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结核分枝杆菌（MTB）感染机体肺泡巨噬细胞而后导致慢性肺结节炎症损伤，是复杂的生理和免疫过程，受MTB和宿主免疫系统的双重调控。MTB成分激活但又干扰早期肺泡固有免疫应答，使之无法有效杀菌；随后固有免疫细胞的TLR通路激活和APC抗原提呈，使DC向引流淋巴结迁移和对淋巴结内T、B细胞的免疫激活及肺内回迁显著滞后（约3周）；肺泡浸润巨噬细胞、T细胞等发生M2和Th2/Treg表型转化，促进MTB生长并放大炎症效应导致组织坏死损伤，而处于肉芽肿核心的MTB逃避免疫识别。抗结核免疫应答的表型偏离、活化不足和精准失常及调节性细胞和因子的干扰，是导致慢性结核病的根本原因。阐明抗结核免疫应答的免疫调节机制，给予特异性精准免疫干预，是预防、治疗肺结核的根本策略。
MTB感染过程中，多种免疫细胞因子、趋化因子、脂类小分子、MTB的胞壁成分和毒力因子以及宿主微小RNA分子网络等参与了对抗结核免疫的调节。
在MTB感染肺脏导致病理过程中，TGFβ和IL-10是研究最为充分的关键负调控细胞因子。活动性结核病患者常伴随外周血或肺局部TGFβ和IL-10水平升高，尤其是慢性肺结核患者局部TGFβ显著增高，且该增高与MTB再激活及病理损伤呈正相关。TGFβ和IL-10的调节共性是抑制全身或局部巨噬细胞吞噬杀菌效应激活并抑制抗菌Th1应答的诱导，从而抑制抗菌免疫应答。TNFα和IFNγ作为激活巨噬细胞的关键细胞因子和活化巨噬细胞和Th1的效应因子，受到TGFβ和IL-10的显著调控。
TGFβ是Tregs的主要效应因子，其生理情况下在组织感染或损伤后期启动组织修复和纤维化过程，而在慢性感染情况下活性TGFβ则通过下调巨噬细胞表面的吞噬受体抑制吞噬杀菌（抑制效率高达50%以上）、促进CD4 + T细胞的凋亡并抑制CD8 + T细胞的杀伤功能、从而抑制IFNγ分泌等机制，抑制对清除MTB十分关键的巨噬细胞吞噬杀菌效应和Th1应答（图1-4-11）。
IL-10是由Treg、Breg、巨噬细胞及中性粒细胞等调节性免疫细胞分泌的负调控细胞因子，可抑制DC活化及IL-12分泌、抗原提呈、多种细胞因子趋化因子释放、巨噬细胞吞噬小体成熟、Th1诱生及抗结核效应。MTB感染中，巨噬细胞是IL-10的主要分泌细胞，抑制抗菌免疫、巨噬细胞凋亡并可限制肺组织病理损伤。石蟹猴MTB感染研究显示：肺内肉芽肿结节病灶及其中MTB载量受IL-10及TNFα、IFNγ的严密调控。首先，缺失TNFα和IFNγ使感染200天后菌落载量显著增高约3个数量级，缺失IFNγ MTB生长更多且结节干酪坏死更为显著。而敲除IL-10，则使感染200天后肺结节MTB载量降低2倍，无菌结节数增高2倍；在感染0/25/50天后分别中和清除外周IL-10，发现清除IL-10出现的MTB减少、无菌结节数增多现象仅在感染25天后去除IL-10才显著，感染75天后再清除IL-10则无效。进一步研究发现，IL-10的主要分泌细胞为活化巨噬细胞，敲除IL-10伴随早期结节TNFα水平增高、激活NF-кB通路分泌NO的巨噬细胞比例增加和干酪样坏死增加。人为上调结节内IL-10水平可显著增多结节MTB载量，反之亦然。感染200天的结节MTB载量与IL-10水平呈正相关；而感染早期35天左右TNFα水平与IL-10呈负相关。提示IL-10具有感染早期抑制固有免疫抗菌免疫（TNFα）、限制结节干酪坏死从而增加MTB生长的关键调节功能。
图1-4-11 结核分枝杆菌感染过程中TGFβ对抗结核免疫应答的多重调节
