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免疫荧光技术（immunofluorescence technology）又称荧光抗体技术，是将抗原抗体特异结合的免疫学技术与荧光标记技术结合起来对特异蛋白抗原在细胞内分布定位或定量测定的方法，是发展最早的标记免疫技术，具有检出限低、灵敏和选择性好的特点。
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，可以分为定性和定量两类方法。荧光抗体技术（荧光显微镜技术），是将已知的抗原或抗体用荧光素进行标记，与标本中相应的抗体或抗原反应后，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或橘红色），通过荧光显微镜可以观察荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位或定量。免疫荧光测定技术，是抗原抗体反应后，利用特定仪器如荧光分光光度计测定荧光强度推算被测物浓度进行定量分析。新的免疫荧光技术还有流式细胞免疫荧光技术、时间分辨免疫荧光技术和荧光偏振免疫荧光分析技术等。
根据抗原和抗体的识别标记方法不同，免疫荧光法又可分为直接标记法和间接标记法（原理见图1-4-14）。
图1-4-14 免疫荧光法原理
不同的荧光素激发和发射的波长均不同。常用于标记的荧光素主要有下列几种：
最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。
是目前普遍使用的新型荧光素，最大吸收光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。与FITC的黄绿色荧光对比鲜明，两者常用于双重染色。
如镧系元素铕（Eu 3+ ）螯合物，激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，激发后发射特征性的荧光，可用于分辨荧光免疫测定。
如金胺O染色法、金胺罗达明染色法等，结核分枝杆菌在荧光显微镜下呈亮黄色或金黄色，提高了涂片检查的灵敏度。20世纪末，发光二极管（LED）冷光源的问世，使荧光显微镜价格降低，可用于基层；未来移动数字荧光显微镜开发成功将更实用。近年来发明了一些新的荧光技术如应用DMN荧光染色剂标记海藻糖化合物，然后与结核分枝杆菌细胞膜的脂质结合，糖化合物位于细胞膜双分子层的疏水内侧，水被排除在外，当受到光照时，荧光剂就能表现出荧光性，从而快速、准确地检测活的结核分枝杆菌。新发明的荧光探针CDG-DNB3可对单个细菌样本进行标记，被结核分枝杆菌的BlaC酶激活后并发出明亮的绿色荧光，通过微流控芯片对结核分枝杆菌进行计数，该探针能区分结核分枝杆菌是否存活。
目前临床常用3类商业化的分枝杆菌荧光定量检测试剂盒：①可快速、高灵敏度地检测标本中结核分枝杆菌特异性基因序列，如COBAS TaqMan MTB试剂盒、Real-Q MTB试剂盒、TruenatTM MTB、FluoroType MTB及单管巢氏实时定量PCR试剂盒（one-tube nested real-time PCR，检测标本中MTB IS6110 序列）；②快速检测临床标本中结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，如分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、AdvanSure TB/NTM实时定量PCR试剂盒；③Xpert MTB/RIF试验采用半巢式实时荧光定量PCR技术快速、自动化地同时检测结核分枝杆菌基因及RFP常见耐药基因型。
放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Yalow和Berson首先用于糖尿病患者血浆胰岛素含量测定而建立的一种超微量分析方法。其是将放射性同位素示踪技术与免疫化学技术巧妙结合而建立起来的分析方法，具有灵敏度高、特异性强等优点。
放射免疫分析是用放射性核素标记抗原或抗体，然后与被测抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物，通过测量放射性进行定量分析。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测，敏感性可达到pg/ml水平。常用的标记物有 3 H、 131 I和 125 I。
根据原理，测定方法分为两种：
又称传统RIA，主要特点：标记的是抗原，用已知量的具有放射活性的抗原和已知量的针对该抗原的抗体特异性结合。如果加入含有该抗原的标本，标本中的抗原也能与相应的抗体结合，于是具有放射活性的抗原按一定比例与抗体分离。标本中的抗原浓度越高，从相应抗体上分离的具有放射活性的抗原量越大。测定分离的具有放射活性的抗原就能计算出标本中该抗原的含量。
