸泡5min。
（3）去残留杂交液：
分别取40μl NP-40和40ml 2×SSC配制成浓度约0.1%混合液（47℃预热），浸泡5min。
（4）脱水：
室温置于70%乙醇溶液中，脱水3min。取出玻片，避光自然风干。
（5）复染：
吸取10μl DAPI复染剂，滴至杂交区域。盖上盖玻片，室温放置10min后荧光显微镜下阅片。
5.FISH质控
合格的制片一般杂交区域脱落上皮细胞单层均匀平铺，其中75%以上的细胞同时具有红、绿信号。
男性，75岁，反复无痛全程肉眼血尿1月余。2018年4月盆腔CT显示膀胱三角区肿物，考虑膀胱癌。术前诊断采用尿液脱落细胞联合FISH检测，结果显示：尿液脱落细胞学查见高级别尿路上皮癌细胞（图1-9A）。FISH检测3号、7号、17号染色体 CSP 位点以及 GLP - p16 基因位点均异常，提示恶性肿瘤（图1-9B、C）。2018年6月接受经尿道膀胱肿瘤切除治疗，术后病理结果为高级别浸润性尿路上皮癌，局部侵犯肌层，基底未见癌（图1-9D）。患者不接受二次电切或膀胱全切。
对于高级别尿路上皮癌患者，术后随访可采用膀胱镜、尿液脱落细胞学联合FISH检测。该患者术后采用膀胱灌注化疗，3个月后复查膀胱镜、尿液细胞学及FISH结果均为阴性。此后按术后第1～2年每3个月随访1次，第3年每6个月随访1次。至2020年11月尿液脱落细胞学查见少数非典型尿路上皮细胞（图1-9E），FISH检测出3、7、17号染色体 CSP 位点以及 GLP-p16 基因位点均异常，提示肿瘤复发。CT检查显示：膀胱右后壁肿物，考虑膀胱癌复发。2021年1月行机器人辅助腹腔镜根治性膀胱切除术，术后病理结果为高级别浸润性尿路上皮癌（图1-9F）。其后随访一直采用影像学、尿液脱落细胞学联合FISH检测，目前病情稳定。
图1-9 膀胱肿瘤患者尿脱落细胞学、FISH及病理检查
A.退变细胞异型性明显，核浆比高，核膜不规则，核染色质分布不均匀（SurePath液基涂片，×400倍）；B. GLP P16 / CSP17 荧光计数为0红3绿（0R3G），提示 P16 基因完全缺失，且17号染色体异常；C. CSP3 / CSP7 荧光计数为5绿4红（5G4R），提示3号及7号染色体异常；D.高级别浸润性尿路上皮癌。异型的肿瘤细胞散在分布，细胞分化较差，浸润肌层（HE染色，×100倍）；E.细胞大小不一，异型性明显，核浆比高，核膜不规则，核染色质呈粗颗粒状（SurePath液基涂片，×400倍）；F.高级别浸润性尿路上皮癌（复发）。恶性肿瘤细胞弥漫分布，广泛浸润肌层（HE染色，×100倍）。
1.尿路上皮恶性肿瘤的诊断有多种方法，包括侵入性及非侵入性检查，其中尿液脱落细胞学检查是应用最广泛的无创检查方法，细胞制片为液基制片，目前判读标准国际上多采用TPS报告系统。
2.尿液分子标志物检测具有重要临床应用价值，可辅助尿液脱落细胞学诊断，协助鉴别非典型尿路上皮细胞的良恶性，提高尿路上皮肿瘤的精准诊断。在美国FDA批准的检测方法中，其中应用广泛，灵敏度和特异性较高的检测方法为FISH检测。
3.充足的细胞量是实现精准诊断的基础，尿液脱落细胞常发生退变，因此标本的留取应严格遵守操作规范及流程。
4.尿路上皮癌患者病程反复，术后复发率较高，特别是高级别尿路上皮癌患者，因此尿液脱落细胞学联合FISH检测具有重要的临床应用价值。该联合检测不仅可用于术前诊断，亦可用于术后随访。
（付 莎）