小鼠MTB感染研究同时比较了TGFβ和IL-10对抗结核免疫的调节功能：MTB感染小鼠后其肺结节MTB载量在第30天达高峰，第50天显著降至较低水平持续至第200天（150/结节）；单纯敲除IL-10基因，第200天的载量显著降至60/结节；而敲除TGFβ基因进一步降至40/结节；同时敲除两种细胞因子，则细菌载量几乎为0，同时无菌结节数增至98%（WT小鼠约55%）。小鼠感染200天后再以中和单抗去除体内TGFβ和IL-10，呈现相似结果。机制研究发现，虽然巨噬细胞杀菌是清除MTB的主要效应，CTL/Th1效应次之，但在MTB天然感染情况下，TGFβ（而非IL-10）强烈抑制了CTL诱导及杀菌效应而不影响巨噬细胞杀菌效应；敲除TGFβ通过显著上调CTL/Th1激活和杀菌效应显著抑制MTB载量；IL-10则主要调节巨噬细胞杀菌功能。提示TGFβ和IL-10是清除MTB免疫应答的关键限制因子，TGFβ主要靶向杀伤性CTL的激活与杀伤效应，IL-10靶向巨噬细胞杀菌并协同TGFβ进一步抑制杀菌效应。提示慢性肺结核治疗应考虑以激活杀菌性CTL为补充策略。
TGFβ主要由巨噬细胞和Treg分泌，TGFβ前体由巨噬细胞分泌的TNFa活化为活性TGFβ。TGFβ抑制多种T细胞增殖，抑制CTL对感染结核分枝杆菌巨噬细胞的杀伤，抑制巨噬细胞吞噬杀灭结核分枝杆菌，抑制Th1分泌IFNγ和巨噬细胞分泌TNFα，而Th1分泌的IFNγ可抑制TGFβ的分泌。
微小RNA（microRNA，miRNA）是小的、非编码RNA分子家族成员，通过靶向众多编码蛋白的信使RNA（mRNA）分子的3′UTR、抑制相关分子转录或直接降解mRNA、在转录后正/负向调控相关蛋白表达，从而在细胞信号转导、分化、增殖、凋亡等多方面发挥广泛调控作用。miRNA最初转录为初始miRNA，经Drosha/Dgcr8复合物剪切后成为前体茎环结构pre-miRNA，pre-miRNA进入胞质经 Dicer复合物处理为成熟miRNA。后者通过与 Argonaute 蛋白等形成 RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），结合于靶 mRNA 的3′UTR 端，降解或转录抑制靶 mRNA，调控众多基因的转录表达。人类基因组存在超过1000种 miRNA，通过靶向细胞因子等，miRNA可对众多免疫细胞的功能进行调节，发挥免疫抑制功能。miRNA调节网络成为结核病等重大炎症性疾病治疗的重要靶点。
首先，在人类和动物MTB感染模型中发现，众多差异表达的miRNA个体和谱系成为区分结核潜伏感染、活动性肺结核的分子标志物。如以H 37 Rv毒株和减毒BCG分别感染人原代巨噬细胞，发现具有抗炎和调控脂类代谢功能的miR-222、miR-27a、miR-27b表达在毒株感染后显著下调，有助于诱导凋亡的miR-145表达也显著下调，且与H 37 Rv毒株诱导巨噬细胞凋亡能力减弱相一致。而针对活动性肺结核与结核潜伏感染人群的miRNA研究发现：相对健康人和潜伏感染人群，活动性肺结核患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）显著上调miR-424、miR-365、miR500、miR450b-5p、miR-144等表达，其中，miR-144表达于T细胞且抑制T细胞增殖、抑制活化T细胞分泌TNFα和IFNγ。近期人外周血或PBMCs高通量miRNA的检测发现，小儿结核病患者巨噬细胞内miR-31显著降低，可区分结核病患者与健康人；外周血miR-let-7e、miR-192、miR-25、miR-451适用于区分MTB感染；而对300余名各类结核病患者的miRNA分析发现：let-7e、miR-146a、miR-148a、miR-16、miR-192、miR-193a-5p、miR-25、miR-365、miR-451、miR-532-5p、miR-590-5p、miR-660、miR-885-5p、miR-223、miR-30e这15个miRNA适用于区分健康与活动性肺结核患者，诊断准确率82%。
其次，miRNA通过转录后调控一系列免疫细胞功能基因的表达，显著调控了机体抗结核免疫应答特别是固有免疫应答。如miR-125b在人肺泡巨噬细胞内抑制TNFα合成；miR-9b抑制局部促炎细胞因子分泌；miR-23a-5p通过抑制巨噬细胞自噬促进MTB生长；miR20a、miR33、miR155等也具有调控巨噬细胞自噬功能；miR-29可显著调控IFNγ应答从而调控抗结核免疫；miR-146a可抑制巨噬细胞NO合成；miR29a、miR155等可调控巨噬细胞凋亡；miR-155还抑制NK细胞介导的杀菌功能（图1-4-12）。