又称免疫放射分析（IRMA），主要特点：标记的是抗体，分为两种：单位点IRMA，抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原，固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；双位点IRMA，抗原有两个抗原决定簇，所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体双位点IRMA，又称双抗体夹心法。将过量的标记抗体与抗原结合，分离结合的标记抗体与未结合的多余标记抗体，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原的量呈正相关。
根据加样顺序不同，RIA可分为两个类型：
将待测抗原和标记抗原同时与抗体反应，达到平衡后分离标记抗原-抗体和标记抗原，方法稳定，但敏感性稍差。
先将待测抗原与抗体充分反应，达平衡后再加入标记抗原，敏感性提高，但稳定性不如平衡法。
放射免疫分析技术是一种放射性同位素体外微量分析方法，可以检测多种物质。在内分泌学中检测胰岛素、生长激素和血管紧张素等；在传染病中检测乙型肝炎抗体的亚型；在免疫学中检测免疫球蛋白G、免疫球蛋白E和类风湿因子等；在肿瘤学中检测癌胚抗原、叶酸和维生素等；在药理学中检测吗啡、地高辛和药物中毒等。在20世纪70—80年代已有采用放射免疫测定法检测抗结核抗体或结核抗原，但因放射性问题，已基本被淘汰。
RIA的优点是灵敏度高、特异性强、准确性好、简便易行、用样量少等，常可测至皮摩尔。虽然用放射性物质，但一般都是在测试样品时再加入标记的同位素示踪物，且示踪物的放射性强度极低，一般不会对实验者引起辐射损伤。RIA虽然有很多优点，但也存在不少缺点：①试剂的半衰期短，费用较高，需要专门的设备，有效期短；②放射性核素对人体存在一定潜在的危害性；③试验废物处理困难；④放射性核素标记有时会改变某些生物物质的生理活性。
ELISA是将抗原抗体特异结合的免疫学技术与酶标记技术结合定性或定量检测抗体或抗原的方法。具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，其发展迅速，成为酶免疫测定技术中应用最广泛的技术。
ELISA的基本原理是将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法将液相中的游离成分洗除，使抗原抗体复合物与游离成分分离。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不同，有以下3种常用方法：
测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。
常用于测定抗原。将已知捕获抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合。温育后洗涤，加入酶标检测抗体和底物进行测定。
可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例：将特异性捕获抗体吸附于固相载体，加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。
以间接法为例说明ELISA的操作步骤。
（1）包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6）：
加蒸馏水至1000ml。
（2）洗涤缓冲液（0.15M PBS-Tween-20，pH 7.4）：
加蒸馏水至1000ml。
（3）稀释液
此液用于稀释血清及酶结合物，配制后置于4℃保存。
2.TMB反应液，临用前将A、B液等体积混匀。
3.终止液（2N H 2 SO 4 ），取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。
1.聚苯乙烯塑料板（简称酶标板），微量加样器，洗涤瓶。
2.ELISA检测仪，4℃冰箱，37℃孵育箱。
1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加100μl，空白孔加包被缓冲液，置湿盒于4℃过夜。
2.次日用洗涤缓冲液洗板3次，每次3分钟。
3.加用稀释液稀释的待检样品100μl，同时设空白、阴性及阳性孔对照，空白孔直接加稀释液，置37℃孵育1小时。
4.洗涤缓冲液洗板3次，每次3分钟。
5.在反应孔中加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）100μl。
6.洗涤，缓冲液洗板3次，每次3分钟。
7.加底物液显色，于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100μl，37℃显色10～30分钟。
8.终止反应，于各反应孔中加入终止缓冲液50μl。
9.结果判定，在ELISA检测仪上，于波长450nm处，以空白对照孔调零后测各孔光密度（OD值），记录数据。
ELISA各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：
许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。无论何种载体，在使用前均须进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一，据此判定其吸附性能是否良好。
将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要高，吸附时一般要求pH值在9.0～9.6。吸附温度、时间及其蛋白浓度也有一定影响，一般多采用4℃过夜。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1μg/ml、1.0μg/ml和10μg/ml等）进行包被后，在其他实验条件相同时，观察阳性标本的OD值，选择OD值最大蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定，然后再固定其他条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
对供氢体的选择要求是价廉、安全、反应灵敏、无本底。有些反应底物（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的底物，如TMB和ABTS。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱终止反应。通常底物作用时间以10～30分钟为宜。如需更高的灵敏度可考虑使用化学发光底物并使用配套的化学发光检测仪，其检测限可达到pg/ml或pmol/ml水平，且线性范围宽，需要注意所有反应底物使用液必须新鲜配制。
免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique）是20世纪90年代兴起的一种常用标记技术，它以胶体粒径的金颗粒为标记物，利用特异性的抗原抗体反应，对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术，是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。
氯金酸（HAuCl 4 ）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质等高分子的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。胶体金对蛋白质有很强的吸附功能，蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面，非共价键形成，标记后大分子物质活性不发生改变。金颗粒具有高电子密度的特性。金标蛋白在相应的配体处大量聚集时，在显微镜下可见黑褐色颗粒或肉眼可见红色或粉红色斑点。
胶体金免疫层析法（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术、单克隆抗体技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，具有简便、省时、样本用量少、结果易判读等特点，常在资源匮乏或非实验室环境中进行目标物的定性、半定量和定量检测。
胶体金免疫层析试纸条的构成见图1-4-15，其原理是采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，使抗原抗体反应，反应后根据膜上的颜色判断结果。GICA有3种反应模式：间接法、夹心法和竞争抑制法。
图1-4-15 胶体金免疫层析试纸条的构成
斑点免疫金渗滤法（dot-immunogold filtration assay，DIGFA）是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫金及洗涤液等试剂，并与硝酸纤维膜上的相应抗体或抗原发生反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的（一般5分钟左右完成），同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤目的，简化了操作步骤，达到简便的目的，成为“床边检验（point of care test，POCT）”主要方法之一。