体内导入miRNA或anti-miRNA，定向靶向关键抗结核靶分子，有助于促进抗结核免疫、降低免疫损伤、实现对活动性肺结核的免疫治疗。近年已在结核病动物模型内进行了可喜的尝试。如感染MTB 2个月的慢性感染小鼠，经高压微喷雾装置给予5μg的靶向负调因子TGFβ的siRNA共 3次，发现末次给药5天后可有效下调肺内约65% TGFβ mRNA；相应的，肺内TNFα蛋白水平上调65%而IFNγ则有一定下调；由于TNFα和IFNγ协同促进抗结核因子iNOS和NO等反应氮中间物（RNI）合成，进一步发现靶向TGFβ可显著增多30% NO合成；最终在4周后显著降低肺MTB载量以及肺纤维化程度；而联合IL-10敲除手段可进一步降低肺内MTB载量。在另一项前期研究中，以天然靶向CD44（巨噬细胞高表达）的透明质酸-PEI纳米复合物载体与miR-223或miR-223编码质粒pmiR-233复合形成HA-PEI/miR-223 纳米颗粒（NPs），以200nmol/L浓度转染巨噬细胞，证实24～48小时内HA-PEI/miR-223 NPs可诱导200～1600倍miR-223的转录表达；更重要的是，显著诱导了巨噬细胞由iNOS+M1向Arg-1 + M2表型的转化，且显著抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和 IL-6的分泌。在H 37 Rv慢性感染肺结核小鼠体内，静脉直接注射miR-20b类似物（30mg/kg）发现，通过抑制肺内NLRP3通路介导的IL-1β分泌，可显著减轻肺脏炎症损伤病理。
图1-4-12 miRNA网络对巨噬细胞自噬和凋亡行为的调控
综上，以不同载体和导入体系实施体内miRNA的补充或抑制，有望在动物和人体试验中获得可喜的抗结核结果。
众多miRNA参与对MTB感染肺泡巨噬细胞后自噬、凋亡、吞噬杀菌的调节。如miR-125-3p、miR-33等通过不同机制抑制自噬的发生；而miR-155、miR-17-5p通过靶向Rheb、Mcl-1/STAT3发挥对自噬的正向调节。miR-155同时通过抑制FOXO3，抑制凋亡的发生。
多种调节性免疫细胞在MTB感染和病理损伤的不同阶段发挥重要的免疫调控作用，阐明相关细胞的免疫调控机制，予以靶向性干预，已在动物体内获得有效的治疗效果。
中性粒细胞（neutrophil）又称多形核细胞（polymorph nuclear cells，PMNs），是人外周血白细胞最为丰富的免疫细胞，是外周循环监视感染/损伤发生的先头兵，特别在细菌感染早期通过直接吞噬杀菌和调节巨噬细胞功能发挥重要抗菌作用，然而其组织盘踞和强大炎症功能又可导致组织损伤。MTB感染肺泡巨噬细胞后，经由IL-8/CXCR1/2/5迅速趋引至感染局部，成为患者肺泡灌洗液及痰液最富集免疫细胞。中性粒细胞是MTB感染早期除肺泡巨噬细胞外最重要的吞噬杀菌细胞，通过其分泌的弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、抗菌肽等裂解细菌，且其吞噬指数高于肺泡巨噬细胞；然而研究也发现：初始肉芽肿结节的坏死核心形成与中性粒细胞诱导的巨噬细胞/血管内皮细胞坏死相关，活动性肺结核患者以及MTB易感小鼠（C3HeB/FeJ）的坏死性肺部病理与肺部S100A8/9 + 中性粒细胞的浸润程度呈正相关。适度清除中性粒细胞有助于减轻肺部病理。具有抗MTB生长的自噬与NO，均可负调控中性粒细胞的肺部浸润，提示小鼠或人类活动性肺结核期间中性粒细胞肺部浸润发挥了促炎促损伤作用，中性粒细胞过度浸润是肉芽肿发生中心坏死和液化、结核潜伏感染进展为活动性肺结核的关键。已产生严重结核病的C3HeB小鼠，以布洛芬等制剂通过抑制前列腺素、CXCL5等强中性粒细胞驱动剂分泌，可显著减少MTB感染后的中性粒细胞肺部浸润和肺坏死病理损伤。