斑点免疫金银染色法（Dot-IGS/IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。它将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，称为斑点免疫金染色法（Dot-IGS）。此反应可通过银显影液增强，即斑点免疫金银染色法（Dot-IGS/IGSS）。
免疫金电镜法是应用胶体金标记抗体，当金标记的抗体与抗原反应后，通过电镜可清晰地观察到具有很高电子密度的金颗粒。因此，免疫金电镜法可用于生物学的许多方面。
目前有三类商业化的胶体金免疫层析法检测试剂盒在临床应用：结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测试剂盒（胶体金法）、结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒（胶体金法）和结核分枝杆菌抗原MPT64检测试剂盒，该类产品的检测原理是应用间接胶体金免疫层析技术定性检测样品中的抗结核抗体，或应用双抗体夹心胶体金免疫层析技术定性检测样品中抗原。
目前有一类结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（斑点金免疫渗滤法）在临床应用。其将结核分枝杆菌特异性蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维素膜上，膜上结核分枝杆菌抗原捕获人血清样品中的抗结核抗体，被捕获的抗体再与胶体金标记的第二抗体结合，形成红色斑点，根据是否出现红色斑点即可判断阴、阳性结果，从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。
ELISPOT是应用ELISA原理建立的测定分泌特异性抗体或细胞因子的单个细胞对特异性抗原的应答能力及产生应答的细胞数量的方法，是一种在单细胞水平检测活细胞功能的酶联免疫新技术，具有灵敏度高的优点，比传统的ELISA方法高100～1000倍。
应用酶联免疫斑点技术检测IFN-γ的原理：结核分枝杆菌感染者外周血中存在结核特异的效应T淋巴细胞，在受到结核分枝杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-γ，被包被在板上的IFN-γ单克隆抗体所捕获；然后加入生物素标记的IFN-γ单克隆抗体作为检测抗体，再加入标记碱性磷酸酶（AKP）的链亲和素，加入底物BCIP/NBT溶液显色，在板底形成肉眼可见的深蓝色斑点。每一个斑点代表一个IFN-γ分泌细胞（结核特异的效应T细胞）。通过对斑点计数可以推测体内是否存在对结核分枝杆菌反应的效应T细胞，从而对结核分枝杆菌感染进行辅助诊断。
目前已应用ELISPOT技术研发了多个临床应用结核分枝杆菌感染检测试剂盒，如英国Oxford Immunotec公司研制的TSPOT-TB 结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验试剂盒是用ESAT-6、CFP-10合成多肽刺激外周血单个核细胞（PBMC）；ELISpotPLUS试剂盒是在TSPOT-TB试剂盒的基础上加入了Rv3879c抗原，使其检测灵敏度提高了4%。由解放军总医院第八医学中心和上海铭源数康生物芯片有限公司联合开发的结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒（FS-SPOT）是用ESAT-6和CFP-10 融合蛋白刺激PBMC，其敏感性和特异性与TSPOT-TB相似。ELISPOT方法需要提取PBMC，技术比较复杂，需要2天时间才能报告结果，主要用于临床的辅助诊断，不适用于大批人群的筛查。
应用ELISPOT方法检测IFN-γ阳性说明存在结核分枝杆菌感染，对结核病具有辅助诊断价值。ELISPOT IFN-γ斑点数越高，表示结核分枝杆菌感染的可能性越大。应用ELISPOT检测结核病患者IFN-γ的灵敏度约70%。接种BCG的健康人和大多数非结核分枝杆菌感染者对该抗原的刺激不反应，因此其特异性显著高于PPD皮肤试验，与应用ELISA方法检测IFN-γ相似。ELISPOT存在假阳性和假阴性问题。
化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是继放射免疫分析、酶联免疫分析和荧光免疫分析之后发展起来的一项新免疫分析技术，是将化学发光分析的高灵敏度与免疫反应的高特异性相结合的一种非放射标记免疫分析法，主要以标记发光剂为示踪物信号建立起来。1977年，Halman根据放射免疫分析的基本原理，将酶的化学发光与免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析方法。
化学发光免疫分析技术包含免疫分析和化学发光分析两个系统。免疫分析系统是用化学发光相关物质作为标记物标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物，然后对标记物进行检测，测定待检物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物。化学发光物质经氧化剂氧化或酶催化后，形成一个激发态的中间体，当这种中间体发射光子释放能量回到稳定的基态时，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。根据化学发光标记物与发光强度的关系，利用标准曲线计算出被测物的含量。
（1）标记免疫分析法：
以化学发光标记。
（2）酶免疫分析法：
以酶标记、以化学发光底物作为信号试剂来进行发光。
（1）化学发光免疫分析：
用化学发光剂直接标记抗体或抗原。
（2）化学发光酶免疫分析：
酶反应的底物是发光剂。
（3）电化学发光免疫分析：
由电化学反应引起的化学发光过程。
（1）微粒子化学发光免疫测定。
（2）磁颗粒化学发光免疫测定。
化学发光免疫分析具有高度的准确性、灵敏度和特异性，是目前公认的先进的标记免疫测定技术，是理想的体外诊断技术之一。化学发光免疫分析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛用于甲状腺激素、性腺激素、肿瘤标记物、心血管系统、贫血因子、糖尿病、病毒标记物、骨代谢、过敏性疾病、传染病和治疗药物监测等方面的体外诊断实验。近年来应用化学发光免疫测定法检测抗结核抗体或结核抗原，具有较高的灵敏度。
化学放光免疫分析保留了放射免疫的所有优点，同时克服了放射免疫和酶联免疫各自的缺点，是临床免疫检测理想的新方法。具有灵敏度高、特异性高、准确性高、试剂无放射性危险、安全稳定、线性较好、分离简便、快速、操作方便、光信号持续时间长、使用范围广、结果稳定、误差小、使用期长、已发展成自动化测定系统等优点。缺点是仪器价格比较昂贵，试剂成本较高，目前有些检测项目还不能用化学发光来检测。
流式细胞术（flow cytometry，FCM）又称流式细胞分析，是一种利用流式细胞仪在细胞分子水平对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测技术。它可以快速、准确、客观地同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项物理及生物学特性。流式细胞术是目前最先进的细胞定量分析技术。结核病的发生、发展和转归与机体的免疫状态密切相关。随着结核分枝杆菌感染免疫研究的不断发展，FCM在结核病相关临床检测和基础研究中得到越来越广泛的应用。
人外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达可分为3个群：T淋巴细胞（CD3 + ）、B淋巴细胞（CD19 + ）和NK细胞（CD3 - CD16 + CD56 + ）。T淋巴细胞又可以进一步分为辅助性/诱导性T淋巴细胞（CD3 + CD4 + CD8 - ）和细胞毒/抑制性T淋巴细胞（CD3 + CD8 + CD4 - ）。T淋巴细胞还可以分化出一类特殊的亚群NKT淋巴细胞（CD3 + CD56 + CD16 + ），它兼具NK细胞和T淋巴细胞的某些特点。目前国内许多医院在临床上常规开展FCM检测淋巴细胞亚群的项目，在结核病患者免疫状况评估、疗效监测和预后判断方面也积累了一定的数据。与健康人外周血淋巴细胞亚群绝对计数相比较，1/3～1/2的活动性结核病患者外周血中各淋巴细胞亚群绝对计数均显著降低，病情越严重，下降越明显。TB患者接受有效化疗后，若T淋巴细胞亚群绝对计数恢复正常，则患者疗效好、康复快、预后好；若T淋巴细胞亚群绝对计数不能恢复正常，则疗效差、病程长、预后差，且有反复发作的可能。
检测人外周血中淋巴细胞亚群所占淋巴细胞的相对比例及绝对计数，对受试者机体免疫状况进行评估。
采用荧光素标记的单克隆抗体流式细胞术检测细胞抗原的表达、细胞大小及细胞内颗粒，从而识别淋巴细胞不同亚群的含量。
（1）流式细胞仪。
（2）离心机。
（3）涡旋振荡器。
（4）移液器（20μl，100μl，1000μl）。
（5）抗凝采血管（EDTA抗凝或肝素抗凝）。
（6）Trucount tube（内含数量已知的微球）。
（7）6-color TBNK 试剂（CD3 FITC/CD16 + 56 PE/CD45 PerCP-Cy5.5/CD4 PE-Cy7/CD19 APC/CD8 APC-Cy7）。
（8）溶血素。
（9）去离子水。
（1）使用EDTA或肝素抗凝采血管采集静脉血2ml，采血管颠倒混匀6～8次。