中性粒细胞不仅可直接吞噬杀菌，更重要的是，中性粒细胞吞噬不同毒力MTB后分别诱导的坏死或凋亡性中性粒细胞，被后续浸润的巨噬细胞所吞噬，从而发挥调节巨噬细胞表型及功能的重要作用。研究发现，健康人外周血中性粒细胞，在感染MTB毒株后，很快诱导坏死性细胞死亡；而ESAT-6毒力基因缺失的MTB，因缺失功能性分泌系统ESX1，不再诱导中性粒细胞坏死，而诱导其凋亡。以坏死或凋亡的感染MTB的中性粒细胞再与单核来源巨噬细胞共孵育，发现健康巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞后可有效清除其中的MTB，而吞噬坏死中性粒细胞则无法控制MTB，反而诱导自身坏死（图1-4-13）。基于中性粒细胞早期快速组织募集和强吞噬能力特点，提示早期遭遇MTB的中性粒细胞的坏死性死亡，将显著影响后续浸润巨噬细胞的表型和特性，最终促进组织局部坏死和MTB生长播散。
近期以人外周血PBMC感染MTB研究中性粒细胞的杀菌功能发现，清除外周血活性中性粒细胞与清除CD4 + /CD8 + T细胞相比，更为显著降低了感染4天的杀菌功能，提示中性粒细胞的抗MTB功能；外源加入活性中性粒细胞同样促进杀菌；而加热60℃休克而坏死中性粒细胞则抑制杀菌效果；机制研究发现坏死中性粒细胞通过显著抑制外周血TNFα、IL-1β分泌而上调外周血IL-10、G-CSF分泌，从而抑制各类吞噬细胞对MTB的吞噬。提示不同状态、表型的中性粒细胞在MTB感染中既发挥正向也发挥负向调节功能。
中性粒细胞还被发现是MTB感染中IL-10的主要分泌细胞之一。近期研究发现，局部感染MTB的DC分泌CXCL1/2趋引大量中性粒细胞快速浸润肺泡局部，后者与感染DC相互作用而后分泌大量IL-10，IL-10经IL-10R显著抑制CD4 + Th17应答而不影响IFNγ+Th1应答，发挥限制过度Th17应答功能。转录组研究发现，活动性肺结核患者外周血中性粒细胞表面上调表达的PD-L1是诱导外周T细胞上调表达抑制性PD-1的主要诱因。提示中性粒细胞可能在肺结核发生发展特定过程中发挥负调控功能。
综上，人类和小鼠结核病研究均提示，过度的或特殊形态的中性粒细胞浸润与过度肺部炎症及细胞坏死介导的免疫损伤、活动性肺结核发病相关。清除炎症损伤相关的中性粒细胞或改变其表型特征，有助于减轻肺部病理性炎症损伤。在抗生素治疗之外，干预中性粒细胞的坏死性死亡，有助于减少巨噬细胞坏死，恢复局部抗菌免疫，成为宿主导向的结核病治疗的新靶点。
图1-4-13 结核分枝杆菌感染时中性粒细胞坏死所诱导的巨噬细胞恶性坏死循环
肺局部早期趋引的中性粒细胞可有效吞噬MTB、ESX-1、ROS等毒力相关因子，使中性粒细胞发生坏死，后续吞噬处理坏死中性粒细胞的巨噬细胞不仅无法清除MTB，自身也诱导坏死，MTB由坏死细胞释放，加剧组织坏死性损伤和细菌播散。
Tregs是一大类具有免疫调节功能的T细胞，包括IL-10 + Tr1、TGFβ + Treg、CD8 + Treg等亚群。活动性肺结核患者PBMC经PPD抗原刺激后，与健康人对比，其CD25、CD4 + CD25 + 分子表达水平、CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg的比例均显著增高，而IL-17A和Th17比例显著降低。在抗结核药物治疗6个月后，PBMC中CD25、CD4 + CD25 + 分子水平和CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg/CD4 + CD127 + Treg的比例均显著降低，提示CD25和Treg比例可作为结核病治疗终点分子标志。耐多药结核病患者PBMC以ESAT-6抗原刺激，与药物敏感活动性肺结核患者相比，其分化的IFNγ + Th1比例显著降低，而CD4 + CD25 + Treg、IL-10 + Treg比例显著增高，体外纯化该Treg可通过IL-10、TGFβ和CTLA-4显著抑制巨噬细胞对MTB的吞噬杀菌和T细胞增殖。儿童肺结核患者与健康儿童相比，也证实PBMC内CD4 + CD25 + CD39 + FOXP3 + Treg及其分泌的IL-10显著增高，而分泌的促炎因子IL-1β、TNF-α显著降低。提示FoxP3 + Treg在MTB感染早期大量扩增，从而有效抑制抗结核免疫、促进慢性结核病发展。临床应用免疫抑制剂——TNF通路阻断剂（如英夫利昔单抗）治疗自身免疫患者时，发现通过抑制IFNγ + Th1、促进Th17分化和上调Tregs应答可显著增加结核潜伏感染者体内MTB再激活、发展为肺结核的概率，再次提示Tregs对结核病进展的重要调控意义。
Tregs应答的诱导和效应在结核病进展中发挥关键负调控作用毋庸置疑，然而是否可以采用抑制Tregs手段实现像肿瘤免疫治疗中anti-PD1/anti-CTLA4等Tregs抑制策略的良好效果，还有待进一步研究。与肿瘤不同，肺结核的肺损伤很大一部分来自过度的局部炎症效应，如清除Tregs，炎症损伤效应失调控可能产生更为严重的肺损伤。如H 37 Rv感染PD-1敲除小鼠，产生了感染加剧和肺炎损伤加重。因此，未来还需要更为精准地明确与结核病进程严密相关的Treg亚群和可使患者受益的Treg靶向亚群。
除早期中性粒细胞和巨噬细胞吞噬杀菌应答，抗结核免疫应答必需IFNγ + Th1应答和CD8 + CTL应答的诱导，最终清除感染巨噬细胞，而CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的激活依赖宿主的MHCⅡ和MHCⅠ类分子对于MTB抗原的正确和高效提呈。除经典MHC抗原提呈，近期研究还证实：非经典MHCⅠb分子-HLA-E（小鼠Qa-1）在MTB气雾感染小鼠体内提呈MTB抗原激活CD8 + T细胞应答，发挥关键的保护功能；Qa-1敲除小鼠感染后MTB载量显著增高、表达抑制性或凋亡性分子的CD94/NKG2A + 、PD-1 + 、Fas-L + 和CTLA-4 + T细胞比例增加（杀菌效应减弱），易感性和死亡率显著增加。从上述层面，抗结核免疫受宿主MHC多态性的整体和群体水平调节。一方面，缘于不同个体MHC对MTB抗原的提呈和对T细胞应答的激活显著不同，不同MHC多态性群体对MTB的易感性显著不同；另一方面，MTB通过多种MHC抑制机制抑制T细胞应答的激活。如MTB毒株可抑制吞噬体-溶酶体融合、自噬体形成和抑制MHCⅡ-抗原肽分子向膜表面的转运显著抑制MHCⅡ依赖的CD4 + T细胞激活。新近研究发现MTB的优势TB10.4抗原类似于诱饵，其激活并改变其特异性CD8 + T细胞活性，无法识别MTB感染的巨噬细胞，也无法杀伤清除感染巨噬细胞。TB10.4调控的MHCⅠ介导的CD8 + T细胞应答的无能，一定程度解释了临床中相对CD4 + T细胞应答、CD8 + T细胞对抗结核免疫保护的低贡献现象。而新型疫苗抗原的选择和疫苗剂型改良，必须同时考虑结核抗原对特定群体MHCⅡ/MHCⅠ/MHCⅠb等的结合适配性、与抗原-MHC复合物对特定人群CD4 + T细胞/CD8 + T细胞激活的充分和全面性。
基于上述多种调节性免疫细胞、调节性细胞因子参与结核病发生发展的调节，多种免疫分子相关基因和MHC基因多态性格局与活动性结核发病相关联。Toll样受体中的TLR2是识别MTB的关键TLR， TLR2 基因的Arg753Gln多态性是活动性肺结核的高危因素，而Arg677Trp则不是。 IFN-γ + 874 A/T（TT具有保护性，而TA/AA具有显著易感性）与结核病进展正相关。 IL-6-174 G/C 多态性则与亚洲人MTB不易感性相关。 IL-17 （-152A/G）AG/AA 基因型则显著区分结核病患者与健康人。又如 IL-10 -1082 G/A 多态性与欧洲人MTB易感性正相关，而 IL-10-819 C/T 和 IL-10-592 A/C多态性与亚洲人MTB易感性正相关。Treg细胞表面标志的 FoxP3 基因启动子区-924 A ＞ G 多态性与 FoxP3 上调表达和MTB易感性正相关。
综上，在结核分枝杆菌复杂的慢性感染过程中，抗感染免疫应答的诱导、效应发挥和过度免疫炎症导致的组织损伤，均受宿主多种多样的免疫细胞和免疫分子的免疫调控，也在群体层面和基因层面受相关基因的密切调控。充分了解结核病发生发展的免疫调控机制，在抗结核治疗及预防性疫苗应用同时，采取靶向干预特定调节细胞或分子，可有效增强抗结核预防治疗效果，同时降低组织免疫病理损伤。
（徐 薇）