（2）染色：取一支流式绝对计数管，加入6-color TBNK抗体全量20μl，然后再加入全血50μl，涡旋混匀，室温避光15分钟，为保证检测结果准确，加入全血时采用反向加样方法，注意不要碰到试管底部微球（Beads）。
（3）溶血素（10X）配制方法：溶血素进行10倍稀释（原倍的溶血素1∶去离子水9）。
（4）溶血：在流式上样管中加入450μl 配制好的溶血素（1X），涡旋混匀，室温避光15分钟。
（5）上机：检测，获取淋巴细胞5000个。
（6）数据分析：采用BD FACSDiva软件进行各个亚群分析，设置模板画门，分别圈出T细胞（CD3 + ）、辅助性T细胞（CD3 + CD4 + ）、杀伤抑制性T细胞（CD3 + CD8 + ）、NK细胞（CD3 - CD16 + CD56 + ）、B细胞（CD19 + ），并获取相对百分比，各亚群的绝对数通过下列公式获得。
（7）报告结果的参考范围：目前国内流式细胞术淋巴细胞亚群的参考范围以试剂及仪器厂家说明书居多，少数实验室自己确定，也有根据其他实验室参考范围确定的，然而参考范围尤其是绝对计数的参考范围不同仪器、不同年龄段及不同人群间存在差异。因此，各实验室需针对不同型号的仪器和不同厂家的试剂科学合理地建立淋巴细胞亚群结果的参考范围及评价体系，作为临床医生合理解释结果、判断患者免疫状况的标准。
在结核病的发生发展过程中，多种细胞因子参与了机体的免疫应答。流式细胞术可通过对某群特定免疫细胞及其细胞内的各种细胞因子区分标记，同时进行检测，从而精确定位不同免疫细胞和细胞因子在疾病发生发展过程中所扮演的角色及其相互作用关系。另外，采用流式细胞仪微球捕获芯片技术（cytometric bead array，CBA）可同时检测体液中数十种可溶性细胞因子的浓度，与传统的ELISA方法相比，该方法检测灵敏度高，大大提高了检测效率，节约了样本的用量和检测的工作量。
CBA系统利用流式细胞仪荧光检测灵敏度高的特点，通过微球表面免疫分析，达到检测可溶性蛋白的目的。在微球上包被捕获抗体，提供了类似ELISA包被微孔板的捕获表面，这样仅需很小体积的样本量，就可以用CBA捕获微球的混悬液检测多种可溶性蛋白，如检测人血清、血浆或培养上清液中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的浓度。目前还有可以自由组合的CBA Flex set，它改变了CBA试剂盒的固定形式，可以依据不同检测目的进行自由组合、灵活搭配。下面以人Th1/Th2/Th17 CBA kit检测试剂盒为例，介绍在Diva操作系统下检测方法。
（1）取标准品，用2ml分析稀释液（G）溶解，使之成为1X的标准品溶液，静置15分钟（注意：标准品不能涡旋）。
（2）在8个1.5ml EP管中分别加入300μl分析稀释液（G），并分别标记为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。
（3）取1X标准品溶液300μl，加入到1∶2号EP管中，充分混匀；换枪头，取1∶2标准品溶液300μl，加入到1∶4号EP管中，充分混匀；依此类推，直至1∶256稀释管，充分混匀（注意：要充分混匀，每稀释一次换一次枪头）。
（1）将7个捕获微球充分涡旋混匀。
（2）每个检测需要加入7个捕获微球各10μl，制成捕获微球混悬液。如检测9个样品，另计10个标准品，7个微球需要各加190μl的捕获微球。
（3）如果是血清或血浆标本，先离心混匀的捕获微球（300g、5分钟），轻轻吸出上清，加入等量的富集血清，充分混匀，待用。
（1）每个检测管加入50μl 充分混匀的捕获微球混悬液。
（2）每个检测管加入50μl的人Th1/Th2/Th17 PE 信号抗体（B）。
（3）每个检测管加入50μl的待检样品（血清或血浆应离心后取上清）或者标准品。
（4）室温避光孵育3小时。
（5）各管加入1ml 洗液（F），离心300g、5分钟。
（6）用加样枪缓慢吸出1ml上清。
（7）各管加入200μl洗液（F），重新悬浮微球。
（8）使用流式细胞仪分析样品，注意当日上机，上机前充分混匀。
（1）取流式管，加入50μl仪器调整微球及450μl洗液。
（2）建立一个新的实验模板（experiment），在参数list中选择FSC、SSC、PE、APC。
（3）新建一个散点图，横坐标为FSC、纵坐标为SSC，横、纵坐标均为Log值。在散点图的右上角新建一个矩形门，设为P1。调整FSC和SSC的电压，使微球落在P1门内。
（4）新建一个散点图，横坐标为PE，纵坐标为APC，横、纵坐标均为Log值。在P1门下新建两个门，分别为P2、P3。P2的位置大概在横坐标10 2 、纵坐标10 5 ，P3的位置大概在横坐标10 2 、纵坐标10 3 。
（5）打开PE-APC图的统计表，调节APC通道电压，使P2在APC上的平均值大约在70000；调节PE通道电压，使P3在PE上的平均值大约在75。
（6）新建一个直方图，APC为横坐标。
6.结果导出 将数据导成FSC格式，使用软件FCAP Array v3处理，生成最终数据。
淋巴细胞转化试验（lymphocyte transformation test，LTT）是评价细胞免疫能力的经典实验，主要用于体外检测T淋巴细胞的生物学功能，反映机体的细胞免疫水平。
T淋巴细胞在体外培养过程中，受有丝分裂原刺激，如刀豆素A或植物血凝素（PHA），代谢活跃，蛋白质、RNA和DNA的合成增加，从而转化为体积较大的母细胞，部分细胞发生有丝分裂，计数转化的细胞可反映机体的细胞免疫功能。检测方法可分为3H-TdR掺入法、形态学法和MTT法等。
淋巴细胞转化率=转化淋巴细胞/（转化淋巴细胞+未转化淋巴细胞）×100%，转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指成熟的小淋巴细胞，正常情况下，植物血凝素的淋巴细胞转化率为60%～80%，50%～60%为偏低，50%以下则为降低。
T淋巴细胞受PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，且伴随新的DNA合成，若此时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷3H-TdR，则3H-TdR可被淋巴细胞作为合成DNA的原料摄入，根据3H-TdR的摄入量，可判断细胞的增殖程度。培养细胞用液体闪烁仪测量，记录每分钟脉冲数（cpm），通过计算得出刺激指数（SI），以此表示转化能力。计算公式为：刺激指数（SI）=刺激管cpm均值/对照管cpm均值。
T淋巴细胞与有丝分裂原（PHA）或特异性抗原置37℃孵育72小时，淋巴细胞会发生一系列形态变化，如细胞体积增大、胞浆深染、胞核增大、染色质疏松、核仁明显等，此即为淋巴母细胞，然后通过显微镜计数，计算出淋巴母细胞的百分比。
MTT为淡黄色偶氮唑盐，活细胞特别是增殖细胞的线粒体脱氢酶活性增高，通过线粒体能量代谢过程，可将MTT代谢形成蓝紫色的甲臜沉积于细胞内或细胞周围，而且甲臜形成量与细胞增殖程度呈正相关，因此通过比色分析就能判断出淋巴细胞的增殖程度。计算公式为：刺激指数（SI）=刺激组吸光度（A）均值/对照管组吸光度（A）均值。
淋巴细胞转化与结核病患者的病情变化、病变范围和病情轻重相关。病情愈重，淋巴细胞转化率越低；随着病情好转，淋巴细胞转化率可逐渐上升，病情稳定淋巴细胞转化率接近正常。淋巴细胞转化反应测定可以反映机体细胞免疫功能状态，在判断结核病患者免疫水平和指导治疗上有一定意义。
细胞毒性指由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机制。细胞毒试验（cytotoxicity test）是一种检测效应细胞对靶细胞杀伤活性的试验。细胞介导的免疫反应（cell mediated immune，CMI）在机体抗感染及抗肿瘤免疫、移植排斥反应和自身免疫病中发挥重要的作用。CMI的主要效应细胞之一为CTL，测定CTL活性可以了解机体细胞免疫功能和探索疾病机制，其在医学基础与临床研究中日益受到重视。经典的CTL活性测定方法为 51 铬（Cr）释放法，该方法结果准确、重复性好，但也存在操作复杂、有安全隐患等不足之处。因此，近年来建立了多个可以替代 51 Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用荧光测定法、报告基因转染法和比色测定法等灵敏可靠、简单易行的非同位素测定法。
荧光测定法包括荧光扫描测定法、流式细胞分析法和树突状细胞（DC）清除法3种，荧光扫描测定法通过扫描测定活细胞代谢指示剂alamarBlue或胞浆荧光标记物Calcein-AM发出的荧光来检测效应细胞杀伤靶细胞的情况。流式细胞分析法通常使用PE-mAb/FITC-Annexin V荧光标记、DIOC18（3）/碘化丙锭（PI）荧光标记、PKH-26/CFSE荧光标记，用流式细胞仪区分并定量不同的细胞群，从而计算出效应细胞杀伤靶细胞的情况。
报告基因转染法应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）或荧光素酶（luciferase，luc）基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定CTL、NK细胞及药物介导的细胞毒性和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性（代表靶细胞死亡数目），可以计算效应细胞杀伤靶细胞的情况。比色测定法中常见的有下列3种：①MTT还原法：检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，中文化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐］还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪测定其光吸收值，在一定范围内其颜色深浅与活细胞数成正比。②MTS还原法：MTS是新一代四氮唑蓝盐化合物，其检测原理与MTT还原法相同，但操作步骤少一步，更简便。③乳酸脱氢酶（LDH）释放法：LDH在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞杀伤的百分比。本法操作简便快捷、自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒，下面以LDH释放法为例介绍结核分枝杆菌多肽体外刺激结核病患者产生特异性CTL活性的检测方法。
1.抽取患者外周血4～5ml，加入含肝素钠抗凝采血管，上下颠倒5～6次，使抗凝剂与血液混匀。
2.混匀的4ml抗凝外周血缓缓加入含4ml淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2500rpm离心20分钟。
3.加入预热至37℃的RPMI1640培养液8ml，用滴管轻轻吹打混悬后，于室温2000rpm 离心10分钟。
4.去上清液，加入预热至37℃的RPMI1640培养液至6ml，重悬沉淀细胞，于室温1500rpm 离心8分钟。
5.去上清洗液，加入0.25ml预热至37℃的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，用滴管轻轻吹打混悬细胞。
6.10 μl细胞悬液加入血细胞计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37℃的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释细胞悬液至1×10 6 /ml，250μl/孔置于96孔板中培养。
7.设置空白组（PBS）、阳性对照组（PHA）、实验组（多肽），第2天分别加入相对应的多肽25μg/ml，加入终浓度为50U/ml的重组人源IL-2（rhIL-2），于37℃、5% CO 2 培养箱中孵育。
8.每次刺激后3天进行半量换液，收集培养上清同时补加rhIL-2。每7天进行一次重复刺激，刺激过程：96孔板进行1000rpm离心5分钟，收集上清，加入新鲜的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，同时补加上述等量的相应多肽刺激物和rhIL-2。
9.完成3次刺激后，继续培养2～3天，收集细胞即作为效应CTL。
由于不同的靶细胞具有不同的乳酸脱氢酶含量，故必须进行靶细胞最佳浓度的优化实验。靶细胞的浓度至少为空白对照组吸光值2倍以上的浓度为最适靶细胞浓度。
将生长良好的T2细胞离心，用含5%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×10 6 /ml，铺于24孔板，2ml/孔，然后分别加入25μg/ml的阳性肽和各候选表位肽，阴性对照组加入等体积的PBS，置于37℃、5%CO 2 孵育4小时，离心洗涤后作为靶细胞。
空载或荷肽的T2细胞作为靶细胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为8×10 4 /ml，每孔加入50μl，再加入50μl不同浓度的效应细胞，使实验组形成不同的效靶比（分别为100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1）。同时设置以下对照组：靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、效应细胞自发释放组、背景对照组、体积校正对照组，各对照组设4个复孔，每孔总体积100μl。
（1）将96孔板置于37℃、5%CO 2 培养箱中培养4小时。
（2）孵育结束前45分钟，加入10μl 10X裂解液到靶细胞最大释放孔和体积校正孔中。
（3）培养结束后，离心培养板250g、4分钟。
（4）取出96孔板，每孔轻轻吸取50μl上清，置于另一新的96孔板对应孔中。
（5）全部转移结束后，每孔迅速加入50μl乳酸脱氧酶底物混合液，室温避光孵育30分钟。
（6）孵育结束后，每孔添加50μl终止液。
（7）30分钟内在酶标仪上读取490nm处的吸光度值，计算杀伤率。
杀伤率=（实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放）×100%。
（凌彦博 张俊仙 阳幼荣 梁 艳 白雪娟）